唐雅園,韋 珍,鄧中霖,戴濤濤,梁朋光,孫 健,何雪梅,*
(1.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,廣西南寧 530007;2.廣西果蔬貯藏與加工新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530007;3.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330096;4.煙臺(tái)黃金職業(yè)學(xué)院,山東煙臺(tái) 265401)
涼粉草,素有“仙草”之稱,為唇形科涼粉草屬一年生草本植物。全世界約有10 種涼粉草屬植物,我國主要有兩種,分別是涼粉草(Mesona chiensisBenth)和小花涼粉草(Mesona parviflora(Benth)Briq)[1]。涼粉草作為食藥同源植物,主要分布在我國兩廣、閩南、云滇等地區(qū),其中廣東增城派潭涼粉草被批準(zhǔn)為國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。據(jù)《中華本草》《全國中草藥匯編》《中藥大辭典》等書中記載,涼粉草性寒、甘淡涼,具有清熱解暑、解熱利尿之功效,主治中暑、丹毒、消渴、高血壓、關(guān)節(jié)疼痛等疾病,目前被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)清熱解毒類中成藥、涼茶、涼粉、功能飲料等[2]。
涼粉草多糖是一種廣泛存在于涼粉草的根莖葉各個(gè)部位的具有凝膠特性的水溶性多糖,是涼粉草中關(guān)鍵生物活性成分之一,占全草干樣的70%[3],具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝護(hù)肝、免疫調(diào)節(jié)等功能[4],還有良好的熱穩(wěn)性和促凝性,在食品和制藥工業(yè)中常被用作增稠劑、穩(wěn)定劑和凝膠劑[5],有廣闊的開發(fā)利用前景。本文結(jié)合國內(nèi)外涼粉草研究現(xiàn)狀,系統(tǒng)性介紹涼粉草多糖提取與分離純化技術(shù),探討涼粉草多糖的結(jié)構(gòu)與流變凝膠特性,并討論涼粉草多糖這一功能成分對(duì)人類健康的影響,以期為涼粉草高值化加工利用提供借鑒。
以涼粉草為原料制備涼粉草多糖,需要經(jīng)過提取、精制、純化等步驟。提取分離后得到的涼粉草粗多糖中還含有蛋白質(zhì)、色素等,采用脫蛋白、脫色、除小分子等精制處理。經(jīng)過精制后的涼粉草多糖,進(jìn)一步采用離子交換色譜法、凝膠滲透色譜法等方法進(jìn)行分級(jí)純化,最終得到均一的多糖組分。制備涼粉草多糖的常見方法和流程如圖1 所示。
圖1 涼粉草多糖提取與分離純化方法和流程Fig.1 Flow chart and methods of extraction and purification of Mesona polysaccharide
涼粉草多糖的提取方法有傳統(tǒng)熱水浸提法、熱水堿液浸提法、酶輔助浸提法、超聲輔助浸提法等。不同提取方法對(duì)涼粉草多糖得率和總糖含量有較大影響,影響多糖得率的因素有堿液濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液固比等,得率范圍在7.05%~43.84%,具體提取方法及評(píng)價(jià)見表1。不同品種及不同產(chǎn)地的涼粉草中多糖含量有一定的差異,其中匍匐型涼粉草的多糖含量明顯高于直立型[6],而來自廣東饒平和福建漳州的涼粉草的多糖含量較高[7]。此外,同一品種不同部位的多糖含量差異極顯著,其中涼粉草葉中多糖含量最高,其次分別為根和莖[8]。不同生長階段的涼粉草的多糖含量也有著顯著差異,特別是在現(xiàn)蕾前期(每年9 月至10 月),全草的多糖積累量達(dá)到最高值[9]。
表1 涼粉草多糖提取方法及評(píng)價(jià)Table 1 Extraction methods for Mesona polysaccharide
涼粉草多糖的精制與純化一般包括粗多糖脫蛋白、脫色、除小分子及粗多糖的分級(jí)純化。采用三氟乙酸法、Savage 法、酶法除去涼粉草多糖中的蛋白質(zhì)。過氧化氫法[15]、活性炭法[25]和樹脂吸附法是涼粉草多糖脫色的傳統(tǒng)方法。陳荔紅等[26]比較活性炭與大孔樹脂對(duì)涼粉草多糖的脫色效果,確定樹脂D301 的脫色效果最佳,多糖脫色率高(超過95%)且損失率低。除小分子等雜質(zhì)一般采用透析袋透析法。涼粉草多糖分級(jí)純化可采用離子交換色譜法、凝膠滲透色譜法等。采用離子交換樹脂(DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Sepharose Fast Flow)結(jié)合鹽梯度將粗多糖的酸性糖組分和中性糖組分分離,凝膠滲透色譜(Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephacryl S-300HR)根據(jù)多糖分子量的不同進(jìn)一步將多糖分離純化。例如,馮濤等[27]采用DEAE Sepharose Fast Flow 從涼粉草多糖中分離得到一個(gè)中性糖組分和兩個(gè)酸性糖組成。
