電針對腦缺血大鼠前扣帶皮質(zhì)HMGB1和p-JNK蛋白表達的影響*

聶澤銀,李晨妤,陳家樂,繆化春,吳 鋒

(皖南醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,安徽蕪湖 241002)

前扣帶皮質(zhì)是指大腦扣帶回前半部分的皮質(zhì)區(qū)域,易受到創(chuàng)傷性腦損傷、神經(jīng)退行性疾病等的影響[1-2]。腦卒中是當(dāng)今全球第二大死亡原因,發(fā)病原因主要是由于腦血管被血栓或栓子堵塞,其中缺血性腦卒中比腦實質(zhì)或蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的出血性腦卒中更為常見[3]。目前,有關(guān)缺血性腦卒中對前扣帶皮質(zhì)區(qū)域影響的報道甚少。電針現(xiàn)已廣泛運用到臨床以改善腦卒中患者的神經(jīng)功能和生活質(zhì)量。“百會”穴(GV20)和“足三里”穴(ST36)是電針治療腦缺血常選的2個穴位,可以改善認知、感覺和運動等神經(jīng)功能障礙[4-5]。既往研究表明,電針對于缺血性腦卒中的治療具有確切療效,但其具體機制尚不完全清楚。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1,HMGB1)是一種非組蛋白DNA結(jié)合核蛋白,參與核小體的穩(wěn)定和基因轉(zhuǎn)錄,當(dāng)從組織的壞死細胞釋放至胞外可加速炎癥的級聯(lián)反應(yīng),從而加快疾病的進展[6]。磷酸化的c-Jun氨基酸末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)是HMGB1的下游通路,不僅參與凋亡途徑,也參與細胞的調(diào)節(jié)機制[7]。本研究通過檢測前扣帶皮質(zhì)組織形態(tài)學(xué)變化及HMGB1和p-JNK蛋白的表達情況,旨在從調(diào)控HMGB1和p-JNK的角度探討電針對腦缺血大鼠前扣帶皮質(zhì)的神經(jīng)保護作用及可能的潛在機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 成年雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(230±20)g,購自南京青龍山動物實驗中心,許可證號:SCXK(浙)2019-0002,隨機分為假手術(shù)組、模型組、電針組和假電針組,6只/組。所有動物實驗程序均符合皖南醫(yī)學(xué)院實驗動物福利與倫理委員會的指導(dǎo)原則。

1.2主要儀器及試劑 拴線(北京西濃科技有限公司),電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司),石蠟切片機(德國Leica公司),Nissl染色液(Leagene生物技術(shù)有限公司),HMGB1一抗(Abcam公司),p-JNK一抗(Cell Signaling Technology公司)。

1.3模型制備及篩選 參照Longa等[8]的方法制備永久性腦缺血大鼠模型,大鼠術(shù)前12 h常規(guī)禁食但不禁水,經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉,常規(guī)消毒后,依次進行頸正中切口及分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,分離過程中注意避免損傷迷走神經(jīng)。在頸外動脈上剪一小口,使拴線由頸外動脈進入頸內(nèi)動脈,固定好拴線后縫合切口,手術(shù)過程中保持大鼠體溫在37 ℃。假手術(shù)組僅分離出右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈,不插入栓線。參照Longa評分標(biāo)準(zhǔn),對大鼠術(shù)后2 h進行神經(jīng)功能缺損評分。評分細則為∶0分∶無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分∶對側(cè)前爪不能完全伸直;2分∶行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈;3分∶行走時向?qū)?cè)傾倒;4分∶不能自發(fā)行走,并伴有不同程度的意識障礙。大鼠評分1～3分視為造模成功,納入本次實驗。

1.4干預(yù)方法 電針治療過程使用一次性無菌針灸針,電針組選取“百會”穴(頂骨正中,向后斜刺2 mm)和左側(cè)“足三里”穴(膝關(guān)節(jié)下方,腓骨小頭下約5 mm處,直刺7 mm),連接電針儀,頻率為2 Hz/10 Hz的疏密波,電流為1 mA,電針持續(xù)時間為30 min,1次/d,持續(xù)14 d。假電針組僅刺入“百會”、左側(cè)“足三里”穴皮下,接電針儀但不通電[9]。另在第1、3、7、14天對各組大鼠進行Longa評分,以評估電針刺激后神經(jīng)缺損功能有無恢復(fù)。

