乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的研究進(jìn)展

石 賀，于連升,2，齊心彤，錢志剛，闞連寶,*，杜仁鵬,2,,*

（1.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省普通高校微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150080；2.河北環(huán)境工程學(xué)院，河北省農(nóng)業(yè)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066102；3.上海交通大學(xué)，微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

葡聚糖蔗糖酶（Glucansucrase）（EC.2.4.5.1）又稱葡糖基轉(zhuǎn)移酶（Glucosyltransferase，GTF），也稱為蔗糖-6-葡糖基轉(zhuǎn)移酶，是糖苷水解酶70（GH70）家族的一員[1]。葡聚糖蔗糖酶來源廣泛，相較于動(dòng)植物來源的葡聚糖蔗糖酶，微生物分泌的葡聚糖蔗糖酶具有成本低，易獲得等優(yōu)點(diǎn)，并且能夠以蔗糖為底物合成分子量不同的葡聚糖和功能性低聚糖。乳酸菌作為公認(rèn)安全的菌株，產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶分子量在120～200 kDa 左右，是目前生產(chǎn)α-葡聚糖和低聚糖的主要來源菌株。葡聚糖及低聚糖作為潛在的益生元，因卓越的生理功能被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、化工等領(lǐng)域[2-3]。然而天然菌株葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量低、活性較弱，制約其在多種領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，因此開發(fā)新技術(shù)和新方法來提高葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量和活性是目前研究的熱點(diǎn)。

根據(jù)催化產(chǎn)生葡聚糖的種類，葡聚糖蔗糖酶可分為右旋糖酐蔗糖酶（Dextransucrase，DSR）、變聚糖蔗糖酶（Mutansucrases，MSR）[4]、交替糖蔗糖酶（Alternansucrose，ASR）、淀粉蔗糖酶（Amylosucrase，AS）[5]和羅伊糖蔗糖酶（Reuteransucrases，RSR）[6]。能夠產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的菌株包括：明串珠菌屬（Leuconostoc）[7]、乳桿菌屬（Lactobacillus）[8]、魏斯氏菌屬（Weissella）[9]、鏈球菌屬（Strptococcus）[10]、奈瑟氏菌屬（Neisseria）[11]和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）[12]等，其中Leuconostoc是目前葡聚糖蔗糖酶的主要產(chǎn)生菌[13-15]。Leuconostoc為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌落較小，有些菌株可形成莢膜，通常最佳生長(zhǎng)溫度為25 ℃，是一種廣泛應(yīng)用在乳制品中的乳酸菌。腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroide）作為L(zhǎng)euconostoc的主要種屬，包含三個(gè)亞種：腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）、腸膜明串珠菌乳脂亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.cremoris）和腸膜明串珠菌右旋葡聚糖亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.dextranicum）及Ln.mesenteroidessubsp.suionicum[16]。

雖然乳酸菌葡聚糖蔗糖酶來源廣泛，但不同種屬來源的葡聚糖蔗糖酶在結(jié)構(gòu)和功能上具有多樣性，進(jìn)而影響葡聚糖的生物合成過程及功能特性。到目前為止，乳酸菌葡聚糖的生物合成機(jī)制仍未得到解析，因此探究葡聚糖蔗糖酶的結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制及酶學(xué)特性，將有助于全面揭示乳酸菌葡聚糖的生物合成機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系，促進(jìn)糖生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展。

1 葡聚糖蔗糖酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制

1.1 葡聚糖蔗糖酶的結(jié)構(gòu)

