三金通淋排石顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究*

唐莉華 黃學(xué)娣 蔣司晨 李 凡

三金通淋排石湯是院內(nèi)泌尿外科依據(jù)經(jīng)典名方八正散合岳美中老中醫(yī)驗(yàn)方三金二石湯,同時(shí)結(jié)合科室多年臨床經(jīng)驗(yàn)化裁而成[1,2],具有清熱利濕、通淋排石、涼血止血之功效,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐應(yīng)用,其療效確切、安全性高,已成為院內(nèi)臨床治療濕熱蘊(yùn)結(jié)證之石淋的協(xié)定處方。由于該方傳統(tǒng)水煎劑質(zhì)量不穩(wěn)定,無(wú)法滿足臨床患者的治療需求,現(xiàn)利用現(xiàn)代化制藥技術(shù),對(duì)三金通淋排石湯進(jìn)行顆粒制劑工藝的研究,但仍未建立其制劑相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。為了建立三金通淋排石顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),本研究參考《中華人民共和國(guó)藥典》[3]和文獻(xiàn)研究[4,5],應(yīng)用薄層色譜法建立了三金通淋排石顆粒中炒梔子和雞內(nèi)金的定性鑒別方法,同時(shí)利用高效液相色譜法建立了三金通淋排石顆粒指標(biāo)性成分梔子苷的含量測(cè)定方法,保障中藥顆粒制劑質(zhì)量可控性的同時(shí),提高了臨床用藥的安全性和有效性,為醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器(Agilent 1260);電子分析天平(FA2204B,濟(jì)南歐萊博技術(shù)有限公司);恒溫干燥箱(DHG-9146A,蘇州威爾試驗(yàn)用品有限公司);超聲波清洗機(jī)(SAKEZI-22SX,上海佰博儀器有限公司);硅膠G板(青島海洋化工,0.20～0.25 mm)、硅膠GF254板(青島海洋化工,0.20～0.25 mm),聚酰胺薄膜(浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠);甲醇、乙腈為色譜純,磷酸為分析純,水為超純水;梔子苷對(duì)照品(批號(hào):110749-201919)、雞內(nèi)金對(duì)照藥材(批號(hào):121153-201002),由中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)入;三金通淋排石顆粒(批號(hào):001、002、003,自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒梔子中梔子苷的鑒別

2.1.1 供試品溶液的制備取本品5 g,研細(xì)后,加50%甲醇50 ml,超聲處理40 min,濾過(guò)后并蒸干,殘?jiān)铀?5 ml使之溶解,再用乙酸乙酯振搖并提取3次,每次用量為20 ml,合并提取液后蒸干,殘?jiān)蛹状? ml溶解,即為供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備取梔子苷的對(duì)照品,加甲醇制成1 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.1.3 缺炒梔子陰性對(duì)照品溶液的制備稱取缺炒梔子的陰性樣品適量,按照“2.1.1”項(xiàng)下同法制成缺炒梔子的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 專屬性鑒別按照薄層色譜法[3]實(shí)驗(yàn),吸取上述供試品溶液、缺炒梔子陰性對(duì)照品溶液各10 μl、對(duì)照品溶液8 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開劑,展開后取出并晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置于日光下檢視。從梔子苷色譜圖中可以看出,三金通淋排石顆粒樣品與梔子苷對(duì)照品相應(yīng)的位置上,均可見相同顏色的斑點(diǎn),缺炒梔子陰性對(duì)照品相應(yīng)位置上未出現(xiàn)干擾影響,說(shuō)明該方法專屬性良好。見圖1。

注:1,2,5.供試品;3.對(duì)照品;4.陰性對(duì)照品。圖1 炒梔子中梔子苷TLC圖譜

2.2 雞內(nèi)金的鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備取本品1.5 g,研細(xì),加乙醇50 ml,加熱回流30 min,放冷后過(guò)濾,濾液蒸干,殘?jiān)铀?0 ml,微熱使溶解,用三氯甲烷分別提取2次,每次用量為15 ml,合并提取液后蒸干,殘?jiān)蛹状? ml使之溶解,即為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備取雞內(nèi)金的對(duì)照藥材1 g,按照“2.2.1”項(xiàng)下同法制成對(duì)照品的溶液。

2.2.3 缺雞內(nèi)金陰性對(duì)照品溶液的制備稱取缺雞內(nèi)金的陰性樣品適量,按照“2.2.1”項(xiàng)下同法制成缺雞內(nèi)金的陰性對(duì)照品溶液。

