41Ca的AMS測(cè)量方法及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

畢艷婷,付云翀

(1.西安地球環(huán)境創(chuàng)新研究院,西安 710061;2.中國科學(xué)院地球環(huán)境研究所 黃土與第四紀(jì)地質(zhì)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710061;3.西安加速器質(zhì)譜中心 陜西省加速器質(zhì)譜技術(shù)及應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710061)

鈣(Ca)是動(dòng)植物生長(zhǎng)的必須營養(yǎng)元素[1]。動(dòng)物體內(nèi)99%的鈣存在于骨骼和牙齒中,少部分存在于細(xì)胞外液和血液中。骨骼作為鈣儲(chǔ)存庫,通過不斷的骨吸收與骨形成維持體內(nèi)鈣平衡,當(dāng)平衡改變(骨重塑異常),就會(huì)導(dǎo)致代謝性骨病,例如骨質(zhì)疏松。Ca2+可以維持動(dòng)物的新陳代謝和細(xì)胞的正常生理功能,并作為“生物學(xué)信使”參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo),胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度的變化可以反映多種疾病的發(fā)生,例如癌癥和腎臟疾病等[2-8]。此外,Ca在植物細(xì)胞功能中發(fā)揮多重作用[9],對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和長(zhǎng)期儲(chǔ)存等方面至關(guān)重要。Ca2+在土壤中以游離金屬或水合物形式穩(wěn)定存在,植物根系從土壤溶液中吸收Ca,樹葉、針葉凋落物和樹皮分解再次將Ca釋放到自然界形成循環(huán)過程[10-16]。但植物從土壤或營養(yǎng)液中攝取鈣以及鈣在植物內(nèi)部的精確運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)制目前尚不清楚。充分了解并闡明Ca2+在植物體內(nèi)的傳輸過程、分布規(guī)律和吸收情況可為植物的科學(xué)補(bǔ)鈣提供幫助。因此,利用鈣同位素對(duì)個(gè)體(植物和動(dòng)物)進(jìn)行精細(xì)化鈣循環(huán)示蹤對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要意義。

Ca的眾多同位素中有6種穩(wěn)定同位素(40,42,43,44,46,48Ca),它們?cè)谏矬w內(nèi)含量較高且自然界來源復(fù)雜,因此不適合對(duì)個(gè)體精確地定量化示蹤。還有3種半衰期1 d以上的放射性核素,即41Ca(T1/2=(9.94±0.15)×104a)[17]、45Ca(T1/2=162.6 d)和47Ca(T1/2=4.5 d)。其中45Ca和47Ca衰變時(shí)會(huì)發(fā)射出電子和γ射線,二者半衰期相對(duì)較短,易對(duì)生物體造成輻射損傷(特別是應(yīng)用前景最為重要的人體鈣代謝研究)[18];由于二者監(jiān)測(cè)周期相對(duì)較短,而骨代謝比較緩慢(時(shí)間尺度為月和年),即使忽略輻射劑量的影響,他們?nèi)匀徊皇茄芯可到y(tǒng)鈣代謝的最佳選擇。

41Ca半衰期較長(zhǎng),衰變方式為軌道電子俘獲并發(fā)射出3.3 keV的X射線,放射性極低,對(duì)生物體的損傷很小,適合長(zhǎng)期生物示蹤工作,120 ng41Ca對(duì)受試者的輻射劑量約為每年0.06 μSv,比自然輻射的總劑量低3萬倍[20]。且天然樣品中41Ca/40Ca比值非常低(10-14～10-15),實(shí)驗(yàn)時(shí)不用考慮自然界的影響,使得測(cè)量靈敏度得以提升。因此41Ca是一種理想的生物示蹤劑,廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)[21-35]和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[36-46]。一般加入41Ca作為示蹤劑使41Ca在樣品中濃度有所提升,但由于其半衰期長(zhǎng)、發(fā)射的X射線能量低和同量異位素41K干擾等諸多原因,傳統(tǒng)的測(cè)量方法如衰變計(jì)數(shù)法、中子活化分析法和一般質(zhì)譜法都難以高效準(zhǔn)確地測(cè)定41Ca。與共振電離質(zhì)譜(RIMS)[47-49]、液體閃爍譜儀(LSC)[50-52]和X射線(X-ray)光譜法[53]等相比,加速器質(zhì)譜儀(AMS)通過測(cè)量41Ca/40Ca豐度比,從而量化分析41Ca并可有效排除干擾提升測(cè)量靈敏度[54]。X-ray光譜法雖然操作方便,樣品制備過程簡(jiǎn)單,但計(jì)數(shù)率(<0.08%)和靈敏度較低[53];LSC方法相比于X-ray光譜法靈敏度略有提高(1%～13%)[50],但樣品制備和計(jì)數(shù)時(shí)間較長(zhǎng);RIMS方法與LSC和X-ray光譜法相比是較為靈敏的41Ca測(cè)量方法,但綜合對(duì)比檢測(cè)限和測(cè)量時(shí)間,AMS為最佳選擇[55]。

