4種沙漠植物固氮菌的分離與固氮活性檢測(cè)

摘"要：【目的】""研究塔克拉瑪干沙漠植物獲取氮素營(yíng)養(yǎng)的途徑，為塔克拉瑪干沙漠固氮菌資源的開(kāi)發(fā)和干旱區(qū)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)提供支持。

【方法】""以沙漠典型豆科植物苦豆子、檉柳科植物多枝檉柳、菊科植物花花柴和蓼子樸為研究對(duì)象，利用YMA（酵母甘露醇瓊脂）和Ashby（阿須貝）無(wú)氮源培養(yǎng)基從植物根部分離固氮菌。

【結(jié)果】""從苦豆子樣品分離獲得19株菌，分布于11個(gè)屬；從花花柴樣品分離獲得8株菌，分布于5個(gè)屬；從蓼子樸樣品分離獲得5株菌，分布于5個(gè)屬；從多枝檉柳樣品分離獲得4株菌，分布于2個(gè)屬。YMA培養(yǎng)基分離獲得28株菌，分布于15個(gè)屬；Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基分離獲得8株菌，分布于7個(gè)屬。10株菌有固氮活性，從多枝檉柳中獲得的Rhizobium sp."80417、從苦豆子中獲得的Enterobacter sp.81227和Acinetobacter sp.81240、從花花柴中獲得的Paenibacillus sp.80802 和Microbacterium sp.80803具有較強(qiáng)的固氮能力。

【結(jié)論】""固氮菌種類的多樣化，促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)貧瘠環(huán)境氮元素的補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞：""塔克拉瑪干沙漠；苦豆子；多枝檉柳；花花柴；蓼子樸；固氮菌

中圖分類號(hào)："S188""""文獻(xiàn)標(biāo)志碼："A""""文章編號(hào)："1001-4330（2024）11-2742-08

0"引 言

【研究意義】塔克拉瑪干沙漠位于新疆塔里木盆地中部，面積3.376 ×105 km2，是我國(guó)最大的流動(dòng)沙漠，該沙漠遠(yuǎn)離海洋、高山環(huán)繞、降水稀少、極度干旱和生態(tài)環(huán)境脆弱。特殊氣候與貧瘠營(yíng)養(yǎng)條件導(dǎo)致該沙漠區(qū)域內(nèi)以抗旱耐貧瘠的植物為主［1］，塔克拉瑪干沙漠腹地和邊緣花花柴、多枝檉柳、蓼子樸和苦豆子較為常見(jiàn)。花花柴（Karelinia caspia）是菊科花花柴屬多年生草本植物，多生長(zhǎng)于干旱、半干旱地區(qū)的沖積平原及沙質(zhì)草甸鹽土地［2］?；ɑú褡鳛橹匾姆里L(fēng)固沙植物，具有耐鹽堿、耐干旱、耐高溫以及耐沙埋等生理特性，是一種改善荒漠地區(qū)生態(tài)平衡的重要植物［3］。多枝檉柳（Tamarix ramosissima）為檉柳科檉柳屬植物，主要分布于荒漠河岸和沖積平原鹽漬化沙地［4］，具耐干旱、耐鹽堿，抗風(fēng)沙等特點(diǎn)，是干旱區(qū)優(yōu)良的防風(fēng)固沙植物，也是鹽堿地的綠化造林樹(shù)種［5］。蓼子樸（Inula salsoloides）是菊科旋覆花屬，多年生草本植物，根狀莖橫走，具有較強(qiáng)的繁殖能力，主要分布于我國(guó)華北典型草原至荒漠草原帶地區(qū)［6］?？喽棺樱⊿ophora alopecuroides）是豆科槐屬的一種多年生草本植物，多生于干旱沙漠和草原邊緣地帶，其根、莖、葉和種子均可入藥，具有重要的藥用價(jià)值［7］。植物根際存在大量的固氮微生物，能固定空氣中的氮?dú)鉃橹参锷L(zhǎng)提供氮素，還可拮抗植物病原菌提高植物的抗病能力。固氮微生物是指能將分子氮還原為氨態(tài)氮的微生物，主要生長(zhǎng)在氮素缺乏、營(yíng)養(yǎng)不良的環(huán)境中?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】楊瑞紅等［8］通過(guò)對(duì)古爾班通古特沙漠南緣地區(qū)的梭梭和檉柳土壤微生物多樣性的初步分析，表明梭梭和檉柳土壤中獨(dú)特的迷蹤菌門(mén)（Elusimicrobia）與固氮菌密切相關(guān)。章振亞等［9］通過(guò)研究崇明東灘濕地外來(lái)入侵物種互花米草根際固氮微生物多樣性，揭示了互花米草與其根際固氮微生物之間的相互關(guān)系，對(duì)外來(lái)植物入侵的土壤微生物學(xué)機(jī)制研究有著重要指導(dǎo)意義。唐凱等［10］對(duì)渾善達(dá)克沙地土壤表層和底土固氮菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明藻殼、地衣殼、苔蘚殼及其鄰近底土固氮菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在顯著差異，固氮菌群和多樣性指數(shù)隨著生物土壤結(jié)皮發(fā)育階段的增加而增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】固氮微生物是一種重要的功能菌群，在土壤氮素循環(huán)中起著不可替代的作用，其群落結(jié)構(gòu)組成對(duì)土壤固氮和維持氮循環(huán)平衡具有重要意義，在生態(tài)系統(tǒng)中有著重要地位［11］。楊鴻儒等［12］研究了3種荒漠灌木根際可培養(yǎng)固氮菌群及其固氮和產(chǎn)鐵載體能力，表明殘遺灌木植物的根際固氮菌在鄂爾多斯沙漠不同植物間有明顯差異，并包含各種固氮菌固氮能力和高鐵產(chǎn)生能力，可以用作植物生長(zhǎng)促進(jìn)根際細(xì)菌的重要來(lái)源。需研究塔克拉瑪干沙漠固氮微生物的種類、豐富度和分布特征?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以塔克拉瑪干沙漠耐貧瘠、耐干旱植物花花柴、苦豆子、多枝檉柳、蓼子樸根際的固氮微生物為研究對(duì)象。評(píng)估沙漠固氮微生物的固氮能力，開(kāi)發(fā)利用沙漠極端環(huán)境中微生物資源，分析沙漠極端環(huán)境中植物與微生物的關(guān)系，為改善沙漠生態(tài)環(huán)境提供支持。