葡聚糖蔗糖酶能夠以蔗糖為底物合成不同分子量的α-葡聚糖，不同來源的葡聚糖蔗糖酶的結(jié)構(gòu)具有高度的相似性。同GH13 家族類似，GH70 家族的酶體系構(gòu)架含有（β/α）8管狀結(jié)構(gòu)[17-18]，合成的多糖一般有兩個(gè)特點(diǎn)：分子量大小基本在106Da 以上；糖單元通過不同的共價(jià)鍵連接在一起，如α-1,6、α-1,3、α-1,4、α-1,2 等。由α-1,6 鍵連接的多糖，稱為右旋糖酐，能夠合成右旋糖酐的右旋糖苷蔗糖酶主要存在于Leuconostoc中，其中Ln.mesenteroide葡萄糖蔗糖酶能夠催化合成由α-1,6 糖苷鍵連接的葡萄糖[19]。變形聚糖蔗糖酶首先在變形鏈球菌（Streptococcus mutans）AHT 中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過它合成的變形聚糖具有α-1,3 糖苷鍵[13]。Ln.mesenteroideNRRL B-1355分泌的交替蔗糖酶可催化由α-1,3 和α-1,6 糖苷鍵交替連接的糖的合成[20]。1990 年科學(xué)家們成功在體外表達(dá)了高純度的葡萄糖蔗糖酶，并建立出葡聚糖蔗糖酶的立體結(jié)構(gòu)。葡聚糖蔗糖酶含有四個(gè)主要功能區(qū)：N 端信號(hào)肽（SP）、N 端可變區(qū)（VR）、N 端催化結(jié)構(gòu)域（CD）和位于C 端的葡萄糖結(jié)合域（GBD）[21]。

a.N 端信號(hào)肽區(qū)：N 端信號(hào)肽區(qū)的存在是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的一個(gè)典型特征。大多數(shù)葡聚糖蔗糖酶分子的末端都有一個(gè)由32～38 個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽。這個(gè)區(qū)域是高度保守的，不同來源的葡聚糖蔗糖酶的釋放模式幾乎相同[22]。

b.N 端可變區(qū)域：在N 端信號(hào)肽區(qū)之后的是一個(gè)由140～261 個(gè)氨基酸殘基組成的區(qū)域，因?yàn)檫@個(gè)區(qū)域具有高的變異性，人們推測(cè)它可能帶有葡聚糖蔗糖酶所特有的序列。然而，也有報(bào)道說這個(gè)區(qū)域在蛋白質(zhì)分子中不是特別重要[23]。

c.N 端催化區(qū)：在N 端可變區(qū)域之后的部分是一個(gè)高度保守的由950 個(gè)左右的氨基酸殘基組成的序列，稱為N 端催化區(qū)，能夠進(jìn)行蔗糖的催化水解作用。

d.C 端葡萄糖結(jié)合域：葡聚糖蔗糖酶的末端存在的一個(gè)大約由500 個(gè)氨基酸殘基組成的葡萄糖結(jié)合域，包含幾個(gè)同源的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)和數(shù)量隨葡聚糖蔗糖酶的不同而變化[24]。

1.2 葡聚糖蔗糖酶的催化機(jī)制

對(duì)于葡聚糖蔗糖酶催化機(jī)制，研究者們一直持有不同的觀點(diǎn)，1974 年Robyt 等基于右旋糖酐蔗糖酶的催化反應(yīng)提出了雙位點(diǎn)插入機(jī)制，也叫做還原端延伸機(jī)制，在該機(jī)制中存在兩個(gè)活性位點(diǎn)，一個(gè)位點(diǎn)形成葡糖基-酶中間體，另一個(gè)位點(diǎn)形成糖鏈-酶中間體，糖鏈-酶中間體中的C1 位會(huì)攻擊葡糖基的C6位，形成α-1,6 糖苷鍵，從而使糖鏈得到延伸[25-26]。但該機(jī)制并沒有探明如何利用氨基酸殘基進(jìn)行催化反應(yīng)。隨著研究的不斷深入，研究人員對(duì)這一機(jī)制進(jìn)行了更新和補(bǔ)充，重點(diǎn)關(guān)注氨基酸殘基，主要是親和性殘基、酸堿催化殘基和過渡態(tài)穩(wěn)定殘基[27]。在酶的催化反應(yīng)過程中包括兩個(gè)重要途徑：首先，合成葡萄糖基。該步由谷氨酸催化形成一個(gè)β-D-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)，并且釋放出果糖，它的過渡態(tài)穩(wěn)定和殘基穩(wěn)定；其次：去質(zhì)子化。通過去質(zhì)子化將糖基分子轉(zhuǎn)移到活性受體，攻擊糖甘環(huán)的異頭C1 原子和天冬氨酸之間的共價(jià)鍵，保守的酪氨酸殘基位于催化中心之外，這種口袋活性部位也存在于多糖核糖酶中[28]。此研究結(jié)果不僅從氨基酸水平上解釋了葡聚糖蔗糖酶合成糖的機(jī)理，對(duì)研究葡聚糖蔗糖酶的結(jié)構(gòu)也具有重要作用，葡聚糖蔗糖酶的催化機(jī)制如圖1 所示。

