肝細(xì)胞鐵死亡在肝臟相關(guān)疾病的研究進(jìn)展

吳姜杰 齊家龍 宋正己

肝病是全球疾病負(fù)擔(dān)及死亡相關(guān)病因的主要原因之一[1]。在中國(guó),病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及與之相關(guān)的肝硬化、肝癌等各類肝病約有3億人受累[2]。因此,探究肝病的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。

細(xì)胞死亡基于功能方面的差異可分為兩種類型,即意外細(xì)胞死亡(accidental cell death,ACD)和調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡(regulated cell death,RCD)。隨著細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,不同種類的RCD及其核心通路被解析。2012年,Dixon等發(fā)現(xiàn)Erastin的抗癌活性依賴于誘導(dǎo)一種新型調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式,后來被命名為鐵死亡。鐵死亡是鐵依賴活性的RCD,其與經(jīng)典的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬及細(xì)胞壞死具有明顯的差異。在形態(tài)學(xué)上,鐵死亡表現(xiàn)為線粒體變小、外膜破裂、嵴減少或消失;從生物化學(xué)的角度來看,鐵死亡是通過鐵蓄積、過量的活性氧和脂質(zhì)過氧化來介導(dǎo)的[3]。自從鐵死亡這種全新的死亡模式被揭示后,越來越多的證據(jù)顯示鐵死亡在肝病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

一、鐵死亡的核心機(jī)制

(一)鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及其對(duì)鐵死亡的影響 鐵離子是引發(fā)鐵死亡途徑的觸發(fā)因素。膳食中的鐵從十二指腸絨毛上皮細(xì)胞吸收后通過轉(zhuǎn)鐵蛋白及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)導(dǎo)入并被分選到內(nèi)體中,以Fe3+形式由前列腺六跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3,STEAP3)還原為Fe2+,之后通過二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal transport 1,DMT1)釋放到細(xì)胞質(zhì),儲(chǔ)存在不穩(wěn)定的鐵池或鐵蛋白中發(fā)揮作用,多余的Fe2+可通過鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白排泄到細(xì)胞外循環(huán)中[4],以上環(huán)節(jié)共同維持著鐵穩(wěn)態(tài)的平衡。當(dāng)細(xì)胞對(duì)鐵的攝入量增加或鐵的輸出量減少時(shí),都會(huì)使細(xì)胞對(duì)鐵死亡更加敏感。此外,核受體共激活因子4 (nuclear receptor co-activator 4,NCOA4)將鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解[5]。鐵蛋白解鏈后釋放的催化鐵又使細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定鐵水平升高,過載的鐵與過氧化氫發(fā)生芬頓反應(yīng),導(dǎo)致羥基自由基和過氧化物的形成及細(xì)胞膜磷脂的破壞,這是引發(fā)鐵死亡的重要機(jī)制。

(二)脂代謝及其對(duì)鐵死亡的影響 脂質(zhì)過氧化是鐵死亡的典型征象,包括兩大途徑。在非酶促反應(yīng)中,磷脂中多不飽和脂肪酸(PUFA-PLS)的二烯丙基位置與氫結(jié)合,形成以碳為中心的磷脂自由基(PL·),隨之又與氧反應(yīng)形成磷脂過氧化物自由基(PL-OO·),然后從其他多不飽和脂肪酸中獲取氫生成脂質(zhì)過氧化物(PLOOH)和脂質(zhì)自由基(PL·)[6]。相比之下,酶促反應(yīng)主要由脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)執(zhí)行,可催化PUFA的雙氧反應(yīng)以產(chǎn)生各種PLOOH[7]。在此之前,游離多不飽和脂肪酸可以激活?；o酶 A 合酶長(zhǎng)鏈家族成員4(acyl-coA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)進(jìn)行酯化,并通過溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶 3(recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)與膜磷脂結(jié)合,ACSL4上調(diào)被認(rèn)為是鐵死亡的生物標(biāo)志物[8]。脂代謝異常最終產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物會(huì)改變脂質(zhì)雙層的物理性質(zhì),同時(shí)分解為反應(yīng)性毒物(如4-羥基-2-壬烯醛和丙二醛),這些醛類可通過交聯(lián)促進(jìn)鐵死亡[9]。