2.2.4 專屬性鑒別按照薄層色譜法[3]實(shí)驗(yàn),吸取上述供試品溶液、缺雞內(nèi)金陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液各10 μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶4∶1.6)為展開劑,展開后取出并晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置于紫外光燈(365 nm)下檢視。從雞內(nèi)金色譜圖中可以看出,三金通淋排石顆粒樣品與雞內(nèi)金對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上,均可見相同顏色的熒光斑點(diǎn),缺雞內(nèi)金陰性對(duì)照品相應(yīng)位置上未出現(xiàn)干擾影響,說(shuō)明該方法專屬性良好。見圖2。

注:1,2,5.供試品;3.對(duì)照品;4.陰性對(duì)照品圖2 雞內(nèi)金TLC圖譜

2.3 梔子苷的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件色譜柱為Welch C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(10∶90)為流動(dòng)相。流速:1.0 ml/min,柱溫:30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng):238 nm,進(jìn)樣量:10 μl,理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)應(yīng)不低于1500。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備取梔子苷的對(duì)照品適量,精密稱定后加入甲醇,制成1 ml含梔子苷60 μg的溶液,即得對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備取三金通淋排石顆粒適量,研細(xì)后取約1 g,精密稱定后加入甲醇50 ml,再精密稱定重量,超聲處理20 min(功率350 W,頻率50 kHz),放冷后稱定重量,再使用甲醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻后再過(guò)濾,留取續(xù)濾液,即得供試品溶液。

2.3.4 陰性對(duì)照品溶液的制備按照三金通淋排石顆粒處方和工藝制備方法,制成缺炒梔子的樣品,再按照“2.3.3”項(xiàng)下同法制備,即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3.5 專屬性試驗(yàn)精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液以及缺炒梔子的陰性對(duì)照品溶液各10 μl,按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件,分別進(jìn)行測(cè)定后記錄色譜圖。見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,梔子苷對(duì)照品色譜(圖3A)與三金通淋排石顆粒供試品溶液色譜(圖3B)在相同保留時(shí)間(梔子苷保留時(shí)間約在14 min)有對(duì)應(yīng)的色譜峰,峰形良好且與其他各峰分離度高,陰性對(duì)照樣品色譜(圖3C)在相同保留時(shí)間(14 min)無(wú)對(duì)應(yīng)的色譜峰。表明本實(shí)驗(yàn)方法專屬性良好,陰性對(duì)照品色譜不干擾本實(shí)驗(yàn)方法的測(cè)定。

圖3 梔子苷對(duì)照品(A) 三金通淋排石顆粒供試品(B)和缺炒梔子陰性樣品(C)

2.3.6 方法學(xué)考察線性關(guān)系。精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液(濃度為41.8 μg/ml)1 μl、2 μl、4 μl、6 μl、8 μl和10 μl,按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)記錄峰面積。以梔子苷的進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程為y=1.4339x+22.69,R2=0.9992。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果表明,梔子苷進(jìn)樣量在130.1～1301.1 ng范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

精密度。實(shí)驗(yàn)精密吸取梔子苷的對(duì)照品溶液10 μl,按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣6次,同時(shí)記錄峰面積,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.58%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果示儀器精密度良好,能滿足三金通淋排石顆粒中梔子苷含量測(cè)定的要求。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。分別取三金通淋排石顆粒(批號(hào):001)6份,每份約1 g,按照“2.3.3”項(xiàng)下同法制備6份供試品溶液,再按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算梔子苷平均含量為2.88 mg/g,RSD為0.94%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果示,該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。稱取三金通淋排石顆粒(批號(hào):001)約1 g,按照“2.3.3”項(xiàng)下同法制備供試品溶液,于室溫下放置0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h以后,分別精密吸取供試品溶液各10 μl,按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)記錄峰面積,計(jì)算RSD為0.73%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果示,供試品溶液在室溫條件下放置24 h,其穩(wěn)定性良好。

加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取三金通淋排石顆粒(批號(hào):001,1 g含梔子苷2.88 mg)6份,精密稱定0.50 g后置錐形瓶中,分別精密加入梔子苷的對(duì)照品溶液1 ml(1 ml含梔子苷1.5555 mg),按照“2.3.3”項(xiàng)下同法,制成加樣回收樣品溶液,再按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)記錄峰面積,計(jì)算加樣回收率平均值為98.75%,RSD為0.61%。見表1。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果示本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度良好。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 樣品的測(cè)定取三金通淋排石顆粒(批號(hào):001、002、003,每批次3份)共9份,每份約1 g,按照“2.3.3”項(xiàng)下同法制備成樣品溶液,再按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)記錄峰面積,計(jì)算三金通淋排石顆粒中梔子苷的平均含量為2.85 mg/g。見表2。