圖1 葡聚糖蔗糖酶催化機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the catalysing mechanism of glucansucrase

1.3 葡聚糖蔗糖酶的應(yīng)用

乳酸菌分泌的葡聚糖蔗糖酶可催化胞外同源多糖如葡聚糖、果聚糖等的合成。經(jīng)它合成分泌的右旋糖酐是凝膠柱的主要成分，在醫(yī)學(xué)上也是一些藥物的良好載體，在肝臟移植中是肝臟運(yùn)輸途中良好的保護(hù)液，它還能抗氧化、抗腫瘤，預(yù)防腫瘤的發(fā)生和惡化[29]。最近的報(bào)告表明，乳酸菌葡聚糖蔗糖酶合成的胞外多糖含有磷酸基團(tuán)和硫酸基團(tuán)等結(jié)構(gòu)，已被證明具有抗炎作用[30]。乳酸菌葡聚糖作為一種新型的天然食品添加劑，能夠調(diào)節(jié)腸道微生物的生長(zhǎng)，應(yīng)用在酸奶、奶酪和奶制甜點(diǎn)的工廠發(fā)酵生產(chǎn)中，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)地、口感、味道和最終產(chǎn)品的穩(wěn)定性方面起著重要作用[31]。

葡聚糖蔗糖酶不僅能夠水解蔗糖通過葡糖基轉(zhuǎn)苷作用合成葡聚糖，還能通過酶合成法利用其具有的轉(zhuǎn)糖基功能，在底物為高濃度的蔗糖時(shí)，通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件葡聚糖蔗糖酶能合成一種既耐熱又耐酸的低聚糖，功能性低聚糖不易被消化道分解，能夠在腸道中發(fā)揮獨(dú)特的生理功能[32]。通過酶合成法合成的低聚糖是一種潛在的益生元，具有改善糖尿病癥狀、減輕胰島素抵抗、減少腸道炎癥等益處，在營(yíng)養(yǎng)保健等研究中受到廣泛關(guān)注[33]。

2 乳酸菌葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量?jī)?yōu)化

由于乳酸菌葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量較低，限制其工業(yè)化應(yīng)用，因此提高乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量是拓展其應(yīng)用范圍的基礎(chǔ)。根據(jù)菌株特性及酶學(xué)性質(zhì)，提高葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量可以從不同的角度進(jìn)行，首先篩選能夠高產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的乳酸菌，豐富產(chǎn)酶菌株來源；其次，通過優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件，提高酶的產(chǎn)量；再者，通過基因工程的方法構(gòu)建工程菌株，例如利用基因敲除技術(shù)切斷菌株分支代謝途徑，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建異源表達(dá)菌株等，對(duì)乳酸菌來說，不同的培養(yǎng)基組成可以導(dǎo)致合成的葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量存在顯著差異。本文通過對(duì)菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化以提高葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響進(jìn)行了總結(jié)，如表1 所示。

表1 培養(yǎng)基組成對(duì)葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響Table 1 Effect of medium composition on yield of glucansucrase

2.1 培養(yǎng)基組成對(duì)葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響

對(duì)乳酸菌來說，不同的培養(yǎng)基組成可以導(dǎo)致合成的葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量存在顯著差異（表1）。碳源是影響乳酸菌產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的一個(gè)重要因素，乳酸菌利用糖類，例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖等作為碳源生產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶[34]。Shukla 等[35]研究不同碳源對(duì)戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）CRAG3 發(fā)酵產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的影響進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)濃度為5%的蔗糖作為碳源時(shí)葡聚糖蔗糖酶活性最高。先前的研究中，課題組通過單因素實(shí)驗(yàn)研究不同碳源對(duì)Ln.mesenteroideDRP2-19 葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的碳源例如葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖等對(duì)葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量影響較大，當(dāng)?shù)孜餅?%蔗糖時(shí)，酶的活性提高了8.4%[36]。張皓等[37]從泡菜中篩選得到了一株產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的菌株Leuconostocsp.NW02，發(fā)現(xiàn)其分泌的葡聚糖蔗糖酶在蔗糖濃度為8%時(shí)，菌株生長(zhǎng)最好，蔗糖濃度為10%時(shí)，酶的產(chǎn)量最大。蔗糖不僅作為菌株生長(zhǎng)代謝的碳源，同時(shí)作為葡聚糖蔗糖酶的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)菌株分泌該酶。

