不同性別東方田鼠組織器官中乙醇脫氫酶分析

萬(wàn)祥旭 周寶麗 黃笑然 金志民 劉春艷

摘要：為研究農(nóng)林地區(qū)典型害鼠生理生化特征，采用PAGE電泳對(duì)不同性別東方田鼠（Microtus fortis）各組織器官中的乙醇脫氫酶分布建立電泳譜圖并進(jìn)行活性分析。結(jié)果表明，不同性別東方田鼠各組織器官中均有乙醇脫氫酶表達(dá)，同時(shí)該酶在不同性別東方田鼠間表達(dá)有一定差異。

關(guān)鍵詞：東方田鼠（Microtus fortis）；乙醇脫氫酶；鼠害防控

中圖分類(lèi)號(hào)：Q956? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2024）01-0122-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.01.022 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Analysis of alcohol dehydrogenase in tissues and organs of different genders

of Microtus fortis

WAN Xiang-xu1，ZHOU Bao-li1，HUANG Xiao-ran1，JIN Zhi-min1，LIU Chun-yan2

（1. College of Life Science and Technology，Mudanjiang Normal University， Mudanjiang? 157011， Heilongjiang， China；

2. Tianjiabing Experimental Middle School，Mudanjiang City， Heilongjiang Province，Mudanjiang? 157000， Heilongjiang， China）

Abstract： In order to study the physiological and biochemical aspects of typical harmful rodents in agricultural and forestry areas， the PAGE electrophoresis was used to establish and analyze the distribution and activity of alcohol dehydrogenase in tissues and organs of different genders of Microtus fortis. The results showed that ethanol dehydrogenase was expressed in tissues and organs of different genders of Microtus fortis， and the expression of this enzyme showed certain differences among different genders of Microtus fortis.

Key words：Microtus fortis； alcohol dehydrogenase； rodent control

收稿日期：2022-09-09

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ss2021c006；LH2020C071）

作者簡(jiǎn)介：萬(wàn)祥旭（1999-），男，黑龍江鶴崗人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物學(xué)，（電話(huà)）13149532295（電子信箱）1374166255@qq.com；通信作者，金志民（1972-），男，黑龍江慶安人，教授，博士，主要從事動(dòng)物學(xué)研究，（電子信箱）swxjzm@163.com。

東方田鼠（Microtus fortis）屬于哺乳綱嚙齒目倉(cāng)鼠科田鼠屬，典型穴居類(lèi)型鼠，無(wú)冬眠習(xí)性，晝夜出洞，活動(dòng)頻率存在季節(jié)性差異，夏季的夜間活動(dòng)性高于白晝，黎明前高于黃昏。種群數(shù)量在部分地區(qū)波動(dòng)劇烈。其喜食莊稼、種子且啃食樹(shù)木，作物成熟后遷移至田間盜食，是重要的農(nóng)林害鼠之一，同時(shí)也是乙型森林腦炎病毒、鉤端螺旋體主要宿主之一［1］。

乙醇脫氫酶于1937年首次在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)并分離，是一類(lèi)具有廣泛底物特異性的含鋅金屬酶，每個(gè)亞基會(huì)有兩個(gè)鋅原子，具有一組同工酶，最適溫度為37 ℃。其廣泛存在于動(dòng)物肝臟中，并與乙醛脫氫酶共同構(gòu)成參與乙醇代謝的乙醇脫氫酶氧化體系［2，3］。乙醇脫氫酶為二聚體，是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，乙醇脫氫酶以NAD為輔酶，通過(guò)鋅離子與底物乙醇結(jié)合，催化醇反應(yīng)釋放產(chǎn)物醛：CH3CH2OH+NAD+→ CH3CHO+NADH+H+。