(三)系統(tǒng)Xc-及其對(duì)鐵死亡的影響 Xc-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)由調(diào)節(jié)亞基溶質(zhì)載體家族3成員2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)和催化亞基溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)組成,以1∶1的比例從細(xì)胞中釋放谷氨酸同時(shí)攝取胱氨酸。胱氨酸被還原為半胱氨酸,在谷氨酰半胱氨酸合酶/谷胱甘肽合酶的作用下合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)[10]。GSH是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最豐富的抗氧化劑,可以降低細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累。研究發(fā)現(xiàn)GSH的缺失會(huì)導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶失活,隨后篩選出谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),該基因的敲低或過表達(dá)可影響Erastin誘導(dǎo)的鐵死亡,但對(duì)其他形式的細(xì)胞死亡沒有影響[11]。綜上,GPX4利用含有半胱氨酸的谷胱甘肽來消除脂質(zhì)過氧化物,如果此過程受阻就會(huì)引發(fā)鐵死亡。GPX4是一種硒蛋白,而甲羥戊酸途徑的產(chǎn)物異戊烯基焦磷酸鹽(isopentenyl pyrophosphate,IPP)是合成硒代半胱氨酸的重要來源[12]。因此,IPP 和甲羥戊酸通路的抑制劑(他汀類藥物)也可通過影響 GPX4 來調(diào)節(jié)鐵死亡。

(四)其他通路及其對(duì)鐵死亡的影響 Bersuker等[13]使用 CRISPR-Cas 9技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一種完全獨(dú)立于GPX4-GSH-半胱氨酸軸的鐵死亡調(diào)控系統(tǒng),當(dāng)過表達(dá)線粒體凋亡誘導(dǎo)因子-2(AIFM2)時(shí),可彌補(bǔ)GPX4缺失的影響。由于AIFM2在鐵死亡中發(fā)揮的作用,它被重新命名為鐵死亡抑制蛋白-1(ferroptosis-suppressor-protein 1,FSP1),其機(jī)制是通過NADPH將輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)還原為泛素醇,泛素醇再捕獲脂質(zhì)過氧化物。Kraft等[14]通過全基因組篩選證實(shí)GTP水解酶1(GTP cyclohydrolase 1,GCH1)產(chǎn)生的代謝物四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)可生成還原性CoQ10,并且作為內(nèi)源性自由基捕獲抗氧化劑防止細(xì)胞膜破壞,抑制鐵死亡。Mao等[15]發(fā)現(xiàn)二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)與線粒體GPX4協(xié)同作用,通過將泛醌還原為泛醇來抑制鐵死亡。

二、靶向鐵死亡在肝病中的作用

鐵死亡可見于不同類型的肝病,如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化、自身免疫性肝炎、肝細(xì)胞癌等,這表明靶向鐵死亡可能對(duì)肝臟相關(guān)疾病的治療有一定的價(jià)值。

(一)酒精性肝病 肝臟是酒精代謝的主要場(chǎng)所,過量飲酒產(chǎn)生的有毒代謝物作用于肝細(xì)胞后涉及許多細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡,這是酒精性肝病的基本病理過程[16]。有研究發(fā)現(xiàn),酒精處理的小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝的下游標(biāo)志物,前列腺素內(nèi)過氧化物合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)mRNA被上調(diào),腹腔注射鐵死亡抑制劑(Fer-1)可減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷和脂質(zhì)過氧化[17]。在另一項(xiàng)研究中,酒精性肝炎小鼠中脂蛋白-1的過表達(dá)促進(jìn)了甘油三酯的合成和脂肪酸的氧化,加速了鐵的積累,導(dǎo)致鐵死亡和肝損傷的發(fā)生[18]。You等[19]發(fā)現(xiàn)酒精暴露增加了FNDC3B表達(dá), FNDC3B缺失通過抑制AMP活化蛋白激酶(AMPK)來加重酒精誘導(dǎo)的肝脂肪變性。Zhou等[20]報(bào)道,腸道sirtuin1(SIRT1)缺乏可以抑制酒精性肝損傷小鼠的鐵死亡,與野生型組相比,在腸道SIRT1敲除的小鼠肝臟中觀察到鐵代謝功能障礙改善,肝臟谷胱甘肽含量增加,脂質(zhì)過氧化減弱。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn),富馬酸二甲酯通過激活核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)途徑抑制鐵死亡,對(duì)酒精誘導(dǎo)的氧化損傷具有保護(hù)作用?？偟膩碚f,鐵死亡與酒精性肝病密切相關(guān),抑制鐵死亡可作為該疾病治療的新靶點(diǎn)。

