一種羅丹明內(nèi)酰胺類高分子pH熒光探針的合成及性能

李桂貞，胡英元，章博，楊耀祖，翟榮佳，趙鑫

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

pH 在細(xì)胞代謝、離子遷移、酶活性和蛋白質(zhì)降解等生理過程中起著重要的作用，此項(xiàng)生理參數(shù)非常關(guān)鍵[1-4]。多數(shù)生物體都不能存活于強(qiáng)堿或強(qiáng)酸條件下，正常的生理?xiàng)l件下，pH 應(yīng)保持在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，異常的pH 會(huì)引起細(xì)胞功能障礙，由此引發(fā)相關(guān)生物體病變，包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病（NDD）、阿爾茨海默氏?。ˋD）與囊性纖維化（CF）等[5-6]，因此研究弱酸或弱堿性環(huán)境下pH的變化十分重要。現(xiàn)有技術(shù)證明，在酸堿度上，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的pH 分別為7.4 和6.2～6.9，后者一般偏低，這種pH 上的顯著差別可用于腫瘤細(xì)胞的識(shí)別與診治[7]。此外，溶酶體是細(xì)胞中一類弱酸性細(xì)胞器（pH 為4.7～6.5），可降解細(xì)胞組分及大分子物質(zhì)，能夠維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[8]。另一方面，生態(tài)環(huán)境pH 的變化會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物物理干旱，破壞植被組織，阻礙營養(yǎng)吸收等[9-10]。因此，尋找定量測(cè)量pH 的有效方法對(duì)于疾病診斷和環(huán)境監(jiān)測(cè)都具有重要意義。

現(xiàn)今，已有諸多方法皆可用來測(cè)定pH，例如電化學(xué)測(cè)量法、酸堿指示劑滴定法、電位滴定法和光譜學(xué)等方法[11-14]。但這些方法對(duì)于儀器精度、處理過程有較高要求，對(duì)其用于測(cè)定細(xì)胞pH 有諸多限制。與這些方法相比，小分子熒光探針的長處在于操作簡便、高選擇性等，但其制備過程相對(duì)復(fù)雜，與細(xì)胞可能存在排異、水溶性問題。近年來，聚合物熒光探針成為了另一研究熱點(diǎn)，其在生物相容性與水溶性方面表現(xiàn)更佳，還具有熒光信號(hào)強(qiáng)、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)[15]。目前，現(xiàn)有聚合物熒光探針研究大多是檢測(cè)金屬離子，用于pH 檢測(cè)的聚合物熒光探針還有待深入研究[16-20]。在實(shí)際檢測(cè)中，待檢測(cè)物與探針結(jié)合會(huì)導(dǎo)致熒光增強(qiáng)或熒光猝滅，受猝滅劑等因素影響，猝滅型聚合物熒光探針可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏差[21]，增強(qiáng)型聚合物熒光探針的研發(fā)意義更加顯著。包含內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)的羅丹明（Rhodamine）類熒光染料分子具有無熒光、無色特性，但對(duì)pH 變化有高敏感性，酸性環(huán)境下，其螺環(huán)結(jié)構(gòu)開環(huán)，形成大共軛結(jié)構(gòu)，會(huì)發(fā)射出熒光量子效率在85%以上的橙紅色強(qiáng)熒光[22]。然而，羅丹明內(nèi)酰胺小分子缺乏良好水溶性，同時(shí)常與金屬離子形成配位效應(yīng)或被催化分解，可嚴(yán)重干擾氫離子的熒光響應(yīng)，所以水溶性表現(xiàn)良好的羅丹明內(nèi)酰胺聚合物探針的研究具有較大價(jià)值。