涼粉草多糖為雜聚糖,其組成和結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜,相關(guān)研究國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較少。多糖的結(jié)構(gòu)分為初級(jí)結(jié)構(gòu)(一級(jí)結(jié)構(gòu))和高級(jí)結(jié)構(gòu)(二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu))。多糖初級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括多糖分子量、糖基組成及比例、糖基構(gòu)型、糖苷鍵類型、糖鏈中糖基排列順序、糖鏈的分支位置與長短等。多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括多糖骨架鏈間以氫鍵結(jié)合而形成的各種聚合體、多糖鏈間非共價(jià)結(jié)合形成的聚集體等。由于植物多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、解析難度高、解析技術(shù)水平相對(duì)有限等原因,目前對(duì)涼粉草多糖結(jié)構(gòu)研究主要集中在一級(jí)結(jié)構(gòu)解析。
研究多糖結(jié)構(gòu)首先要分析多糖的糖基組成。涼粉草多糖的糖基組成及比例分析常采用薄層層析[28]、還原胺化試劑衍生-液相色譜[15]、酸輔助熱水解-離子色譜[7]、柱前衍生-超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜[29]、柱前衍生-高效液相色譜-紫外檢測[30]等技術(shù)。堿液浸提法制備的涼粉草多糖含有葡萄糖(Glu)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、核糖(Rib)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖醛酸(GluA)和半乳糖醛酸(GalA),其中多以Glu、Gal 和GalA 為主要糖基成分[30]。
采用離子交換柱、凝膠柱等分離純化方法從涼粉草多糖中進(jìn)一步分級(jí)分離得到一個(gè)中性糖組分(MCP-N)和一個(gè)或多個(gè)酸性糖組分(MCP-A),其中以MCP-A 為主。進(jìn)一步通過凝膠色譜、紅外光譜、甲基化和GC-MS 分析、核磁共振等現(xiàn)代波譜分析手段確定了涼粉草糖組分的一級(jí)結(jié)構(gòu)。多糖提取、分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定方法的差異會(huì)導(dǎo)致涼粉草多糖結(jié)構(gòu)表征的差異,具體涼粉草多糖分級(jí)純化及其糖組分特征結(jié)構(gòu)描述見表2。涼粉草MCP-N 和MCP-A 的糖環(huán)構(gòu)型均呈現(xiàn)吡喃型,其中MCP-N 多以β-糖苷鍵連接,而MCP-A 中同時(shí)含有α-和β-糖苷鍵。
表2 涼粉草多糖分級(jí)純化及其糖組分特征結(jié)構(gòu)Table 2 Characteristic structures of isolated and purified Mesona polysaccharide
此外,通過掃描電鏡、X 射線衍射等手段對(duì)涼粉草多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步探索。董偉等[14]采用掃描電鏡分析了堿液浸提法制備的涼粉草多糖的超微結(jié)構(gòu),觀察到多糖表面疏松且有很多密集氣孔,呈雪花狀,層層疊起,還有很多細(xì)小顆粒附在片狀物質(zhì)表面,使多糖呈現(xiàn)較為蓬松質(zhì)輕的形態(tài)。Xiao 等[33]采用X 射線衍射技術(shù)分析涼粉草多糖,結(jié)果顯示,涼粉草多糖具有非晶體結(jié)構(gòu),且X 衍射曲線呈光束狀。
涼粉草多糖具有獨(dú)特的流變凝膠性質(zhì),能在液體狀態(tài)下呈牛頓流體(低濃度)或假塑性流體(高濃度)。涼粉草多糖的結(jié)構(gòu)特征決定了其流變凝膠特性。與MCP-N 相比,MCP-A 富含GalA,且具有一定的流變特性,而MCP-N 幾乎不具有流變特性,推測涼粉草多糖的流變特性差異與其結(jié)構(gòu)中糖醛酸含量密切相關(guān)[27]。涼粉草酸性多糖含有α-(1→4)-半乳糖醛酸骨架及α-1,2-鼠李糖殘基(圖2),推測這一特殊的糖基連接方式使涼粉草多糖具備一定的凝膠特性[31]。