有關(guān)東方田鼠的研究報(bào)道較多［4-6］，但鮮見(jiàn)東方田鼠乙醇脫氫酶的研究，東方田鼠食性偏向于谷、瓜類(lèi)作物和荸薺、薯等球莖類(lèi)易發(fā)酵作物，乙醇脫氫酶主要作為分解攝入的發(fā)酵食物或者細(xì)菌在消化道中產(chǎn)生的醇類(lèi)，同時(shí)在其他類(lèi)型醇的分解代謝過(guò)程中也起到一定作用。因此，東方田鼠體內(nèi)乙醇脫氫酶活性可直觀反映出該鼠的野外抗逆性。本研究通過(guò)PAGE電泳對(duì)不同性別東方田鼠組織器官中乙醇脫氫酶比較分析，為農(nóng)林害鼠的防治提供基礎(chǔ)生理生化數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 東方田鼠為2021年5月21日采用籠捕法，于黑龍江省牡丹江市海浪機(jī)場(chǎng)西南側(cè)農(nóng)田與草地交界處捕獲，6只鼠均為成年個(gè)體（3♀、3♂）。

1.1.2 儀器 DYCZ-21A型電泳槽、DYY-8C型電泳電源、恒溫水浴鍋（北京六一儀器廠），離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coultar公司），AlphaImager Mini型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Alpha公司），微量移液器（德國(guó)Eppendorf AG公司）。

1.1.3 試劑 Tris-HCL、過(guò)硫酸銨（AP）、TEMED、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘氨酸、溴酚藍(lán)、冰醋酸、瓊脂糖、蔗糖、核黃素、95%乙醇溶液、NBT、PMS、NAD等，均購(gòu)于上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液提取 無(wú)菌環(huán)境下采用哺乳動(dòng)物解剖法分離成年?yáng)|方田鼠心臟、肝臟、腎臟、肺臟、肌肉、腦，置于加入磷酸緩沖液（pH 7.6）的預(yù)冷研缽，樣品與勻漿緩沖液1∶3充分研磨，直至無(wú)塊狀組織顆粒，離心管分裝后4 ℃下5 000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液，吸取且分裝上清液后-80 ℃保存待測(cè)［7］。

1.2.2 PAGE電泳 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）不連續(xù)體系［8］，上、下兩極分別加入稀釋10倍后的10×Tirs-甘氨酸電極緩沖液（pH 8.3），10 mA紊流預(yù)電泳40 min后進(jìn)行點(diǎn)樣，待粗酶液與溴酚藍(lán)混合物全部入點(diǎn)樣孔后，40 mA紊流電泳6 h。不連續(xù)體系由9%分離膠（pH 8.9）和3%濃縮膠（pH 6.8）組成，分離膠緩沖液、分離膠貯液、超純水、過(guò)硫酸銨混合比例為1∶2∶1∶4，混合后灌入電泳槽至距離凹槽上? 2 cm處，待分離膠凝固后，以1∶2∶1∶4比例將濃縮膠緩沖液、濃縮膠貯液、40%蔗糖、核黃素溶液混合后灌入電泳槽，封插點(diǎn)樣梳，待膠板完全凝固后置于垂直電泳槽。

1.2.3 ADH染色 將凝膠取出后置于ADH染色液中［9］，于恒溫水浴鍋37 ℃進(jìn)行染色，直至泳道出現(xiàn)深紫色條帶，轉(zhuǎn)入蒸餾水中漂洗至紫色條帶更加清晰后，取出且滴加7%冰醋酸溶液固定保存［8］。在凝膠成像系統(tǒng)下對(duì)膠體進(jìn)行掃描成像，對(duì)譜帶遷移率進(jìn)行計(jì)算，判斷分析酶的分布、活性及強(qiáng)度［10］。

2 結(jié)果與分析

♀、♂東方田鼠的心臟、腦、腎臟、肌肉、肝臟、肺臟中共分離出ADH1～ADH19共19條電泳譜帶，遷移率為0.040～0.404，♀東方田鼠的心臟、腦、腎臟、肌肉、肝臟、肺臟分別分離出4、7、5、10、9、5條譜帶，? ♂東方田鼠的心臟、腦、腎臟、肌肉、肝臟、肺臟分別分離出4、7、4、8、11、6條譜帶。ADH17為♀東方田鼠特有譜帶，ADH5、ADH7、ADH10、ADH16、ADH19為♂東方田鼠特有譜帶，其余均為共有譜帶。