氮源也是影響菌株產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的主要因素，Shukla 等[38]探究了氮源對(duì)融合魏氏魏氏菌（Wei-ssella confusa）葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)酵母提取物是菌株產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶最有效的氮源，但高濃度的酵母提取物會(huì)抑制葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)生。此外，隨著蛋白胨的濃度增加，葡聚糖蔗糖酶的含量先上升后下降。Das 等[39]通過單因素實(shí)驗(yàn)研究了酵母提取物、蛋白胨和牛肉提取物等不同氮源對(duì)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）DM5 產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的影響。研究發(fā)現(xiàn)，酵母提取物是菌株產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的最有效氮源。這與其他報(bào)道一致，其中的酵母提取物在生產(chǎn)葡糖蔗糖酶過程中作為維生素和氨基酸補(bǔ)充劑的來源[40-41]。

無機(jī)鹽是培養(yǎng)基中不可缺少的成分，是影響乳酸菌產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的主要因素。課題組在先前研究中，探究不同因素對(duì)Ln.mesenteroideDRP2-19 的葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cu2+、Co2+、Fe3+、Ca2+、Na+、K+能夠促進(jìn)Ln.mesenteroideDRP2-19 葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量，其中在0.2 mmol/L 的Ca2+條件下，葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量最高，而Hg2+會(huì)抑制葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量[36]。Shukla 等[38]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸鈉的濃度低于0.05%，對(duì)葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量沒有影響，當(dāng)乙酸鈉的濃度超過0.05%時(shí)，酶的產(chǎn)量降低，而Sawale 等[42]報(bào)道乙酸鈉能夠促進(jìn)Ln.mesenteroide產(chǎn)生葡聚糖蔗糖酶。磷酸鹽是細(xì)菌良好的磷源，在培養(yǎng)基中常加入一些無機(jī)鹽也可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的滲透壓并在培養(yǎng)基中具有緩沖作用。同樣，對(duì)于不同種類的磷酸鹽，葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量也不同。在0.6% K2HPO4下觀察到葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量顯著增加。在不同濃度的乙酸鈉下記錄的酶活性表明，當(dāng)其濃度為0.6%時(shí)酶的產(chǎn)量最大。Shukla等[38]的試驗(yàn)也顯示出了1.5%（w/v）的K2HPO4對(duì)葡聚糖蔗糖酶生產(chǎn)是最佳的，K2HPO4超過1.5%（w/v），葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量下降。這些鹽可能通過維持三維蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，將酶的活性位點(diǎn)保持在穩(wěn)定狀態(tài)，從而提高葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量[42]。

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響

除了培養(yǎng)基組成之外，培養(yǎng)條件如pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、溫度等都對(duì)乳酸菌葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量有影響（表2）。先前研究中課題組發(fā)現(xiàn)，不同pH 對(duì)菌株DRP2-19 葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量有不同的影響，在pH6.0 條件下發(fā)酵30 h，葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量最大。然而，酸性（pH＜4.5）或堿性（pH＞7）條件會(huì)抑制菌株產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶[36]。趙博[43]在進(jìn)行產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶培養(yǎng)基條件優(yōu)化中研究了培養(yǎng)基pH 對(duì)菌株Ln.citreumB-2 產(chǎn)酶能力的影響，發(fā)現(xiàn)在pH 為6.0 時(shí)葡聚糖蔗糖酶的酶活最高。這些研究證明偏中性環(huán)境可能更有利于菌株葡聚糖蔗糖酶的合成和積累。因此，通過調(diào)整培養(yǎng)基初始pH 或控制發(fā)酵過程中pH 可以有效影響葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量，在培養(yǎng)過程中，通常向培養(yǎng)基中添加緩沖鹽，使pH 保持在菌種最適生長(zhǎng)和代謝物積累的范圍從而提高酶的產(chǎn)量。此外，pH 的改變會(huì)影響葡聚糖蔗糖酶活性中心上必需基團(tuán)的解離程度，從而影響葡聚糖蔗糖酶與底物的結(jié)合和催化作用，導(dǎo)致催化產(chǎn)物的含量發(fā)生改變。