圖2 涼粉草酸性多糖的主要結(jié)構(gòu)[31]Fig.2 Main structure of Mesona acidic polysaccharide[31]
另外,已有研究證實(shí),單一的涼粉草多糖溶液的黏度不足以單獨(dú)形成凝膠。涼粉草多糖需要與小麥[34]、大米[35]、木薯[36]、紅薯[37]、玉米[38]、山藥[39]等來源的淀粉類成分和大豆[40]、乳清[41]等來源的蛋白類成分相互作用,從而形成具有特殊口感的凝膠。涼粉草多糖與淀粉類、蛋白類成分復(fù)配,會(huì)改善淀粉、蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì),但是涼粉草多糖與不同淀粉、蛋白的相互作用存在顯著差異,且相互作用對(duì)凝膠特性(粘性、強(qiáng)度和硬度)、微觀形貌以及消化特性均有影響。隨著近年來現(xiàn)代分析儀器的應(yīng)用逐漸普及,多糖分子結(jié)構(gòu)檢測分析方法也日趨完善,對(duì)涼粉草多糖結(jié)構(gòu)表征與其流變凝膠特性的研究有望進(jìn)一步深入展開。
降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平是當(dāng)前大健康產(chǎn)業(yè)中的研究熱點(diǎn),而涼粉草多糖已被證實(shí)是一種天然抗氧化劑。涼粉草多糖具有DPPH、ABTS+、羥基、超氧陰離子等自由基清除能力[42]、Fe2+螯合能力及還原力[43-44],并表現(xiàn)出穩(wěn)定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。涼粉草多糖可增加小鼠正常肝細(xì)胞NCTC-1469 和人體肝細(xì)胞LO2 內(nèi)抗氧化酶活性,降低脂質(zhì)過氧化物生成,有效防止DNA 的氧化損傷[45-46]。體內(nèi)模型也證實(shí)涼粉草水提取物能增強(qiáng)高血壓大鼠、糖尿病大鼠體內(nèi)的總抗氧化狀態(tài)[47-48]。此外,李艷萍[49]分析涼粉草生長過程中多糖抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)涼粉草多糖的DPPH 和ABTS+自由基清除能力在現(xiàn)蕾前期(9 月至10 月)達(dá)到較高水平,故建議優(yōu)先采摘9 月至10 月的涼粉草作為抗氧化功能產(chǎn)品的原料。如何提高涼粉草多糖抗氧化活性也是當(dāng)前極有價(jià)值的研究方向。Huang 等[23]采用動(dòng)態(tài)超高壓微射流技術(shù)輔助處理涼粉草多糖,發(fā)現(xiàn)與單一熱水堿液浸提法相比,該技術(shù)使多糖DPPH 和羥基自由基清除能力分別提高了10.18%和41.03%。
植物多糖對(duì)于機(jī)體腸道菌群的組成及功能具有重要的影響。腸道菌群的主要作用底物是不完全消化型多糖,這些多糖在不同酶類的消化及腸道菌群的酵解過程中被轉(zhuǎn)化為乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)及其他代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步發(fā)揮調(diào)節(jié)人體健康的作用[50]。涼粉草多糖可增加免疫抑制小鼠體內(nèi)的瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、顫螺菌屬(Oscillospira)、布勞特氏菌屬(Blautia)以及糞球菌屬(Coprococcus)的相對(duì)豐度以及抑制擬桿菌科(Bacteroidaceae)和擬桿菌屬(Bacteroides)的相對(duì)豐度[51],還能提高小鼠腸道中SCFAs 濃度,促進(jìn)乙酸、丙酸和丁酸生成[51],有利于被腸道微生物有效利用,發(fā)揮其有益作用。此外,涼粉草多糖可增加潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠體內(nèi)的乳酸菌屬(Lactobacillus)和糞球菌屬(Coprococcus)的相對(duì)豐度,抑制螺桿菌屬(Helicobacter)和普氏菌屬(Prevotella)的相對(duì)豐度,修復(fù)腸道菌群失調(diào)[52]。