由此,本研究對(duì)41Ca的AMS測(cè)量技術(shù)發(fā)展和其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行闡述。主要介紹41Ca-AMS分析技術(shù)中涉及的研究樣品形式的選擇和不同能量下AMS的儀器技術(shù)發(fā)展,總結(jié)了主要的基于添加41Ca為示蹤劑的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究情況,如動(dòng)物長(zhǎng)期骨鈣代謝、疾病防治與機(jī)理研究以及植物示蹤等方面。

1 41Ca的AMS測(cè)量方法

1.1 不同樣品形式的比較

1979年,Raisbeck和Yiou教授[19]驗(yàn)證了利用AMS測(cè)定41Ca的可行性,提出將41Ca加速至足夠大能量(≥300 MeV)將41Ca和41K分離從而抑制同量異位素41K的干擾。基于這種方法,他們以310 MeV的能量在Orsay的ALICE回旋加速器上首次實(shí)現(xiàn)了AMS對(duì)隕石樣品中41Ca的測(cè)量,樣品形式為CaO,測(cè)量的41Ca/40Ca豐度靈敏度為1×10-11[56]。

CaH2樣品的制備需要將41Ca從樣品中以CaC2O2形式沉淀,在1 000 ℃下轉(zhuǎn)化成CaO,CaO與Zr粉混合,在1 500 ℃下還原成金屬Ca,金屬Ca與H2進(jìn)一步生成CaH2,回收率在80%～90%之間。但是制備過程復(fù)雜,危險(xiǎn)性高,且CaH2在空氣中吸濕性強(qiáng),必須在惰性氣體(如氬氣)的保護(hù)下處理和儲(chǔ)存,測(cè)試大批量樣品不夠便捷。

表1 AMS 的與方法本底對(duì)比Table 1 Comparison of background level using

1.2 41Ca-AMS測(cè)量技術(shù)

截止本世紀(jì)初,41Ca的測(cè)量主要在大型(≥5 MV)AMS上進(jìn)行[18,74]。因?yàn)樵谳^高的能量下,AMS對(duì)同量異位素41K有足夠的辨別能力,可以很好地將41Ca與41K分離,靈敏度滿足自然含量樣品41Ca/40Ca的測(cè)量要求。但隨著小型(≤3 MV)AMS已快速發(fā)展成為應(yīng)用最廣的加速器質(zhì)譜儀類型(約占AMS總量的75%)[82],以及分析靈敏度在10-11以上即可開展生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的41Ca示蹤研究相關(guān)工作,致使能否在小型AMS上進(jìn)行41Ca分析備受矚目。