本文先修飾羅丹明B，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂锌删酆想p鍵結(jié)構(gòu)的單體，接著與能夠穿透細(xì)胞膜的水溶性單體共聚，制備出一種高分子pH熒光探針PRAM，此探針具有很好的細(xì)胞膜透性與水溶性。且探針PRAM所包含的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)中的N原子與吸電子基團(tuán)相連，使相鄰N原子上電子云密度減少，因此不能再與金屬離子配合響應(yīng)，導(dǎo)致分子呈現(xiàn)開環(huán)-閉環(huán)的臨界態(tài)，但對(duì)H+極為敏感。因此，探針PRAM以丙烯酰胺基團(tuán)作為響應(yīng)位點(diǎn)調(diào)控羅丹明基團(tuán)，能夠只對(duì)H+形成熒光響應(yīng)，且抗干擾性能突出，其響應(yīng)機(jī)理如圖1 所示。該探針pKa值為4.30，可在較快的響應(yīng)時(shí)間下監(jiān)測(cè)細(xì)胞器內(nèi)和水環(huán)境中pH 的變化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了TM3活細(xì)胞的熒光成像。

圖1 探針PRAM對(duì)pH變化的響應(yīng)機(jī)理

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

化學(xué)試劑皆為市場(chǎng)中銷售的分析純，若未特定標(biāo)注，不需要再純化，可直接使用。實(shí)驗(yàn)用蒸餾水為二次蒸餾水。紅外譜圖采用德國Bruker 公司FTIR-VERTEX 80/80v 傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）；1H NMR 和13C NMR 譜圖采用瑞士Bruker公司AVANCE Ⅲ型400MHz 核磁共振儀（NMR）；元素分析用Elementar Vario EL Ⅲ型元素分析儀測(cè)定。采用UV-8500 紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸收光譜；熒光發(fā)射光譜采用FLS920 熒光分光光度計(jì)；用pHS-3C 型精密pH 計(jì)測(cè)定pH。采用三次獨(dú)立測(cè)量的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）收集數(shù)據(jù)。細(xì)胞熒光成像采用SZX10型奧林巴斯顯微鏡檢測(cè)。

1.2 性能測(cè)試

探針PRAM儲(chǔ)備液的配制：稱取0.1g純品探針PRAM，溶于蒸餾水中，并移入100mL容量瓶，用蒸餾水定容，配制成1mg/mL的探針測(cè)試液。

UV-Vis 測(cè)試：取多份1mL 探針PRAM 水溶液（1mg/mL）于25mL的燒杯中，分別調(diào)節(jié)溶液pH為4.0～9.0，放入10mL 容量瓶，蒸餾水定容，混勻并靜置15min，檢測(cè)UV-Vis譜。

熒光光譜測(cè)試：溶液制備參照UV-Vis 測(cè)試，以下為檢測(cè)條件：激發(fā)波長（λex）與狹縫寬度各為526nm、5nm。

選擇性和干擾性測(cè)試方法：取多份1mL的PRAM水溶液（1mg/mL），分別加入1mL濃度為1×10-4mol/L的金屬離子水溶液（Fe3+、Cu2+、Pb2+、Co2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+和Na+），混合均勻，調(diào)節(jié)pH為5.0或7.0，靜置15min，檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.3 細(xì)胞成像

控溫37℃，在?(CO2)為5%恒溫培養(yǎng)箱中，用10%的滅活胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)TM3 細(xì)胞（正常小鼠睪丸Leydig細(xì)胞）。把TM3放入DEME高糖培養(yǎng)基[內(nèi)含10%牛血清（FBS）]，靜置培養(yǎng)24h。將其移至24 孔板內(nèi)接種。待細(xì)胞貼壁后，滴加0.5mg/mL濃度的探針，靜置培養(yǎng)30min，再加入不同pH（4.0、5.0、6.0、7.0）的磷酸緩沖液（PBS）培養(yǎng)15min，用PBS 溶液洗滌兩次，在熒光顯微鏡（FM）下成像。

1.4 探針PRAM的合成

使用試劑羅丹明 B、水合肼、丙烯酰氯和丙烯酰胺，經(jīng)過三步合成得到熒光探針PRAM，其合成路線如圖2所示。

圖2 PRAM的合成路線

1.4.1 中間體Mrh的合成

根據(jù)Minami等[23]和翟榮佳等[24]的方法，合成底物羅丹明B酰肼，得到粉色固體1.83g，產(chǎn)率80.3%。m.p.110.4～112.7℃。1H NMR（CDCl3，400MHz）（δ）：7.95～7.93（d，J= 7.5Hz，1H），7.46～7.44（m，2H），7.12～7.10（d，J= 7.5Hz，1H），6.45～6.47（d，J=7.5Hz，2H），6.41～6.42（d，J= 7.5Hz，2H），6.28～6.31（s，2H），3.61（s，2H），3.32～3.37（q，J=8.0Hz，8H），1.15～1.18（t，J=8.0Hz，12H）。元素分析[C28H32N4O2理論值（實(shí)測(cè)值）]：C，73.64%（73.61%）； H， 7.07% （7.09%）； N， 12.28%（12.23%）。