表2 培養(yǎng)條件對(duì)葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of culture conditions on yield of glucansucrase

搖床轉(zhuǎn)速不僅會(huì)影響菌株發(fā)酵過程中溶氧量，還可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生裂解。課題組先前研究了不同轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DRP105 產(chǎn)生葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明菌株在120 r/min 培養(yǎng)時(shí)，葡聚糖蔗糖酶產(chǎn)量最高，而在較低轉(zhuǎn)速下，酶的產(chǎn)量下降[44]，而菌株DRP2-19 在100 r/min 孵育時(shí)葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量達(dá)到最大值[36]。接種量影響菌株生長(zhǎng)代謝進(jìn)程，菌株DRP105 在接種量為4%時(shí)葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量達(dá)到最大值[44]。劉歡[45]在研究乳酸菌產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的發(fā)酵條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為4%時(shí)，葡聚糖蔗糖酶的產(chǎn)量略高于其他條件。

溫度是影響菌株產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的重要因素，乳酸菌生產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的最佳溫度范圍為20～40 ℃[36]。Du 等[44]發(fā)現(xiàn)菌株DRP105 在30 °C 時(shí)葡聚糖蔗糖酶的活性最高。課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，菌株DRP2-19 生產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶的最佳溫度范圍為25～30 ℃[36]，這可能是由于不同菌株的最適生長(zhǎng)條件不同，其生物合成代謝過程不同，從而影響葡聚糖蔗糖酶的分泌。

3 葡聚糖蔗糖酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)

3.1 葡聚糖蔗糖酶的分離純化

在最適產(chǎn)酶條件下，菌株生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生并分泌分泌到細(xì)胞外葡聚糖蔗糖酶，通過收集發(fā)酵液上清、酶蛋白沉淀、透析、層析純化和濃縮等多個(gè)步驟獲得葡聚糖蔗糖酶純品。用來沉淀葡聚糖蔗糖酶的方法包括硫酸銨沉淀、超濾法和聚乙二醇（PEG）沉淀等方法。硫酸銨沉淀也被稱為鹽沉淀，是最普遍用于沉淀葡聚糖蔗糖酶的方法，因?yàn)椴煌鞍踪|(zhì)溶解度不同，可利用不同濃度的鹽溶液來達(dá)到沉淀不同蛋白質(zhì)的目的，這種沉淀方法具有溶解度高，溫度系數(shù)低，蛋白質(zhì)不容易變性失活等優(yōu)點(diǎn)[46]。聚乙二醇具有良好的水溶性并且與許多有機(jī)成分有良好的兼容性。但是聚乙二醇沉淀法易受到過量脂質(zhì)、離心溫度和pH 變化的影響，且單獨(dú)使用時(shí)非特異性結(jié)合程度高，常與其他方法結(jié)合使用[47]。獲得粗酶后需要繼續(xù)利用相關(guān)技術(shù)進(jìn)一步分離純化，例如凝膠過濾層析、離子交換層析、超濾濃縮等。Song 等[48]通過聚乙二醇沉淀、離子交換色譜和凝膠過濾分離純化Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶，酶的純度為原來的13.2 倍，回收率為8.7%，蛋白質(zhì)的比活性為1.4 U/mg。馬亞君[49]利用離子交換層析和Sepharose CL-6B 凝膠層析等方法純化葡聚糖蔗糖酶，最終得到純酶的比酶活由0.15 U/mg 提高到1.27 U/mg，純化倍數(shù)為原來的8.64 倍，蛋白回收率為8.69%。趙博[43]采用經(jīng)過DEAE-Sepharose FF 等純化步驟處理Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶，最終酶活為（200.01±5.33）U/mL，純化倍數(shù)最終可達(dá)（4.31±1.34）倍。Guzman 等[50]將Ln.mesenteroidesIBUN 91.2.98 葡聚糖蔗糖酶固定在物葡聚糖中，并通過超濾濃縮和陰離子交換層析對(duì)酶進(jìn)行純化，純化后的葡聚糖蔗糖酶的比活為335.1 U/mg。