對(duì)于小型(≤3 MV)AMS,較低的能量下無法完全分離41Ca和同量異位素41K,那么對(duì)其有效抑制顯得格外重要。如前所述,在離子源引出階段CaF2對(duì)41K的抑制能力不夠高。因此,各實(shí)驗(yàn)室也嘗試在測(cè)量階段建立更為有效的分離41Ca和同量異位素41K的方法。2000年,Gif-sur-Yvette AMS在重離子線上建立了一個(gè)入射離子X射線探測(cè)系統(tǒng)(PXD),并嘗試在2.25 MV的端電壓下使用CaO樣品測(cè)量41Ca[77, 83]。PXD系統(tǒng)通過探測(cè)被分析的離子束與目標(biāo)箔相互作用產(chǎn)生的特征X射線來分辨同量異位素。對(duì)于低能加速器來說,X射線的分離程度幾乎不受束流能量影響,但其產(chǎn)率對(duì)能量依賴性較強(qiáng),所以這種方法測(cè)量靈敏度不高,41Ca/40Ca約為10-9。隨后,使用CaH2和CaF2,在2.25 MV端電壓下,通過氣體電離探測(cè)器對(duì)41Ca進(jìn)行分析,得到的本底值分別為10-13和10-11。

VERA嘗試通過ΔTOF方法在3 MV串聯(lián)加速器上利用CaF2樣品對(duì)41Ca進(jìn)行測(cè)量,本底值可以達(dá)到10-13[84]。ΔTOF方法的基本原理是根據(jù)41Ca和41K通過均勻的SiN箔后的能量損失差異導(dǎo)致飛行速度不同,從而在時(shí)間能譜上區(qū)分41K和41Ca[54,84-86]。但由于ΔTOF方法的探測(cè)效率較低,沒有用于批量測(cè)量,他們還嘗試使用一種緊湊型氣體電離室測(cè)量41Ca,本底水平約為10-13[87]。

對(duì)于緊湊型AMS(<1 MV)來說,目前仍然無法在低能量情況下將41Ca和41K分離,但是可以通過39K校正的方法來實(shí)現(xiàn)對(duì)41Ca的測(cè)量。首次在緊湊型AMS上分析41Ca的是ETH,在0.5 MV的端電壓下分析41Ca,校正后的背景值接近5×10-12,表明緊湊型AMS可以用于生物醫(yī)學(xué)樣本中41Ca的測(cè)量[74,92-93]。TNO和CNA在1 MV的端電壓下獲得了和ETH相當(dāng)?shù)谋镜姿?且TNO的測(cè)量效率較ETH有所提升[80-81]。近期MRC-EMSI實(shí)驗(yàn)室和Aarhus大學(xué)也測(cè)試了其1 MV AMS對(duì)41Ca的分析能力,背景值分別為1.41×10-11[78]和9×10-12[79]。

Xia等[94]報(bào)道了基于激光捕獲和冷卻的原子阱捕獲分析技術(shù)(ATTA),可以測(cè)量41Ca原子的數(shù)量。單個(gè)原子在塞曼減速器中選擇性冷卻,通過諧振激光束捕獲在磁光阱(MOT)中,并通過觀察捕獲原子的熒光來檢測(cè)。ATTA分析完全不受其他元素(例如41K)的影響,可以用于增強(qiáng)超靈敏同位素痕量分析的能力。通過這種方法可以對(duì)自然樣品中的41Ca/40Ca進(jìn)行分析,目前檢測(cè)限已經(jīng)達(dá)到10-17,但總體分析效率有待進(jìn)一步提升,樣品需還原至金屬Ca且用量較大。

綜上所述,3 MV AMS雖然無法將41K和41Ca完全分開,但在此能量下結(jié)合氣體電離探測(cè)器可一定程度上分離41K,從而將41Ca/40Ca的本底值降到10-13左右。

2 41Ca的AMS測(cè)量技術(shù)在生物示蹤中的應(yīng)用

41Ca-AMS技術(shù)在生命科學(xué)[20-35]、生物醫(yī)學(xué)[36-46]、地球科學(xué)[19]、環(huán)境科學(xué)[95-98]、核天體物理[66]等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,本研究主要介紹41Ca-AMS技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的示蹤應(yīng)用。

2.1 41Ca的AMS測(cè)量技術(shù)在動(dòng)物骨鈣動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用