ADH1和ADH3為♀、♂東方田鼠6種組織器官中所共有，其中♀、♂東方田鼠均表現(xiàn)出心臟中ADH1活性最高，其次為肝臟、腦、肌肉、肺臟，且♂東方田鼠心臟、腎臟、肝臟中ADH1活性強(qiáng)于♀東方田鼠相對(duì)組織器官，肺臟、腦中ADH1活性二者相同。ADH3在♀東方田鼠心臟與♂東方田鼠肝臟中活性相同且最高，但其他組織器官中ADH3活性♂東方田鼠均高于♀東方田鼠。

ADH2和ADH4中♀、♂東方田鼠均表現(xiàn)為心臟強(qiáng)于肝臟，且肝臟強(qiáng)于其他組織器官，ADH2在♀東方田鼠腎臟、肌肉中活性相同，同時(shí)在♀東方田鼠肺臟、♂東方田鼠肌肉和肺臟中活性相同，但在♀東方田鼠腦中未見(jiàn)該條帶，因此ADH2為♂東方田鼠腦中特有條帶?！?、♂東方田鼠組織器官中ADH4活性均表現(xiàn)為肝臟強(qiáng)于心臟，且心臟強(qiáng)于其他組織器官，同時(shí)♀、♂東方田鼠肌肉中ADH4活性相同，同時(shí)肺臟中活性相同，♂東方田鼠腎臟中未見(jiàn)ADH4條帶而♀東方田鼠腎臟中存在，ADH4為♀東方田鼠腎臟中特有條帶。

ADH8、ADH9分別存在于♂東方田鼠肝臟和♀東方田鼠肝臟和肌肉中，♀、♂東方田鼠肝臟中ADH8、ADH9活性相同，但在♂東方田鼠肌肉中未見(jiàn)ADH8、ADH9條帶，因此ADH8、ADH9為♀東方田鼠肌肉中特有條帶。ADH12存在于♀東方田鼠除心臟和肺臟外的各組織中，卻僅存在于♂東方田鼠肝臟和肺臟中，并且ADH12在♀東方田鼠肺臟中的活性遠(yuǎn)高于♀、♂東方田鼠其他組織器官，但肝臟中ADH12活性♂東方田鼠強(qiáng)于♀東方田鼠。

♀、♂東方田鼠肌肉中均有ADH14活性表達(dá)且♂東方田鼠強(qiáng)于♀東方田鼠，但♂東方田鼠肺臟中存在ADH14條帶而♀東方田鼠未見(jiàn)該條帶，ADH14為♂東方田鼠肺臟中特有條帶。ADH6、ADH15、ADH18為♀、♂東方田鼠腦組織中特有條帶，且ADH15、ADH18在♀、♂東方田鼠腦組織中活性相同。ADH11為♀、♂東方田鼠肝臟特有條帶且活性♂東方田鼠略高于♀東方田鼠，其他組織器官均無(wú)ADH11。具體電泳圖及遷移率情況見(jiàn)圖1、表1。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)對(duì)♀、♂東方田鼠的心臟、腦、腎臟、肌肉、肝臟、肺臟中ADH活性研究表明，ADH在♀、♂東方田鼠的各個(gè)組織器官中均有表達(dá)，且分離條帶總數(shù)相同，不同性別各組織器官中分離譜帶數(shù)相差不大，但不同性別中個(gè)別器官酶帶分布略有差異，♀東方田鼠組織器官中ADH條帶數(shù)最多的為肌肉，其次為肝臟，♂東方田鼠組織器官中ADH條帶數(shù)最多的為肝臟，肌肉次之。ADH進(jìn)化目的是為分解攝入的發(fā)酵食物或者細(xì)菌在消化道中產(chǎn)生的醇類(lèi)，并且ADH也會(huì)參與其他類(lèi)型醇的分解代謝，如將甲醇分解為乙二醇和醛等。肝臟是哺乳動(dòng)物重要的代謝與解毒器官，♂東方田鼠肝臟中ADH活性強(qiáng)于♀東方田鼠，表明♂東方田鼠的野外抗逆性強(qiáng)于♀東方田鼠。因此，對(duì)于東方田鼠鼠害的防治可從其生理生化角度出發(fā)，對(duì)♀、♂東方田鼠組織器官中ADH活性進(jìn)行研究，可為農(nóng)林害鼠的防治及毒餌設(shè)計(jì)提供基礎(chǔ)生化數(shù)據(jù)。

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