(二)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)與酒精無關(guān),其主要特征是肝脂肪積累過多。當(dāng)除外酒精或其他次要因素導(dǎo)致肝內(nèi)脂肪含量>5%時(shí),絕大多數(shù)會(huì)發(fā)生單純性脂肪變性,隨著疾病的進(jìn)展可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[22]。高鐵飲食加劇了氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),加速了小鼠NAFLD 向 NASH 的進(jìn)展[23]。Tsurusaki等[24]證明了在NASH小鼠模型中,鐵死亡抑制劑(trolox或去鐵胺)可逆轉(zhuǎn)脂質(zhì)過氧化,同時(shí)抑制免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥反應(yīng),從而改善肝功能。Qi等[25]觀察到RSL3(一種鐵死亡誘導(dǎo)劑)治療可加重蛋氨酸/膽堿缺乏飲食(methionine and choline deficient diet,MCD)誘導(dǎo)的NASH小鼠的生化及炎癥表現(xiàn),而給予亞硒酸鈉(一種GPx4激活劑)、甲磺酸去鐵胺鹽或利普他汀可阻礙脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞死亡,說明GPX4及其相關(guān)的鐵死亡可能在NASH的發(fā)展中起主要作用。Li等[26]證明花生四烯酸代謝可觸發(fā)鐵死亡,靶向鐵死亡可減輕MCD飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠的病理狀態(tài)。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)烯酰輔酶A水合酶1(ECH1)在NASH患者活檢標(biāo)本和喂食MCD飲食的小鼠中顯著增加,ECH1過表達(dá)極大地緩解了肝臟氧化應(yīng)激。Zhu等[28]發(fā)現(xiàn)胸腺素β4(Tβ4)可有效改善高脂飲食(high-fat diet,HFD)誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型中的肝脂代謝相關(guān)指標(biāo),并抑制肝細(xì)胞系LO2中棕櫚酸誘導(dǎo)的鐵死亡。

(三)病毒性肝炎 病毒性肝炎的進(jìn)展與鐵死亡進(jìn)程也存在一定的關(guān)聯(lián)。在一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)[29]中發(fā)現(xiàn),甲型肝炎病毒 3C 蛋白酶(3Cpro)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡伴隨著強(qiáng)烈的脂質(zhì)過氧化,并被Fer-1有效抑制。此外,HBV X 蛋白 (HBx) 被證實(shí)通過 EZH2 介導(dǎo)抑制SLC7A11表達(dá)以促進(jìn)急性肝衰竭中的鐵死亡[30]。Su等[31]通過采用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行病例對(duì)照研究,發(fā)現(xiàn)鐵死亡相關(guān)基因 SLC1A5 可能是 HBV 相關(guān)肝細(xì)胞癌的極好預(yù)測(cè)因子,并與不良預(yù)后、晚期進(jìn)展和免疫抑制微環(huán)境相關(guān)。Liu等[32]發(fā)現(xiàn)HBV可抑制 SRSF2 來調(diào)節(jié) PCLAF 異常可變剪接,并通過 SRSF2/PCLAF tv1 軸減少鐵死亡導(dǎo)致索拉非尼耐藥。Yamane等[33]發(fā)現(xiàn) HCV復(fù)制受到鐵死亡的影響,并由脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2,FADS2)介導(dǎo),通過抑制FADS2可以顯著抑制鐵死亡,進(jìn)而增強(qiáng)了HCV的復(fù)制能力。