骨質(zhì)疏松是全球公共健康問題之一[18],骨鈣動(dòng)力學(xué)研究對(duì)于骨質(zhì)疏松的早期發(fā)現(xiàn)和治療非常重要。與質(zhì)量平衡法、骨活檢的組織形態(tài)測(cè)量、雙能X射線骨密度儀(DXA)測(cè)量骨密度(BMD)以及利用生化標(biāo)志物監(jiān)測(cè)骨吸收率的短期變化等方法相比,鈣同位素示蹤技術(shù)是一種理想的骨鈣代謝直接測(cè)量方式。目前41Ca示蹤技術(shù)是探究生物體骨鈣代謝情況以及鈣缺乏疾病機(jī)理等方面的重要手段,在評(píng)估人類骨骼健康、監(jiān)測(cè)骨重塑動(dòng)態(tài)和藥物干擾效果等方面具有潛力[21-23]。早期測(cè)量只獲得一些簡(jiǎn)單的結(jié)果,例如狗的骨代謝方法研究[18];人體血液與尿液中的41Ca/40Ca比值在一次性給藥100 d左右后趨于穩(wěn)定,約為1.5×10-11[24];藥物干擾對(duì)41Ca濃度的影響等[21-22]。

二十世紀(jì)初,科學(xué)家們開始通過41Ca示蹤人體骨轉(zhuǎn)換率的微小變化建立人類鈣平衡的線性動(dòng)力學(xué)模型,可用來預(yù)測(cè)個(gè)體骨轉(zhuǎn)換率的變化[25]。并通過群體藥代動(dòng)力學(xué)(NONMEM)分析41Ca數(shù)據(jù),建立描述尿液中41Ca示蹤劑動(dòng)力學(xué)的連續(xù)三隔室模型[26],后將其擴(kuò)展為四隔室模型[27-28],可用來評(píng)估藥物干擾、飲食、激素水平和生活方式對(duì)骨骼代謝的影響。例如,評(píng)估雙膦酸鹽[29]、大豆異黃酮[30-31]、維生素D[32]等藥物以及特殊飲食[33-34]對(duì)骨吸收的影響和高鈣飼料(奶制品或碳酸鈣)對(duì)代謝綜合癥豬的冠狀動(dòng)脈鈣沉積的影響[35]。與傳統(tǒng)技術(shù)相比,使用41Ca對(duì)骨骼進(jìn)行同位素標(biāo)記可以縮短干預(yù)周期,降低受試者數(shù)量,并更容易進(jìn)行交叉研究。

2.2 41Ca-AMS測(cè)量技術(shù)在疾病防治與機(jī)理研究中的應(yīng)用

41Ca-AMS技術(shù)可以應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)中一些疾病的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)。如監(jiān)測(cè)健康個(gè)體與特殊疾病(例如ESRD、甲亢和腫瘤骨轉(zhuǎn)移)患者之間的鈣動(dòng)力學(xué)差異可作為患者的早期診斷和長(zhǎng)期預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。研究人員對(duì)晚期腎病(ESRD)患者和健康個(gè)體的血清進(jìn)行41Ca標(biāo)記,并通過AMS測(cè)量受試者血清樣本中的41Ca/40Ca比值,對(duì)比鈣動(dòng)力學(xué)分布可以看出,ESRD患者血漿中的41Ca/40Ca比值與對(duì)照組存在明顯差異[36]。

航天醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也離不開41Ca-AMS的技術(shù)支持。航天員在訓(xùn)練和執(zhí)行任務(wù)期間會(huì)長(zhǎng)期處于失重狀態(tài),骨鈣代謝失衡,骨量減少,且恢復(fù)非常緩慢,嚴(yán)重危害航天員的身體健康。對(duì)失重狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行41Ca標(biāo)記,再用藥物進(jìn)行干預(yù)。通過AMS測(cè)量實(shí)驗(yàn)鼠股骨部位的41Ca/40Ca比值可以得到骨鈣沉積情況,從而評(píng)估失重對(duì)股骨攝取外源鈣的能力以及骨量下降和骨鈣代謝紊亂的機(jī)理,有利于針對(duì)失重導(dǎo)致的鈣代謝異常疾病提出相應(yīng)的預(yù)防和治療措施[37-38]。