3.2 葡聚糖蔗糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

葡聚糖蔗糖酶作為乳酸菌的初級(jí)代謝物產(chǎn)物，在發(fā)揮催化特性時(shí)易受到多種因素例如溫度，pH，金屬離子等的影響。

3.2.1 溫度對(duì)酶活性的影響 溫度不僅影響酶蛋白的活性和催化反應(yīng)的速率，也會(huì)影響酶的穩(wěn)定性。Das 等[39]報(bào)道植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）葡聚糖蔗糖酶活性在27 ℃時(shí)最大，為2.71 U/mL，當(dāng)溫度升高到27 ℃以上時(shí)，酶活性降低，在20 ℃時(shí)，酶活性降低了35%，這可能是由于細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，從而導(dǎo)致酶產(chǎn)量降低。Song 等[48]獲得比活力為3.6 U/mg 的Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶，其最適溫度為45 ℃，在50 ℃孵育0.5 h 后，葡聚糖蔗糖酶的殘余活性約為40%。馬亞君[49]在探究羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）葡聚糖蔗糖酶的酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，葡聚糖蔗糖酶的在25～45 ℃之間保持著較高的酶活，酶的相對(duì)活力保持在70%以上，這說明葡聚糖蔗糖酶在此溫度范圍能保持相對(duì)穩(wěn)定的酶活。因?yàn)榇蠖鄶?shù)酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，超過最適溫度，蛋白質(zhì)就會(huì)變性失活，且活性不能恢復(fù)，所以在研究乳酸菌生產(chǎn)葡聚糖蔗糖酶時(shí)，確定適宜的培養(yǎng)溫度是一個(gè)重要問題。

3.2.2 pH 對(duì)酶活性的影響 葡聚糖蔗糖酶在pH4.5～5.5 之間保持著較高的酶活。Zhao 等[51]在研究Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在pH6.0～8.0時(shí)，葡聚糖蔗糖酶的酶活力保持在原來的90%左右，隨著pH 的升高，葡聚糖蔗糖酶的活性逐漸降低。Song 等[48]在研究pH 對(duì)Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在pH5.0～6.0 的范圍內(nèi)，葡聚糖蔗糖酶活性最大，酶活力均保持在原來的80%以上。張皓等[37]在研究Leuconostocsp.NW02的葡聚糖蔗糖酶的酶學(xué)性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)該酶在pH7.5 時(shí)為最適反應(yīng)pH，在pH7.5～8.0 的條件下保存1 h，酶活力降為原來的60%。可以看出，葡聚糖蔗糖酶在pH 為弱酸性或中性條件下能保持較高的酶活性，具有更好的耐酸性。pH 不僅影響酶蛋白的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，而且對(duì)酶和底物之間的解離狀態(tài)產(chǎn)生影響。只有在一定pH 范圍內(nèi)，酶才能表現(xiàn)較高的催化活性。

3.2.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 金屬離子與酶的活性中心作用進(jìn)而對(duì)酶產(chǎn)生激活或抑制效應(yīng)。先前研究發(fā)現(xiàn)，K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Mg2+和Cr+對(duì)Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶具有明顯的刺激作用，其中Ca2+和Mn2+可顯著促進(jìn)葡聚糖蔗糖酶的活性，其中Ca2+對(duì)酶活的促進(jìn)作用達(dá)到了250%[51]。馬亞君[49]在探究金屬離子對(duì)葡聚糖蔗糖酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，Mg2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、Ca2+、Fe2+和Zn2+能夠提高葡聚糖蔗糖酶的活性，其中Ca2+對(duì)酶活的影響最大，酶活提高了接近4 倍，此外Cu2+、Al3+和Fe3+對(duì)酶活有抑制作用。Song 等[48]發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+和Co2+在內(nèi)的幾種雙電荷離子激活Ln.citreumSK24.002葡聚糖蔗糖酶的活性，其中Mn2+存在下酶活提高了1.2 倍，K+、Ba2+、Mg2+和Ni2+離子幾乎不影響酶活性，而Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+和Al3+離子對(duì)酶有抑制作用，證明該酶是一種金屬激活酶。Ca2+與酶的活性中心作用，是影響葡聚糖蔗糖酶活性的重要金屬離子。

