脂肪因子Chemerin調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞系遷移及侵襲能力的機(jī)制研究*

王 彬,曹登義,王遠(yuǎn)鵬,李乃樹,崔皖晉

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院,安徽蚌埠 233030)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道惡性腫瘤。2020年IARC發(fā)布的對全球185個(gè)國家/地區(qū)估計(jì)數(shù)據(jù)顯示,CRC新發(fā)例數(shù)與死亡例數(shù)分別居第3位與第2位,結(jié)腸癌與直腸癌新發(fā)例數(shù)分別占6.0%與3.8%[1]。明確發(fā)病機(jī)制、開發(fā)敏感的標(biāo)志物輔助早期診斷與治療是近年惡性腫瘤研究的重要方向。高脂飲食、肥胖是CRC的重要危險(xiǎn)因素[2-3]。脂肪組織是人體最大的內(nèi)分泌器官,可通過分泌多種蛋白質(zhì)參與代謝調(diào)控,這類蛋白質(zhì)即為脂肪因子。近年研究顯示,脂肪因子及其受體異常可能是肥胖誘導(dǎo)CRC發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)聯(lián)因子[4-5]。Chemerin是近年脂肪因子研究的熱點(diǎn)之一,主要由肝臟與脂肪組織合成,在凝血與炎癥相關(guān)絲氨酸蛋白酶將C末端裂解后被激活,與其受體趨化素樣受體1(chemokine-like receptor 1,CMLKR-1)結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[6]。近年有研究顯示,Chemerin在CRC中可能扮演著重要角色,CRC患者循環(huán)系統(tǒng)中Chemerin表達(dá)水平顯著上升,且與臨床病理特征、預(yù)后相關(guān)[7-8]。但Chemerin對CRC發(fā)生與進(jìn)展作用機(jī)制尚不明確。本研究通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),探討Chemerin對結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480遷移與侵襲能力的影響,初步分析其可能的作用機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源與培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116、SW480購自Gibco公司,采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)采用0.25%胰蛋白酶消化傳代,采用對數(shù)生長期的CRC細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2主要儀器與試劑 脂肪因子Chemerin購自R&D Systems公司,FBS緩沖液、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco, Trizol試劑盒與Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Scientific,胰蛋白酶-EDTA消化液購自美國Thermo Fisher,上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、神經(jīng)鈣黏附蛋白(N-cadherin,N-cad)和波形蛋白(vimentin)與GAPDH一抗與二抗購自美國Abcam,Matrigel基質(zhì)膠購自北京尼康。Transwell小室購自美國Corning公司。PCR儀(美國Bio-Rad),細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Sim International),倒置熒光顯微鏡(日本Olympus)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞處理 取對數(shù)生長期細(xì)胞,采用不同濃度的Chemerin溶液處理,即0、100、200、300、400、500 ng/mL,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),48 h后進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人工合成Chemerin全長cDNA插入pEGFP-N1載體,構(gòu)建Chemerin高表達(dá)細(xì)胞,采用si-Chemerin構(gòu)建低表達(dá)Chemerin細(xì)胞。每種細(xì)胞設(shè)置以下4組:pEGFP-N1陰性對照組(vector control)、si-Chemerin陰性對照(si-NC)、pEGFP-N1-Chemerin組與si-Chemerin組。取對數(shù)生長期細(xì)胞,采用Lipofectamine 2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),48 h后進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.3.3細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,將細(xì)胞密度調(diào)整為106/mL,于Transwell小室下層加入600 μL含有10% PBS的RPMI 1640培養(yǎng)基,于上層每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。將Transwell板置入培養(yǎng)箱中(37 ℃、含5% CO2)培養(yǎng)24 h,95%甲醛固定,風(fēng)干小室,0.2%結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察,選擇5個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù),計(jì)算平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel膠于4 ℃靜置24～48 h使其變?yōu)橐簯B(tài),采用不含血清的預(yù)冷培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋Matrigel膠,取100 μL均勻涂抹于Transwell小室上室的聚碳酸酯膜表面,室溫下靜置3～5 h后聚合為凝膠。取各組細(xì)胞制成密度為2×105/mL的細(xì)胞懸液。于24孔板加入含10%FBS的培養(yǎng)基,將小室置于24孔板,于上室加入100 μL細(xì)胞懸液,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)(37 ℃、含5% CO2)24 h。取出小室,濕棉簽擦拭上層細(xì)胞與Matrigel。95%甲醛固定,0.2%結(jié)晶紫染色,PBS洗3次。選擇5個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù),計(jì)算平均值。侵襲率=(實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。對照組為0 ng/mL組或vector control組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 采用qRT-PCR法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞系E-cadherin(E-cad)、N-cadherin(N-cad)和vimentin mRNA水平。用PBS清洗處理后的細(xì)胞,重復(fù)2次,完成后置于冰上。加入Trizol裂解液,于冰上靜置,依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取,通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以后者為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系20μL:2×SYBR Mix 10 μL,10×cDNA 1μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL。內(nèi)參為β-actin(上游引物:ATGCATCTGCTGATGCGTACTG,下游引物:GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC)。E-cad上游引物:TAGCTGTAGTCGTGATCGTAGT,下游引物GTCATGCTGTAGTGCTGATGCG;Vimentin上游引物:CTAGCTGTAGCTGTAGTGCTGTC,下游引物GCTGATGCTGTAGCTGTAGCTC;N-cad上游引物:GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC;下游引物:GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG。采用相對定量法(2-ΔΔCt)計(jì)算相對表達(dá)量。重復(fù)3次。