1"材料與方法

1.1"材 料

1.1.1"樣品采集及菌懸液

2021年7月從塔克拉瑪干沙漠及周邊采集花花柴、多枝檉柳、蓼子樸和苦豆子植株，采樣深度為10～20 cm，收集根際土。稱取1 g根際土研磨，加入9 mL無(wú)菌水，采用梯度稀釋法依次制成稀釋度分別為10-1、10-2、10-3和10-4菌懸液，梯度稀釋后涂布于Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基分離純化固氮菌。

1.1.2"培養(yǎng)基

Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，CaCO3 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水 1 L，pH 7.0～7.2。

YMA培養(yǎng)基：甘露醇 10 g，酵母粉 1 g，CaCl2 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO4 0.5 g，Rh微量元素液 4 mL，蒸餾水 1 L，pH 6.8～7.0（Rh微量元素液：KMnO4 5 g，H3BO3 5 g，蒸餾水 1 L）。

1.2"方 法

1.2.1"固氮菌的分離培養(yǎng)

將各植物根際土稀釋液涂布于Ashby 和YMA兩種培養(yǎng)基上，每種3個(gè)重復(fù)，分離具有固氮潛力的微生物。

1.2.2"菌株種類的鑒定

采用SDS-溶菌酶法提取微生物基因組DNA，應(yīng)用27F，1492R引物PCR擴(kuò)增其16S rRNA基因，將測(cè)序所得序列利用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行相似度比對(duì)，根據(jù)16S rRNA基因相似度確定菌株的種類。

1.2.3"菌株固氮能力檢測(cè)

采用乙炔還原法對(duì)菌株的固氮酶活性進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其固氮能力進(jìn)行評(píng)估。其原理是根據(jù)固氮酶能將乙炔催化還原為乙烯，生成的乙烯可以在低濃度下用氣相色譜的氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)［13］。

將2 mL菌種分別接種于盛有5.0 mL Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基和YMA培養(yǎng)基的15 mL試管中，28℃，48 h培養(yǎng)后，向每支試管中注入1.5 mL乙炔（純度99.99%）氣體（對(duì)照試管除外），再放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后從試管中抽取2 mL混合氣體注入氣相色譜儀中，測(cè)定乙炔的生成情況。通過(guò)比較乙炔峰面積和標(biāo)準(zhǔn)乙炔峰面積的差值來(lái)判斷有無(wú)乙烯生成，3次重復(fù)。根據(jù)差值大小判斷固氮酶活性的強(qiáng)弱。試驗(yàn)過(guò)程中的氣相條件為：柱溫60℃；進(jìn)樣口溫度200℃；FID監(jiān)測(cè)器溫度200℃；氣體流速：N2 35 mL/min，H2 60 mL/min，空氣 400 mL/min。以培養(yǎng)物在單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的乙烯量 C2H4 （ nmol/（mL·h） ） 表示固氮酶的活性。