取羅丹明B 酰肼0.912g（2mmol）和四氫呋喃（THF）5mL加入到50mL三口燒瓶，冰浴下，把溶于5mL 四氫呋喃的0.2g（2.2mmol）丙烯酰氯滴加到三口燒瓶內(nèi)，室溫條件下反應(yīng)6h。過濾沉淀，THF 洗滌、干燥，得0.53g 粉紅色固體Mrh，收率52.0%，m.p.198.2～200.3℃。1H NMR（DMSO-d6，400MHz）（δ）：9.95（s，1H），8.79（s，1H），7.88～7.86 （d，J= 7.5Hz，1H），7.58～7.54 （m，2H），7.27～7.25（d，J= 7.5Hz，2H），7.08～7.06（d，J=7.5Hz，1H），6.74～6.72（d，J= 7.5Hz，2H），6.42（s，1H），6.39（m，1H），6.34～6.32（d，J= 16.8Hz，2H），3.40～3.29（q，J= 8.0Hz，8H），1.08～1.05（t，J= 8.0Hz，12H）。13C NMR（DMSO-d6，100MHz）（δ）： 163.84， 160.07， 153.15，151.58，149.71，148.83，133.99，129.61，129.10，128.13，125.98，124.20，123.29，116.13，108.38，106.14，97.73，65.82，44.10，12.88。元素分析[C31H34N4O3理論值/（實(shí)測(cè)值）]：C，72.92% （72.98%)；H，6.71%（6.67%）；N，10.97%（10.92%）。

1.4.2 PRAM的合成

在50mL三口燒瓶中，將0.255g（0.5mmol）Mrh、1.5g （21.13mmol） 丙 烯 酰 胺、0.10g （0.61mmol）偶氮二異丁腈溶解在30mL 環(huán)己酮中，于60℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境中，反應(yīng)7h。用丙酮沉析出聚合物。再用水、丙酮溶解、沉析3次，真空干燥，得粉紅色固體，即探針PRAM，收率82%。FTIR（KBr）（v/cm-1)： 3300～3439 （ —NH， —NH2）、 2913（—CH2，—CH3）、1667（酰胺羰基）、1600、1470（苯環(huán)）。1H NMR（DMSO-d6，400MHz）（δ）：7.88（s，Ar-H），7.58～7.54（d，J=7.5Hz，Ar-H），6.89（d，J= 7.5Hz，Ar-H），6.75 （s，Ar-H），3.30（s， —NH）， 2.00～2.40 （m， —CH， —CH2），1.60～1.20（t，J= 8.0Hz，—CH3）。

2 結(jié)果與討論

2.1 PRAM的合成與表征

探針PRAM經(jīng)胺解、酰化、聚合三步反應(yīng)得到，制備步驟少、合成條件簡單、收率高。水溶性好的聚丙烯酰胺鏈的引入，增大了探針PRAM 的水溶性，為其實(shí)際應(yīng)用，尤其是在生物活細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ)。高分子探針PRAM的FTIR 譜上出現(xiàn)的特征峰：3300～3439cm-1（—NH、—NH2）、2913cm-1（—CH2、—CH3）、1667cm-1（酰胺羰基）、1600cm-1、1470cm-1（苯環(huán)），初步表明羅丹明B 與丙烯酰胺進(jìn)行了共聚反應(yīng)。對(duì)比探針PRAM 和單體Mrh 的核磁共振氫譜發(fā)現(xiàn)，聚合后，化學(xué)位移為6.32～6.40 的烯鍵質(zhì)子峰消失，同時(shí)在化學(xué)位移為2.00～2.40附近出現(xiàn)了—CH—、—CH2—的質(zhì)子峰，但依然可觀察到氧雜萘環(huán)和羅丹明基團(tuán)中苯環(huán)上的質(zhì)子峰。這表明單體Mrh與丙烯酰胺進(jìn)行了共聚反應(yīng)，并且Mrh單元通過共價(jià)鍵連接在了高分子PRAM的側(cè)鏈上。