1.3.6Western blot實(shí)驗(yàn) 通過Western blot法檢測E-cadherin、N-cadherin和vimentin蛋白水平。收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞,用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行蛋白提取,于SDS-PAGE凝膠上分離各組細(xì)胞蛋白質(zhì),完成后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。采用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉,行一抗與二抗孵育,采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光信號檢測。

1.4統(tǒng)計(jì)分析方法 采用IBM SPSS 25.0與GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。定量指標(biāo)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述,結(jié)果服從正態(tài)分布。兩組之間比較采用t檢驗(yàn),三組及以上之間比較采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,兩兩比較采用SNK法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同濃度Chemerin溶液對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響 與0 ng/mL組相比,Chemerin顯著增加了HTC116與SW480細(xì)胞遷移數(shù)(P<0.05),且隨Chemerin濃度上升呈增加趨勢,但300、400、500 ng/mL組兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同Chemerin濃度處理HCT116細(xì)胞

2.2不同濃度Chemerin溶液對結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的影響 與0 ng/mL組相比,Chemerin顯著增加了HTC116與SW480細(xì)胞侵襲率(P<0.05),且隨Chemerin濃度上升呈升高趨勢,而HTC116細(xì)胞300、400、500 ng/mL組侵襲率兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);SW480細(xì)胞400、500 ng/mL組侵襲率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),其余兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同Chemerin濃度處理HCT116細(xì)胞

2.3Chemerin表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響 Chemerin過表達(dá)的HTC116與SW480細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著上升,高于vector control組(P<0.05);Si-Chemerin組細(xì)胞遷移與侵襲能力顯著下降,低于si-NC組(P<0.05)。見圖3。

圖3 Chemerin表達(dá)對HCT116細(xì)胞與SW480

2.4Chemerin表達(dá)對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)標(biāo)志物表達(dá)的影響 qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,與vector control組相比,Chemerin過表達(dá)的HTC116與SW480細(xì)胞,E-cad mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05),N-cad與vimentin mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);與si-NC組相比,si-Chemerin組E-cad mRNA和蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05),N-cad與vimentin mRNA和蛋白表達(dá)下降(P<0.05),見圖4、圖5。

圖4 Chemerin對E-cad、N-cad和vimentin基因表達(dá)的影響

圖5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測E-cad、N-cad

3 討論

脂肪因子Chemerin編碼基因定位在人染色體的7q36.1,包括163個(gè)氨基酸序列。Chemerin與CMKLR1在早期脂肪細(xì)胞的擴(kuò)增中發(fā)揮著重要作用,可通過與PPARγ的相互作用調(diào)節(jié)成熟脂肪細(xì)胞生長與代謝[9]。Chemerin在肥胖、胰島素抵抗(insulin resistance,IR)人群中表達(dá)水平顯著上升,在肥胖相關(guān)疾病的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用[10]。近年研究顯示,Chemerin不僅參與脂肪生成、胰島素代謝與炎癥反應(yīng)等生理過程,也可作用于某些信號通路調(diào)控腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展,已被證實(shí)與肝癌、CRC、乳腺癌等惡性腫瘤相關(guān)。