鈣吸收率的準(zhǔn)確測(cè)量對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)上合理補(bǔ)鈣和預(yù)防鈣代謝疾病具有一定指導(dǎo)意義。與傳統(tǒng)的鈣吸收率測(cè)量方式相比,41Ca標(biāo)記體內(nèi)鈣庫,可以區(qū)分內(nèi)源鈣從而獲得補(bǔ)鈣劑的凈鈣吸收率[39-40]。表觀吸收率=(攝入Ca-糞便Ca)/攝入Ca×100%;凈鈣吸收率=(攝入Ca-糞便Ca+糞便中的內(nèi)源Ca)/攝入Ca×100%;糞便中的內(nèi)源Ca=糞便Ca×(糞便中41Ca/40Ca比值/血液中41Ca/40Ca比值)。通常凈鈣吸收率大于表觀吸收率,這種測(cè)量方法可以更精準(zhǔn)的測(cè)量鈣吸收率,為臨床上補(bǔ)鈣劑量的確定提供理論指導(dǎo)。

41Ca-AMS技術(shù)也可以通過探究細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)力學(xué)從而研究相關(guān)疾病的機(jī)理。由于缺血時(shí)細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度會(huì)發(fā)生變化,用41Ca作示蹤劑可以探究心肌缺血和氧氣再灌注時(shí)心肌組織中的鈣吸收和沉積情況,從而闡明不可逆肌細(xì)胞損傷的事件和機(jī)制[41]。致癌物質(zhì)引起細(xì)胞癌變的過程中,胞漿內(nèi)游離的Ca2+濃度呈現(xiàn)迅速升高的趨勢(shì)。因此可以通過分析增加的Ca2+來源開展致癌機(jī)理研究。使用致癌物質(zhì)刺激人肺成纖維樣細(xì)胞時(shí),41Ca-AMS技術(shù)可測(cè)量胞漿內(nèi)Ca2+濃度變化和運(yùn)動(dòng)情況,為癌癥的機(jī)理研究提供了一種新的檢測(cè)手段[42-43]。這種方法還可用來檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)類藥物(谷氨酸和MK-801)作用下的PC12細(xì)胞內(nèi)外鈣內(nèi)流情況[44]和藥物刺激破骨細(xì)胞時(shí)破骨細(xì)胞骨吸收行為[45-46]。

2.3 41Ca-AMS測(cè)量技術(shù)在植物示蹤研究中的應(yīng)用

此外,應(yīng)用41Ca-AMS技術(shù)還可以對(duì)植物體進(jìn)行示蹤研究。2016年[99],國內(nèi)首次建立了41Ca-AMS技術(shù)示蹤植物體的樣品制備方法,并基于該方法對(duì)桃樹做了個(gè)別樣品的41Ca示蹤研究[100],通過樹干注射的方法進(jìn)行41Ca標(biāo)記,利用AMS測(cè)量各器官的鈣含量。結(jié)果表明,41Ca-AMS技術(shù)可以用于研究植物對(duì)土壤和水中Ca2+的吸收情況以及Ca2+在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,有望為農(nóng)作物的科學(xué)補(bǔ)鈣和破譯植物-土壤系統(tǒng)界面化學(xué)相互作用過程提供幫助。

3 小結(jié)與展望

雖然利用41Ca-AMS可以實(shí)現(xiàn)生物樣品的批量測(cè)量,但是,目前41Ca-AMS技術(shù)仍然面臨一些挑戰(zhàn)。對(duì)于小型AMS測(cè)量41Ca來說,如何將本底降到可以測(cè)量自然含量下的樣品是亟待解決的問題。樣品制備階段可以利用CaH2和CaF2兩種樣品形式對(duì)41K進(jìn)行抑制,其中CaH2的效果雖好,但制備流程復(fù)雜且危險(xiǎn),樣品保存困難,不適合大批量測(cè)量;CaF2易于制備,但對(duì)41K的抑制在4個(gè)量級(jí)左右,且氟化物具有較強(qiáng)的記憶效應(yīng),導(dǎo)致即使使用大型AMS,在41K和41Ca完全分離的情況下,依然得不到理想的本底水平,無法滿足大批量的地質(zhì)年代學(xué)樣品的測(cè)量。