(四)肝纖維化 肝纖維化的機(jī)制涉及上皮或內(nèi)皮屏障破壞、慢性炎癥和肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化[34]。與正常肝臟相比,在纖維化肝臟中觀察到HSC中的鐵離子顯著增加和脂質(zhì)過氧化,說明鐵死亡可能參與肝纖維化過程[35]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),天然藥物通過靶向鐵死亡作用于肝纖維化的治療。蒿甲醚通過抑制SLC7A11重組蛋白介導(dǎo)的p53表達(dá)上調(diào),間接導(dǎo)致GPX4失活,最終促進(jìn)HSC中的鐵死亡,改善肝纖維化[36]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性半琥珀酸衍生物,以鐵蛋白吞噬介導(dǎo)的方式顯著促進(jìn)HSC的鐵死亡來緩解肝纖維化[37]。此外,野生苦瓜提取物作為肝纖維化的潛在抗纖維化劑,通過調(diào)節(jié)ER應(yīng)激和鐵死亡來減弱脂多糖誘導(dǎo)的HSC活化[38]。RNA結(jié)合蛋白ZFP36 / TTP(ZFP36無名指蛋白)和ELAVL1 / HuR(ELAV樣RNA結(jié)合蛋白1)在調(diào)節(jié)HSC的鐵死亡中也起著重要的作用[39, 40]。Erastin或索拉非尼通過含溴蛋白 7 (BRD7)-p53 -溶質(zhì)載體家族25 成員28 (BRD7-P53-SLC25A28)軸誘導(dǎo)HSC鐵死亡來抑制小鼠肝纖維化[41]。TRF是一種富含血清的金屬結(jié)合蛋白,已被證明可通過鐵死亡緩解肝纖維化[42]。最近,Shen等[43]發(fā)現(xiàn)YTHDF1 N6-甲基腺苷(m6A)修飾可能通過促進(jìn)BECN1 mRNA的穩(wěn)定性并激活自噬來增強(qiáng)HSC鐵死亡。因此,靶向鐵死亡是治療肝纖維化的一種潛在的策略。

(五)自身免疫性肝炎 有研究表明,用Fer-1處理后自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)模型小鼠的Nrf2和血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)水平下調(diào)。抑制鐵死亡顯著改善了AIH對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響,鐵死亡可作為導(dǎo)致AIH的引發(fā)劑或中間介質(zhì)[44]。另一項(xiàng)研究報(bào)道鐵死亡與刀豆球蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的AIH肝損傷中成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF4)表達(dá)有關(guān),表明FGF4可能是AIH細(xì)胞鐵死亡發(fā)展中不可或缺的調(diào)節(jié)因子[45]。Zeng等[46]發(fā)現(xiàn),AIH小鼠中抑制鐵死亡也顯著抑制了肝臟吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1(indoleamine 2,3-dioxygenase1,IDO1)的上調(diào)和硝化應(yīng)激,表明IDO1依賴性鐵死亡確定為治療AIH的新靶點(diǎn)。

(六)肝癌 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)由于起病隱匿、治療效果不佳等原因預(yù)后極差。索拉非尼作為多激酶抑制劑被廣泛應(yīng)用于治療晚期HCC,通過抑制系統(tǒng)Xc-功能,進(jìn)而抑制胱氨酸輸入和GSH合成,最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和鐵死亡[47],鐵螯合劑去鐵胺(DFX)能明顯抑制索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性作用[48]。Bai等[49]發(fā)現(xiàn)氟哌啶醇作為一種sigma受體拮抗劑,能促進(jìn)Erastin和索拉非尼誘導(dǎo)的鐵死亡。Sun等[50]證實(shí)奎西辛巰基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1,QSOX1)通過驅(qū)動(dòng) EGFR 內(nèi)體運(yùn)輸和抑制Nrf2 活化來促進(jìn)索拉非尼誘導(dǎo)的HCC鐵死亡。另外,納米顆粒藥物為鐵死亡治療肝癌提供了新的途徑。Tang等[51]將索拉非尼與錳硅納米顆粒結(jié)合,通過快速吞噬細(xì)胞內(nèi)GSH導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。Ou等[52]成功設(shè)計(jì)并制造了一種新型的低密度脂蛋白納米顆粒,該顆粒以天然ω-3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(LDL-DHA)為主要成分,可通過抑制GPX4活性來引發(fā)脂質(zhì)過氧化和鐵死亡,從而抑制腫瘤生長(zhǎng),并且還能擾亂HCC中氧化還原平衡。還有研究發(fā)現(xiàn),低表達(dá)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(Rb)能有效促進(jìn)索拉非尼引起的HCC細(xì)胞鐵死亡[53]。γ干擾素(interferon γ,IFNγ)通過抑制系統(tǒng)Xc-使HCC細(xì)胞對(duì)鐵死亡敏感[54]。