2.2 探針PRAM的紫外-可見吸收光譜

在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)測(cè)試探針PRAM的紫外-可見吸收光譜，見圖3。結(jié)果顯示，pH為7.0～9.0區(qū)間內(nèi)，其吸光度變化不大，但在4.0～7.0區(qū)間內(nèi)，其吸光度變化明顯，且隨pH變?。ㄋ岫仍鰪?qiáng)），其吸光度大幅增強(qiáng)，并于526nm、567nm處出現(xiàn)兩個(gè)吸收峰。因此可選取能量較高的526nm作為測(cè)試發(fā)射光譜的激發(fā)波長，567nm處的最大吸收峰應(yīng)歸屬內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)于酸性環(huán)境中開環(huán)所致，同時(shí)使溶液從無色向粉紅色轉(zhuǎn)變，表明探針PRAM 在4.0～7.0 的范圍內(nèi)可裸眼識(shí)別溶液pH的變化。

圖3 PRAM在不同pH水溶液下的紫外-可見吸收光譜

2.3 探針PRAM的熒光光譜

選擇526nm為激發(fā)波長，測(cè)定PRAM的熒光光譜，見圖4。圖4(a)顯示，隨著pH逐漸減小，探針PRAM于585nm處的熒光峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，發(fā)射出明亮的橙紅色熒光。弱酸性（pH 為4.0～7.0）環(huán)境下，當(dāng)pH等于4.0時(shí)，熒光強(qiáng)度升至最大，對(duì)比pH為9.0 時(shí)的熒光強(qiáng)度，其熒光強(qiáng)度提升了約10 倍。原因在于H+促進(jìn)了螺內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)，羅丹明內(nèi)酰胺基團(tuán)被質(zhì)子化，同時(shí)形成了較大共軛體系，因此熒光強(qiáng)度大幅增強(qiáng)。同時(shí)當(dāng)處于弱酸性環(huán)境，探針表現(xiàn)出較高的靈敏性。但在弱堿性（pH 為7.0～9.0）環(huán)境下，內(nèi)酰胺基團(tuán)去質(zhì)子化，探針PRAM的存在形式為螺內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，故基本無熒光發(fā)射。此外，pH為5.0～6.0區(qū)間內(nèi)，pH與585nm處的熒光強(qiáng)度具有良好的線性關(guān)系（見圖4 插圖）。其線性回歸方程為：I=426.18-69.324c（式中，c為pH；I為585nm處的熒光強(qiáng)度），相關(guān)系數(shù)為0.9955。所以，在pH 為5.0～6.0 區(qū)間內(nèi)，測(cè)得溶液中探針PRAM的熒光強(qiáng)度，可由此線性方程精確計(jì)算體系的pH?；贖enderson-Hasselbachtype方程[25]得式(1)。

圖4 PRAM的熒光強(qiáng)度與pH的關(guān)系

式中，I代表585nm處的熒光強(qiáng)度。

由式(1)計(jì)算出探針PRAM 的pKa值為4.30。585nm 處，探針的熒光強(qiáng)度隨pH 增大逐漸減弱，在pH為5.0～6.0區(qū)間內(nèi)，變化最為顯著[如圖4(b)所示]，表明探針PRAM 適合用于弱酸性細(xì)胞器（如溶酶體、腫瘤細(xì)胞）pH變化的檢測(cè)。

2.4 探針PRAM的選擇性和抗干擾性

考慮到其他陽離子可能會(huì)干擾探針對(duì)pH 的準(zhǔn)確檢測(cè)，本文研究了探針PRAM的抗干擾性與選擇性，結(jié)果如圖5所示。圖5(a)表明，當(dāng)pH為5.0時(shí)，探針PRAM 產(chǎn)生明亮的橙紅色熒光；但pH 為7.0時(shí)，對(duì)于空白樣或金屬離子會(huì)顯示出較弱的熒光，可見對(duì)于H+，此探針表現(xiàn)出良好的選擇性。圖5(b)顯示，處于弱酸性（pH為5.0）環(huán)境的各金屬離子溶液相比于中性（pH為7.0）環(huán)境，其熒光發(fā)射明顯增強(qiáng)，表明常見金屬離子的存在，基本不影響對(duì)pH的檢測(cè)效果，可見探針PRAM抗干擾性良好。