表2 梔子苷的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論與分析

三金通淋排石湯為院內(nèi)長(zhǎng)期協(xié)定處方,隨著臨床廣泛應(yīng)用,湯劑的不足之處愈發(fā)凸顯。中藥顆粒劑是傳統(tǒng)中藥劑型變化的一個(gè)新方向,顆粒劑在生產(chǎn)過(guò)程和臨床應(yīng)用中,繼承了傳統(tǒng)湯劑吸收迅速、起效快的特點(diǎn),又克服了傳統(tǒng)湯劑煎煮不便、用量大、易變質(zhì)等缺點(diǎn),具有質(zhì)量穩(wěn)定、服用方便等優(yōu)點(diǎn)[6]。其處方組成固定、制備工藝的穩(wěn)定性,對(duì)于中藥制劑的質(zhì)量控制,有著不可或缺的作用。

3.1 定性質(zhì)量研究中藥制劑指標(biāo)性成分或物質(zhì)的定性質(zhì)量研究,主要針對(duì)指標(biāo)性成分或物質(zhì)的鑒別,薄層色譜法具有操作簡(jiǎn)單、分析速度快、結(jié)果直觀顯著、成本低廉等特點(diǎn),并且可同時(shí)鑒別多個(gè)樣品,具有分離和鑒別的雙重功能,在中藥制劑定性質(zhì)量控制中有著不可替代的地位[7]。本研究參考《中華人民共和國(guó)藥典》[3]和文獻(xiàn)報(bào)道[8],利用薄層色譜法對(duì)制劑處方中全部飲片進(jìn)行鑒別。其中君藥金錢草、海金沙,臣藥車前子、石韋、萹蓄、瞿麥,佐藥川牛膝在分別選擇指標(biāo)性成分和對(duì)照藥材的情況下,缺陰性樣品與供試品色譜專屬性不強(qiáng),陰性存在干擾;在改變樣品提取方法和展開條件后,其效果仍不明顯,故均未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)采用多因素(薄層板、溫度、濕度)評(píng)價(jià)炒梔子和雞內(nèi)金的定性鑒別方法,其重現(xiàn)性好,耐用性佳,可納入三金通淋排石顆粒的定性質(zhì)量控制。

3.2 定量質(zhì)量研究中藥制劑指標(biāo)性成分的定量質(zhì)量研究,主要針對(duì)飲片指標(biāo)性成分的含量測(cè)定。高效液相色譜法目前在藥品研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控、監(jiān)督等領(lǐng)域有著不可或缺的地位,在藥品真?zhèn)舞b定、指標(biāo)性成分含量測(cè)定、藥品純度監(jiān)測(cè)等方面,已成為藥品檢驗(yàn)的主流分析方法[9]。其適應(yīng)范圍廣、分析速度快、分離效率高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn),也廣泛應(yīng)用于中藥制劑的定量測(cè)定[10]。本研究參考《中華人民共和國(guó)藥典》[3]和文獻(xiàn)報(bào)道[4,5,11,12],君藥金錢草(槲皮素、山柰酚)與臣藥車前子(京尼平苷酸、毛蕊花糖苷)的陰性對(duì)照均存在干擾,不適宜作為三金通淋排石顆粒指標(biāo)性成分的定性研究對(duì)象,故均未納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。由于高效液相色譜法樣品取樣量少,中藥指標(biāo)性成分的濃度通常較低,為了保證所建立的分析方法的可行性與可靠性,通過(guò)方法學(xué)(線性關(guān)系、精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)、回收率實(shí)驗(yàn)等)的驗(yàn)證[13],證明了制劑中梔子苷含量測(cè)定的分析方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定性佳、準(zhǔn)確度高,可納入三金通淋排石顆粒的定量質(zhì)量控制。

3.3 梔子苷含量限度研究《中華人民共和國(guó)藥典》[3]炒梔子項(xiàng)下規(guī)定:水分不得過(guò)8.5%,干燥品含梔子苷(C17H24O10)不得少于1.5%。三金通淋排石顆粒每1 g含炒梔子0.15 g,充分考慮大生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的飲片損耗等因素,梔子苷的轉(zhuǎn)移率以60%為標(biāo)準(zhǔn)(制劑工藝研究梔子苷轉(zhuǎn)移率為67%),得出本品每1 g含梔子苷為1.24 mg。故擬將三金通淋排石顆粒含量限度定為: 每克含炒梔子的量,以梔子苷(C17H24O10)計(jì),不得少于1.24 mg。

本研究運(yùn)用薄層色譜法建立了三金通淋排石顆粒炒梔子和雞內(nèi)金的定性鑒別方法,同時(shí)運(yùn)用高效液相色譜法建立了梔子苷的含量測(cè)定與含量限度,實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便,專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性佳,可用于三金通淋排石顆粒定性定量的質(zhì)量控制。