固氮活性=""實(shí)際乙烯峰面積×標(biāo)準(zhǔn)乙炔含量×反應(yīng)瓶容積"標(biāo)準(zhǔn)乙炔峰面積×樣品量×進(jìn)樣量×培養(yǎng)時(shí)間"。

2"結(jié)果與分析

2.1"不同沙漠植物分離菌株多樣性

研究表明，4種沙漠植物中共分離獲得36株菌，其中從苦豆子樣品分離獲得19株，分布于11個(gè)屬；從花花柴樣品分離獲得8株，分布于5個(gè)屬；從蓼子樸樣品分離獲得5株，分布于5個(gè)屬；從多枝檉柳樣品分離獲得4株，分布于2個(gè)屬?？喽棺訕悠分蟹蛛x的菌株數(shù)量最多，蓼子樸的樣品中分離得到的菌株5株，但是均分布于不同屬，具有豐富的微生物多樣性。圖1，表1

2.2"不同培養(yǎng)基分離菌株多樣性

研究表明，共分離獲得71個(gè)菌株。合并重復(fù)菌株后共獲得18個(gè)屬36個(gè)菌株。其中YMA培養(yǎng)基分離獲得28株菌分布于15個(gè)屬；Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基分離獲得8株菌，分布于7個(gè)屬。2種培養(yǎng)基分離獲得的微生物數(shù)量差異顯著，YMA培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，多用于分離根瘤菌，Ashby培養(yǎng)基不含氮元素，多用于分離自生固氮菌。表1、圖2

2.3"分離菌株多樣性及遺傳進(jìn)化

研究表明，分離獲得的菌株中Bacillus數(shù)量最多（10株），其次為Pantoea和Rhizobium（各4株），Paenibacillus 3株，Microbacterium 2株，其它菌屬各1株。從菌株的16S rRNA基因比對(duì)結(jié)果分析可知，TRM80801與Microbacterium indicum BBH6 16S rRNA基因相似度為98.10%；TRM80611 與Massilia timonae CCUG 45783 16S rRNA基因相似度為98.12%；分別與相似菌株構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，2株菌疑似新種。表1，圖3，圖4

2.4"菌株的固氮活性檢測(cè)及固氮能力

研究表明，分離獲得的36株菌經(jīng)固氮活性檢測(cè)，有固氮活性的共10株，其中分離自苦豆子樣品的有4株、分離自花花柴樣品的有4株、分離自多枝檉柳樣品的有2株。分離自苦豆子樣品的固氮菌為Enterobacter sp.81227、Acinetobacter sp."81240、Pantoea sp."81228和Brevibacterium sp."81218；分離自花花柴樣品的固氮菌株為Paenibacillus sp.80802、Microbacterium sp.80803、Microbacterium sp.80801和Paenibacillus sp."80807；分離自多枝檉柳樣品的固氮菌為Rhizobium sp.80417和Rhizobium sp."80402。固氮能力最強(qiáng)的菌株為分離自多枝檉柳的菌株Rhizobium sp.80417。分離自蓼子樸樣品的菌株未檢測(cè)出固氮活性。表1，圖5，圖6

3"討 論

3.1

從4種沙漠植物中分離獲得的微生物種類和數(shù)量差異顯著，苦豆子分離獲得的菌株最多，有11個(gè)屬19個(gè)種；花花柴分離獲得5個(gè)屬8個(gè)種，蓼子樸分離獲得5個(gè)屬5個(gè)種，多枝檉柳只分離獲得2個(gè)屬4個(gè)種?？喽棺訉儆诙箍浦参铮箍浦参锱c根瘤菌的固氮方式是典型的共生固氮，其固氮量占生物固氮總量的65%。4種植物中苦豆子中分離獲得最多的固氮菌，符合生物固氮的發(fā)生規(guī)律。目前，有關(guān)苦豆子的研究主要在生物學(xué)和生理特性、化學(xué)成分、藥用價(jià)值、飼料加工及其他資源化利用途徑等方面，對(duì)其固氮菌資源的研究鮮有報(bào)道［7］。