3.2.4 有機(jī)溶劑和化學(xué)抑制劑對(duì)酶活性的影響 有機(jī)溶劑和化學(xué)抑制劑也會(huì)在一定程度上抑制酶的活性，大多數(shù)有機(jī)溶劑可以通過破壞它們的結(jié)構(gòu)，從而抑制酶活性。先前研究證明，有機(jī)溶劑除了苯對(duì)Ln.citreumB-2 葡聚糖蔗糖酶的活性幾乎沒有影響之外，甲醇、乙醇、乙腈等均對(duì)葡聚糖蔗糖酶的活性有抑制作用[51]。Song 等[48]探究有機(jī)溶劑對(duì)Ln.citreumSK24.002 葡聚糖蔗糖酶的活性影響，發(fā)現(xiàn)除丙酮和正己烷存在外，葡聚糖蔗糖酶活性隨著有機(jī)溶劑濃度的增加而降低。有機(jī)溶劑量增加不僅能夠引起pH 變化，還能改變酶的催化活性構(gòu)象。Girard等[52]研究同樣表明，Ln.mesenteroidesNRRL B-512F 葡聚糖蔗糖酶的活性與有機(jī)溶劑性質(zhì)有關(guān)，20%乙腈，50%DMF、丙酮或乙醇和90%二甲基亞砜可以使酶活減少90%。表面活性劑和化學(xué)抑制劑可以通過影響氨基酸的結(jié)構(gòu)而影響酶的活性，幾乎所有的化學(xué)抑制劑和表面活性劑都對(duì)葡聚糖蔗糖酶的活性具有抑制作用，例如十二烷基硫酸鈉、EDTA、SDS、DTT 和β-ME，且隨著化學(xué)抑制劑和表面活性劑濃度的增加，酶的活性急劇下降，在濃度為5 mmol/L 和25 mmol/L 時(shí)酶活極低[51]。研究表明，EDTA 可以和一些金屬離子形成穩(wěn)定的絡(luò)合物破壞酶的活性中心，然而是否會(huì)影響到葡聚糖蔗糖酶的催化特性進(jìn)而影響到胞外多糖的合成，仍然是未來需要探究的問題。

4 結(jié)論與展望

葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖，產(chǎn)生具有良好生物活性和較高利用價(jià)值的糖類化合物，在糖生物學(xué)研究領(lǐng)域和制糖工藝中受到高度重視。從可再生原料中，通過自然反應(yīng)可以生產(chǎn)各種類型的右旋糖酐、葡萄糖基化的寡糖和葡萄糖基化的衍生物，為葡聚糖蔗糖酶的結(jié)構(gòu)和功能之間關(guān)系的研究以及蛋白質(zhì)工程技術(shù)的不斷發(fā)展提供了幫助，并且使葡聚糖蔗糖酶的功能得到了明顯的開發(fā)和利用。新開發(fā)的葡聚糖蔗糖酶能夠進(jìn)行同類型的天然酶無法催化的反應(yīng)，并具有新的特性，使這種催化工具能夠用于生產(chǎn)更廣泛的生物活性糖，如抗生素、激素、生物堿等。為了擴(kuò)大葡聚糖蔗糖酶在生物合成中的應(yīng)用，在今后的研究中可以利用基因工程方法改變酶的功能的突變基因，使其與現(xiàn)有工程乳酸菌的染色體DNA 進(jìn)行同源重組，從而找到具有葡聚糖蔗糖酶的有效工程乳酸菌。此外，還可以通過對(duì)葡聚糖蔗糖酶的氨基酸組成進(jìn)行分析，改變酶蛋白的氨基酸組成，從中可以推測(cè)出催化過程中酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系。除了對(duì)酶在生物合成中的應(yīng)用的探索外，另一個(gè)困難是缺乏關(guān)于酶系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)的知識(shí)，這對(duì)于快速和主動(dòng)的酶工程設(shè)計(jì)是必要的，預(yù)測(cè)突變對(duì)酶結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)的影響仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。