世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國于2016 年已將Ⅱ型糖尿病預(yù)防作為健康的首要任務(wù)[53],因此亟待開發(fā)預(yù)防和治療糖尿病的功能產(chǎn)品。涼粉草在《中國藥植圖鑒》和《中藥大辭典》中早已有“治療糖尿病”的記載。馮白茹等[54]以涼粉草為原料研發(fā)降血糖制劑,發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)品對(duì)Ⅱ型糖尿病患者有較好的治療效果,且沒有明顯的毒副作用。α-葡萄糖苷酶在人體糖代謝過程中發(fā)揮著重要作用,涼粉草多糖被證實(shí)具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制能力,或可被開發(fā)成天然α-葡萄糖苷酶抑制劑[55-56]。不同產(chǎn)地的涼粉草提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性各有差異[57]。來自廣東饒平產(chǎn)地的涼粉草多糖樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果最佳,IC50值為19.49 μg/mL[7]。涼粉草多糖推測還具有促進(jìn)葡萄糖氧化分解和糖原合成、抑制糖異生等作用[58]。涼粉草降血糖的功效機(jī)制目前尚不明確,有待研究人員的進(jìn)一步深入研究。
血脂異常是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。近年來,食藥同源食品的降血脂功效受到廣泛的關(guān)注,具有輔助降血脂作用的涼粉草具有很大的開發(fā)前景[59]。涼粉草多糖通過激活機(jī)體絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5'-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路[60],改善小鼠的脂蛋白含量和結(jié)構(gòu)(包括降低甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白以及提高高密度脂蛋白),調(diào)節(jié)脂質(zhì)運(yùn)輸,進(jìn)而有效提高脂質(zhì)代謝能力。此外,涼粉草多糖可降低小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù),改善血液流變學(xué)異常[61],糾正血脂異常,表明涼粉草可作為動(dòng)脈粥樣硬化的輔助劑。
肝臟是人體內(nèi)最重要的代謝和解毒器官[62],肝臟疾病是一個(gè)全球性的健康問題,然而目前用于治療和預(yù)防肝損傷的藥物功效作用有限,且副作用多[63],因此開發(fā)有效安全的保肝護(hù)肝功能產(chǎn)品迫在眉睫。有研究報(bào)道,涼粉草水提取物可抑制大鼠肝纖維化[64]。涼粉草多糖能有效緩解酒精性肝損傷,且呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系,主要是其多糖具有抑制肝臟氧化應(yīng)激作用,降低肝臟細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,局部清除羥基、超氧陰離子等自由基[65]。此外,涼粉草多糖還能改善四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的和環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,Cy)誘導(dǎo)的急性肝損傷,主要是其多糖有效提高肝臟內(nèi)抗氧化酶活性,抑制肝臟內(nèi)促炎因子水平,降低血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量[51,66]。通過體內(nèi)體外肝損傷模型、16S 核糖體RNA(16S rRNA)基因測序、靶向和非靶向代謝組學(xué)等現(xiàn)代檢測分析手段,系統(tǒng)性闡明涼粉草多糖的保肝護(hù)肝機(jī)制可能源于其能有效清除自由基并恢復(fù)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng),有效控制機(jī)體炎癥水平,亦或是源于其能有效調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu),增加有益菌和減少有害菌的相對(duì)豐度,影響腸道微生物代謝(包括SCFAs)、花生四烯酸代謝等通路[67],如圖3 所示??梢?,涼粉草多糖對(duì)天然保肝護(hù)肝功能食品的開發(fā)具有較高的應(yīng)用價(jià)值。
圖3 涼粉草多糖保肝護(hù)肝機(jī)理示意圖Fig.3 Schematic diagram showing the function of Mesona polysaccharide in liver protection