1.5Nissl染色 采用Nissl染色觀察各組大鼠前扣帶皮質(zhì)區(qū)的神經(jīng)元密度。在干預(yù)實驗結(jié)束后,各組大鼠麻醉后用4%多聚甲醛灌注,取腦后固定,石蠟包埋,切片,片厚5 μm。切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟后用Nissl染色試劑盒染色,先入Cresyl Violet Stain中,在56 ℃恒溫箱中浸染1 h,雙蒸水沖洗后入Nissl Differentiation分化30 s,中性樹膠封片,400倍鏡下拍片后用Image J軟件統(tǒng)計分析神經(jīng)元的數(shù)量。

1.6免疫組織化學(xué)染色 切片脫蠟后滴加1% Triton X-100以增加細胞膜的滲透性。滴加3%過氧化氫浸泡30 min,枸櫞酸緩沖液修復(fù)。加入5%牛血清蛋白溶液封閉2 h,滴加HMGB1(1∶200),p-JNK(1∶100),4 ℃過夜。次日復(fù)溫后滴加二抗,孵育30 min,DAB顯色,二甲苯透明,中性樹膠封片。400倍鏡下拍照后,采用Image J軟件測定HMGB1和p-JNK免疫反應(yīng)陽性細胞的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果 假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損癥狀,模型組與假電針組大鼠在術(shù)后的2 h、1 d、3 d、7 d和14 d的神經(jīng)功能缺損評分均高于假手術(shù)組(P<0.01),假電針組與模型組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與模型組相比,電針組大鼠在腦缺血第7天、14天神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較

2.2各組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)Nissl染色結(jié)果 假手術(shù)組前扣帶皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元分布較密集,其結(jié)構(gòu)清晰完整,胞核可見。與假手術(shù)組相比,模型組和假電針組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量均明顯減少(P<0.01);與模型組相比,電針組右側(cè)前扣帶皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.01),而假電針組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)Nissl染色結(jié)果

2.3各組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)HMGB1和p-JNK表達結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,各組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)區(qū)均有HMGB1和p-JNK免疫陽性細胞的表達。HMGB1和p-JNK的陽性細胞胞漿和胞膜大部分染色,呈棕黃色。與假手術(shù)組比較,模型組和假電針組右側(cè)前扣帶皮質(zhì)區(qū)HMGB1和p-JNK陽性細胞數(shù)量均明顯增加(P<0.01)。與模型組比較,電針組右側(cè)前扣帶皮質(zhì)區(qū)HMGB1和p-JNK陽性細胞數(shù)量均明顯減少(P<0.01),而假電針組HMGB1和p-JNK陽性細胞的數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、圖4。

圖3 各組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)HMGB1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

圖4 各組大鼠右側(cè)前扣帶皮質(zhì)p-JNK免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

3 討論

前扣帶皮質(zhì)與額葉皮質(zhì)聯(lián)系密切,且能夠?qū)ζ渌X區(qū)進行適當(dāng)控制,與情緒、工作能力和社會行為等有關(guān)[1-2],在急性和慢性疼痛中均可被激活,可能導(dǎo)致疼痛相關(guān)的焦慮[10],而腦缺血也常伴隨焦慮樣行為[11]。有研究運用Nissl染色觀察腦缺血后額葉皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)變化,結(jié)果顯示腦缺血大鼠缺血側(cè)額葉皮質(zhì)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,胞體萎縮,呈空泡樣變等現(xiàn)象,說明腦缺血可導(dǎo)致額葉皮質(zhì)的神經(jīng)元出現(xiàn)損傷[12]。本實驗Nissl染色結(jié)果顯示,模型組大鼠缺血側(cè)前扣帶皮質(zhì)神經(jīng)元排列疏松散亂,神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,表明腦缺血也可導(dǎo)致前扣帶皮質(zhì)的神經(jīng)元受損。