圖5 探針PRAM的選擇性和抗干擾性

2.5 探針PRAM的可逆性和重復(fù)使用性

大多數(shù)熒光探針與離子結(jié)合后結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，常不具備檢測(cè)可逆性，導(dǎo)致探針無法重復(fù)利用。為了使探針適應(yīng)復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境，研究探針PRAM的可逆性對(duì)于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞pH 變化有重要意義。因羅丹明內(nèi)酰胺上氧原子可通過質(zhì)子化、去質(zhì)子化影響電子轉(zhuǎn)移，可促進(jìn)并誘導(dǎo)其開環(huán)與閉環(huán)，因此，理論上探針PRAM是可逆的，為了驗(yàn)證其可逆性，本實(shí)驗(yàn)研究了pH 分別為3.0 和7.0 時(shí)，探針PRAM 的可逆性，如圖6所示。在pH=3.0時(shí)，探針PRAM熒光為“ON”態(tài)，發(fā)出強(qiáng)橙紅色熒光；pH=7.0 時(shí)其熒光為“OFF”態(tài)，熒光幾乎消失。在pH為3.0和7.0進(jìn)行7次循環(huán)調(diào)節(jié)后，熒光強(qiáng)度衰減率僅為6.25%，可見探針PRAM在可逆性方面表現(xiàn)良好，可以重復(fù)循環(huán)使用。

圖6 探針PRAM在585nm處的熒光強(qiáng)度在pH為3.0和7.0下的變化

2.6 生物細(xì)胞成像

研究了探針PRAM 在TM3 細(xì)胞中的熒光成像，結(jié)果如圖7 所示。圖7 表明，沒有探針PRAM 加入和只有探針PRAM加入的TM3細(xì)胞中都無熒光呈現(xiàn)；然而，當(dāng)pH=4.0 時(shí)，探針于TM3 細(xì)胞中發(fā)射出明亮的紅色熒光；在pH=5.0 條件下，探針PRAM 在TM3細(xì)胞內(nèi)可顯示較暗的紅色熒光；當(dāng)pH提升至6.0或7.0 時(shí)，TM3 細(xì)胞中基本沒有熒光。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，探針PRAM容易進(jìn)入細(xì)胞，透膜性優(yōu)良，同時(shí)酸性環(huán)境下能夠發(fā)射明亮的紅色熒光，可實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞內(nèi)pH 變化的熒光成像。因此，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)活細(xì)胞實(shí)時(shí)pH變化的可視化監(jiān)測(cè)具有潛在應(yīng)用前景。

圖7 TM3細(xì)胞的熒光成像

3 結(jié)論

以羅丹明B、水合肼和丙烯酰胺等為原料，設(shè)計(jì)合成了一種含羅丹明內(nèi)酰胺基團(tuán)的高分子pH 熒光探針PRAM。其pKa值為4.30，在pH為3.0～7.0范圍內(nèi)，對(duì)H+有較好的選擇性和靈敏度，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)體系pH 變化。在pH 為5.0～6.0 范圍內(nèi)，其熒光強(qiáng)度與pH 具有良好的線性關(guān)系，可精確測(cè)定體系的pH。探針PRAM 在常見的金屬離子存在下，仍具有良好的選擇性和抗干擾性。同時(shí)還具備很好的可逆性和重復(fù)利用性。探針PRAM的水溶性、膜透性突出，弱酸性條件下可快速穿透細(xì)胞膜，并成功實(shí)現(xiàn)了TM3活細(xì)胞pH變化的熒光成像。因此，探針PRAM 可用于弱酸環(huán)境下的細(xì)胞器（如溶酶體、癌細(xì)胞等）內(nèi)生理pH 變化的檢測(cè)，對(duì)研究細(xì)胞生理功能和疾病診斷具有重要意義。