植物多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是其最關(guān)鍵的功能活性之一,常常能通過多條途徑、在多個(gè)層面對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用[68]。有研究表明,涼粉草水提取物具有提高機(jī)體免疫的作用[69-70],對(duì)小鼠肉瘤S180 有一定的抑制作用,是一種潛在的天然免疫調(diào)節(jié)劑[71]。黃祥彬等[72]發(fā)現(xiàn)涼粉草水提取物能增強(qiáng)小鼠B 淋巴細(xì)胞活性,促進(jìn)溶血素水平,增加抗體產(chǎn)生,進(jìn)而提高機(jī)體的特異性體液免疫功能。進(jìn)一步有研究確定涼粉草多糖可促進(jìn)Cy 誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的脾T/B淋巴細(xì)胞增殖和脾臟中細(xì)胞因子分泌[73],亦可與刀豆蛋白A 協(xié)同促進(jìn)機(jī)體T 淋巴細(xì)胞增殖。此外,在機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答方面,涼粉草多糖也表現(xiàn)出較強(qiáng)的調(diào)控能力。Shen 等[74]發(fā)現(xiàn)涼粉草多糖可通過與Toll 樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)結(jié)合而促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、吞噬和分泌細(xì)胞因子能力,以增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。Huang 等[75]進(jìn)一步分析涼粉草多糖作用于巨噬細(xì)胞的可能機(jī)制是通過上調(diào)c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38 蛋白激酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)的磷酸化水平而激活MAPK信號(hào)通路,進(jìn)而提高機(jī)體非特異性免疫調(diào)節(jié)能力(圖4)。可見,涼粉草多糖能同時(shí)促進(jìn)機(jī)體的非特異性免疫和特異性(體液和細(xì)胞)免疫功能。
涼粉草多糖具有抗菌活性,能抑制大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等病原微生物的生長[14],具有開發(fā)成食品防腐劑或保鮮劑的潛在價(jià)值。涼粉草多糖還具有一定的抗炎活性,可通過促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子分泌、提高腸粘膜屏障功能、抑制TLR4/MAPK/NF-κB 信號(hào)通路,進(jìn)而緩解葡聚糖硫酸鈉引起的潰瘍性結(jié)腸炎[52]。涼粉草水提取物具有抗血壓作用,Yeh 等[47]確定涼粉草水提取物可有效抑制自發(fā)性高血壓大鼠的血壓上升。
中國涼粉草資源栽培歷史悠久,資源豐富且價(jià)格低廉,已成為我國南方地區(qū)出口創(chuàng)匯的重要農(nóng)副產(chǎn)品之一。根據(jù)加工程度的不同,涼粉草每畝產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益可使農(nóng)民收入達(dá)4000~10000 元/年。自2010年涼粉草被歸為食藥同源資源后,近十多年來,國內(nèi)中藥和食品產(chǎn)業(yè)對(duì)其需求量迅速增加。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),目前國內(nèi)涼粉草每年需求量超過10 萬t[76]。王老吉、加多寶、和其正、黃振龍等知名涼茶品牌都以涼粉草全草為主要原料開發(fā)加工成涼茶飲品。涼粉草多糖也可作為主要添加物開發(fā)加工成黑涼粉、燒仙草、龜苓膏、涼粉草蜜等傳統(tǒng)凝膠類涼粉草產(chǎn)品以及冰淇淋[77]、果凍[78]、布丁、酸奶[79]等新型涼粉草產(chǎn)品。在肉制品方面,涼粉草多糖還可作為兼具抗菌、抗氧化以及凝膠特性的外源性物質(zhì)來改善產(chǎn)品品質(zhì)、降低生產(chǎn)成本和提高凝膠特性,最終有效延長肉制品貨架期[80]。另外,涼粉草多糖與紅薯、木薯淀粉或與大豆分離蛋白復(fù)配,可制備涂膜劑、可食膜等包裝新材料[81-82]。然而作為我國重要的食藥同源植物,當(dāng)前涼粉草高值化加工利用程度仍較低,這極易造成資源浪費(fèi)。
多糖是涼粉草中最重要、含量最豐富的活性成分,對(duì)其進(jìn)行研究開發(fā)具有深遠(yuǎn)的意義。目前相關(guān)研究工作集中于涼粉草多糖提取分離技術(shù)優(yōu)化、流變凝膠特性分析、功能活性評(píng)價(jià)等,然而對(duì)于涼粉草多糖構(gòu)效關(guān)系的研究則尚不明確,關(guān)于涼粉草多糖與腸道菌群互作的研究也較少,未來這些研究方向?qū)⒅饾u成為熱點(diǎn)。此外,逐步優(yōu)化涼粉草多糖提取分離技術(shù),在現(xiàn)有涼粉草產(chǎn)品的基礎(chǔ)上開展細(xì)胞、動(dòng)物、臨床試驗(yàn)等將有助于涼粉草新功能產(chǎn)品的開發(fā)。