近年來,有研究認為HMGB1和p-JNK可能是腦血管疾病病理生理過程中的關(guān)鍵分子[6-7],尚不清楚HMGB1和p-JNK是否參與腦缺血導(dǎo)致前扣帶皮質(zhì)損傷的發(fā)生過程。研究報道HMGB1可調(diào)節(jié)細胞凋亡和氧化應(yīng)激等多種病理生理過程,參與介導(dǎo)腦缺血損傷,腦損傷后大量HMGB1從細胞核分泌到細胞外,破壞血腦屏障,使腦組織出現(xiàn)繼發(fā)性損傷,導(dǎo)致缺血后的腦細胞水腫、凋亡及壞死等[13]。既往有研究表明,HMGB1在阿爾茲海默病、帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演著重要角色,HMGB1可作為記憶障礙、慢性神經(jīng)退行性變和神經(jīng)炎癥進展的危險因素[14-15],也有研究認為,HMGB1由壞死細胞被動釋放,抑制HMGB1途徑的激活提供神經(jīng)保護作用[16],提示抑制HMGB1的激活可作為腦缺血損傷的潛在治療靶點。另有研究表明,腦缺血導(dǎo)致壞死性腦細胞凋亡,引起感覺和運動缺陷,而抑制p-JNK的表達則可對腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元起到保護作用[17],這提示p-JNK也是缺血性腦損傷治療的又一有效靶點。本實驗結(jié)果顯示,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯高于假手術(shù)組,缺血側(cè)前扣帶皮質(zhì)HMGB1和p-JNK陽性細胞表達也明顯高于假手術(shù)組,結(jié)合Nissl染色結(jié)果提示,腦缺血后前扣帶皮質(zhì)中HMGB1和p-JNK過表達可能是導(dǎo)致其損傷的重要因素,因此抑制或下調(diào)腦缺血后HMGB1和p-JNK過表達可能是治療缺血性腦損傷的有效策略。

目前臨床上對腦缺血的治療由于治療窗很窄(一般不超過6 h),在實際應(yīng)用中受到較大限制[18]。電針廣泛應(yīng)用于卒中等疾病的臨床治療,其療效已得到肯定,但其機制尚不完全清楚,仍在不斷研究中。有研究表明,電針通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同機制,對缺血性中風(fēng)發(fā)揮有益作用,其機制涉及抗腦缺血區(qū)的細胞凋亡、恢復(fù)性調(diào)節(jié)腦缺血區(qū)的腦血流量及神經(jīng)化學(xué)物質(zhì),促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生和細胞增殖,改善中風(fēng)后受損的長時程增強和記憶力等[19]。GV20和ST36是治療卒中的臨床和實驗動物研究中常用的穴位,中醫(yī)理論認為GV20屬于督脈,聚陽氣,刺激GV20后,可為身體提供能量;ST36是胃經(jīng)穴之一,富氣血,刺激ST36,活氣血,可調(diào)節(jié)機體的整體功能[20],這也是本文電針治療時穴位選取的主要依據(jù)。本實驗染色結(jié)果顯示,電針刺激GV20和ST36可明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀,減緩腦缺血導(dǎo)致的前扣帶皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷,并且明顯下調(diào)前扣帶皮質(zhì)區(qū)HMGB1和p-JNK蛋白的異常高表達。據(jù)此推測,電針減輕腦缺血導(dǎo)致的前扣帶皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷可能與抑制HMGB1和p-JNK過表達密切相關(guān)。

綜上所述,電針可能通過抑制腦缺血大鼠前扣帶皮質(zhì)中HMGB1和p-JNK蛋白的過表達,以減輕神經(jīng)元的損傷,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究為闡明臨床應(yīng)用電針治療缺血性腦損傷的潛在機制提供了一定的形態(tài)學(xué)依據(jù)與新的理論解釋。然而,腦卒中后不同損傷機制可互相影響,電針可調(diào)節(jié)多種信號通路,對卒中起到治療作用,其是否能同時調(diào)節(jié)HMGB1、p-JNK及其他通路以發(fā)揮增效作用,還值得進一步研究。