除了誘導(dǎo)鐵死亡外,防止產(chǎn)生耐藥性也是HCC治療的替代策略。Sun等[55]發(fā)現(xiàn)索拉非尼以Nrf2依賴方式誘導(dǎo)金屬硫蛋白-1G(MT-1G)的表達(dá),這進(jìn)一步促進(jìn)了索拉非尼的耐藥。Jennies等[56]發(fā)現(xiàn)TP53基因與Pro47(S47變異型)發(fā)生突變時(shí),對(duì)Erastin導(dǎo)的鐵死亡表現(xiàn)出顯著的抵抗力。Zhao 等[57]發(fā)現(xiàn)富含乳酸的癌細(xì)胞可使 AMP 活化蛋白激酶(AMPK)失活,從而增強(qiáng)具有抗鐵死亡特性的單不飽和脂肪酸的產(chǎn)生。Shang等[58]發(fā)現(xiàn),銅藍(lán)蛋白(ceruloplasmin ,CP)的缺失可促進(jìn)厄拉斯汀和RSL3引起的HCC細(xì)胞的鐵死亡,并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子和脂質(zhì)ROS的積累。白血病抑制因子受體亞基α(LIFR)的缺失也可通過上調(diào)由核因子κ-B(NF-κB)介導(dǎo)的鐵螯合細(xì)胞因子脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(LCN2)來誘導(dǎo)肝臟腫瘤的發(fā)生和對(duì)藥物相關(guān)性鐵死亡的抵抗[59]。所以,通過調(diào)控上述的分子靶標(biāo)可降低索拉非尼的耐藥情況。除此以外,YAP/TAZ和ATF4[60]、BAP1[61]、 DAZAP1[62]、 GSTZ1[63]、 lncRNA GABPB1-AS1[64]及環(huán)狀RNA cIARS[65]等,都可通過靶向鐵死亡在HCC的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,這為進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

三、鐵死亡的誘導(dǎo)劑和抑制劑

鐵死亡是一把雙刃劍,抑制鐵死亡可用于預(yù)防鐵過載和脂質(zhì)代謝異常引起的各種慢性肝損傷,而誘導(dǎo)鐵死亡有助于肝細(xì)胞癌的治療。因此,研究鐵死亡誘導(dǎo)劑和抑制劑的作用機(jī)制,對(duì)開發(fā)新的靶向鐵死亡藥物治療不同類型的肝病意義深遠(yuǎn)。以下是經(jīng)典鐵死亡誘導(dǎo)劑和抑制劑的分類(表1和表2)。

表1 鐵死亡誘導(dǎo)劑

表2 鐵死亡抑制劑

四、總結(jié)與展望

綜上所述,鐵死亡涉及多種通路的復(fù)雜機(jī)制,并且參與各類肝病的發(fā)生與發(fā)展。例如,HBV感染會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞鐵死亡而加劇炎性進(jìn)展,但是從宿主角度來說,肝細(xì)胞鐵死亡又提醒宿主驅(qū)動(dòng)免疫系統(tǒng)清除HBV。目前靶向鐵死亡被很多學(xué)者視為治療肝病新途徑,但在鐵死亡的研究中也存在一定的局限性。首先,研究結(jié)果多基于動(dòng)物模型,缺乏可靠的臨床證據(jù),并且其治療的安全性和毒副作用仍有待認(rèn)證;其次,許多肝病可能同時(shí)具有多種細(xì)胞死亡模式,鐵死亡與其他細(xì)胞死亡之間的聯(lián)系需要進(jìn)一步研究。最后,現(xiàn)階段對(duì)鐵死亡的研究多集中在HCC上,對(duì)其他肝臟疾病及鐵死亡通路上游機(jī)制研究相對(duì)較少。未來在肝病的背景下,需要更多的證據(jù)來揭示鐵死亡在不同時(shí)期疾病中的作用,尋找高特異性、靈敏性的生物標(biāo)志物和檢測(cè)方法來闡明鐵死亡的特征。隨著鐵死亡相關(guān)研究的不斷深入,勢(shì)必將會(huì)對(duì)各類肝病的診斷及治療提供新的臨床策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。