El-Sagheer等[11]對117例乳腺癌患者的研究顯示,患者血清Chemerin水平顯著高于健康對照,免疫組化檢測結(jié)果顯示乳腺癌組織中Chemerin呈高表達(dá),受體CCRL2表達(dá)水平上升,且Chemerin表達(dá)水平與ER表達(dá)、PR表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、臨床預(yù)后相關(guān)。近期針對CRC的相關(guān)研究也得出了類似的結(jié)果。Erdogan等[12]的研究顯示,CRC患者血清中Chemerin水平顯著高于健康對照,且Chemerin水平與炎癥標(biāo)志物如血沉、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)相關(guān)。Alkady等[13]的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)果,CRC患者循環(huán)中Chemerin水平與腫瘤臨床病理參數(shù)相關(guān),隨著腫瘤惡性程度上升,循環(huán)中Chemerin表達(dá)水平升高。Eichelmann等[14]通過一項(xiàng)大樣本前瞻性隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)中Chemerin水平是CRC的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,其與CRC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈線性相關(guān),Chemerin最高四分位數(shù)者較最低四分位數(shù)者罹患CRC風(fēng)險(xiǎn)顯著上升(HR=1.81,95%CI：1.08-3.05)。上述研究提示循環(huán)中Chemerin可作為CRC腫瘤標(biāo)志物,用以輔助早期診斷與預(yù)后預(yù)測。本研究從細(xì)胞學(xué)層面探討了Chemerin對結(jié)腸癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響,結(jié)果顯示外源性給予Chemerin處理可提升結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲與遷移活性,促進(jìn)惡性生物學(xué)行為,Chemerin高表達(dá)的細(xì)胞侵襲與遷移活性也顯著提升,而抑制Chemerin表達(dá)可降低遷移與侵襲水平。上述結(jié)果提示Chemerin在CRC中表現(xiàn)為促癌效應(yīng),可促進(jìn)腫瘤發(fā)展,可作為CRC的腫瘤標(biāo)志物。

目前認(rèn)為Chemerin可通過多種機(jī)制調(diào)控腫瘤的生長。Chemerin表達(dá)改變可促進(jìn)代謝異常,引發(fā)腫瘤發(fā)生并促進(jìn)其進(jìn)展[15]。Chemerin具備促血管生成效應(yīng),而新生血管大量形成是腫瘤進(jìn)展的基礎(chǔ)。近期一項(xiàng)針對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯示,Chemerin可通過與該類細(xì)胞CMKLR1結(jié)合誘導(dǎo)AKT、p42/44 ERK磷酸化提升其增殖活性,促進(jìn)其向毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)分化[16]。提示Chemerin可通過誘導(dǎo)新生血管形成來促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。Kiczmer等[8]針對CRC的研究進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn),Chemerin可通過刺激MMP-9表達(dá)促進(jìn)腫瘤向正常組織浸潤,促進(jìn)血管生成并介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境形成,從而加快腫瘤進(jìn)展。此外,Chemerin具備較強(qiáng)的促炎效應(yīng),可加強(qiáng)腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng),從而影響細(xì)胞增殖、侵襲與遷移活性,進(jìn)一步提升新生血管形成活性[6]。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是腫瘤發(fā)展的重要生物學(xué)過程。EMT過程中上皮細(xì)胞黏附能力下降,并獲得侵襲與遷移表型[17]。Wu等[18]對多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的研究顯示,Chemerin可增強(qiáng)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)間充質(zhì)表型,并通過CMKLR1/NF-κB軸促進(jìn)M2極化,進(jìn)一步加強(qiáng)GBM的間充質(zhì)特征。上述結(jié)果提示Chemerin可促進(jìn)并維持細(xì)胞的間充質(zhì)特征。但肝癌相關(guān)研究得出了否定的結(jié)論。Feder等[19]對肝細(xì)胞癌的研究顯示,EMT標(biāo)志物E-cad等與Chemerin水平不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān),Chemerin可能并不通過EMT影響肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。本研究探討了Chemerin對結(jié)腸癌細(xì)胞系EMT的影響,結(jié)果顯示,Chemerin表達(dá)水平與EMT相關(guān),Chemerin過表達(dá)可抑制上皮標(biāo)志物上皮細(xì)胞鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá),并提升神經(jīng)鈣黏附蛋白(N-cadherin)與波形蛋白(vimentin)表達(dá),抑制Chemerin則可出現(xiàn)相反的效果。上述結(jié)果提示,Chemerin可能通過誘導(dǎo)EMT的進(jìn)展與細(xì)胞間充質(zhì)特征維持促進(jìn)CRC發(fā)展,但具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,Chemerin可提升CRC細(xì)胞侵襲與遷移活性,作用機(jī)制可能與EMT調(diào)控相關(guān)。Chemerin可能是CRC診斷、預(yù)后評估潛在標(biāo)志物,可通過進(jìn)一步研究探討其對CRC細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制。