3.2

豆科植物將大氣中的氮以生物固氮的方式固定到生物體內(nèi)。這些氮素最終以植物凋落物或分泌物的形式在土壤中流動(dòng)；而非豆科植物只能通過(guò)根系對(duì)土壤氮素的吸收來(lái)滿足其生長(zhǎng)發(fā)育需要。郭林平等［14］通過(guò)研究不同生境（自然和小區(qū)）下豆科植物疏葉駱駝刺和非豆科植物花花柴的互作對(duì)氮素固定和根際微生物的影響，結(jié)果表明，在2種生境下疏葉駱駝刺與花花柴都有氮素轉(zhuǎn)移特征，并且這種轉(zhuǎn)移特征在自然生境下更為明顯。前期對(duì)非豆科耐鹽植物花花柴的研究主要集中在耐鹽機(jī)制，化學(xué)成分及藥物成分分析等方面，對(duì)該植物進(jìn)行的固氮菌研究甚少。蓼子樸和花花柴同屬菊科植物，目前主要用于研究其化學(xué)成分和藥用價(jià)值［15］，對(duì)其微生物資源研究方面目前尚未見(jiàn)報(bào)道。桑鈺等［16］以多枝檉柳和疏葉駱駝刺為研究對(duì)象，分析了干旱脅迫處理下接種叢枝菌根真菌對(duì)其混合種植根系生長(zhǎng)狀況和氮素吸收分配的影響，結(jié)果表明叢枝菌根真菌對(duì)于干旱脅迫下與疏葉駱駝刺混生的多枝檉柳幼苗的生長(zhǎng)和氮素吸收具有明顯的補(bǔ)償作用。

3.3

采用氣相色譜-乙炔還原法檢測(cè)微生物的固氮能力，經(jīng)檢測(cè)10個(gè)菌株有較強(qiáng)的固氮活性，固氮能力較強(qiáng)的菌株分布在類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）和根瘤菌屬（Rhizobium）。其中Microbacterium sp.80801的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示疑似新種，16S rRNA基因相似度為98.10%，固氮能力分析結(jié)果顯示該菌株具有較強(qiáng)的固氮活性，提示該菌株在種質(zhì)資源和功能機(jī)制方面具有較大的研究前景。據(jù)報(bào)道，目前已發(fā)現(xiàn)20多種具有固氮活性的類芽孢桿菌［17］。近幾年報(bào)道的具有固氮活性的微桿菌也逐漸增加，并在基因組DNA中檢測(cè)出了nifH基因［18］。固氮菌種類多樣能有效促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)貧瘠環(huán)境中氮元素的吸收轉(zhuǎn)化。氮是植物生長(zhǎng)、發(fā)育所必需的大量元素之一。幸翀等［19］以辣椒為研究對(duì)象，利用選擇性培養(yǎng)基分離、篩選辣椒葉際固氮細(xì)菌，結(jié)果表明從辣椒葉際共分離得到2株具有高效固氮性能的自生固氮菌，分別為不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）和根瘤菌（Rhizobium sp.）。馬瑞萍等［20］從青稞田土壤中進(jìn)行固氮菌的分離、純化，觀察其菌落形態(tài)特征并測(cè)定各菌株的固氮酶活性，結(jié)果顯示共得到自生固氮菌50株，其中13株菌具有高效固氮酶活性，分別屬于假食酸菌屬（Pseudacidovorax）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）和農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）。劉爽等［21］分析了寧夏荒漠區(qū)5個(gè)檸條林地根際土壤nif H基因豐度和固氮菌群落結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果從寧夏5個(gè)不同荒漠區(qū)檸條群落根際土壤中分離出15個(gè)固氮菌屬，包括根瘤菌屬（Rhizobium）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和腸桿菌屬（Enterobacterium）。其中假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，占代表菌株的 23.08%，另外還分離出一些不常見(jiàn)的固氮類群如不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、勒克氏菌屬（Leclercia）、金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、微桿菌屬（Microbacterium）、貪噬菌屬（Variovorax）和短波單胞菌屬（Brevundimonas）。研究共分離獲得4株根瘤菌，經(jīng)檢測(cè)其中2株根瘤菌具有固氮活性，分別為80402和80417。其中80402的相似菌株Rhizobium tarimense PL-41在2013年由Turdahon M等［22］從新疆塔里木盆地胡楊森林土壤中分離得到，此菌株與試驗(yàn)菌株80402均來(lái)自于新疆干旱區(qū)。菌株80417的相似菌株Rhizobium arenae MIM27在2017年由Zhang等從毛烏素沙漠分離獲得。分離獲得的有固氮活性其它3個(gè)屬也在前期研究的結(jié)論中有不同程度的出現(xiàn)。

4"結(jié) 論

分離獲得18個(gè)屬的36株菌。共有10株菌具有固氮活性，分布在不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、短桿菌屬（Brevibacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、微桿菌屬（Microbacterium）、帕尼巴菌屬（Paenibacillus）、泛菌屬（Pantoea）和根瘤菌屬（Rhizobium）7個(gè)屬。其中分離自花花柴樣品的固氮菌4株，分離自苦豆子樣品的固氮菌4株，分離自多枝檉柳樣品的固氮菌2株。

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Isolation and nitrogen-fixing activity detection ""of bacteria from four desert plants

WANG Lijun1， SUN Beibei1， WANG Chunyan2， XIA Zhanfeng2， MA Guocai1

（1. Analysis and Testing Center， Tarim University， Aral Xinjiang 843300，China; 2. College of Life Science and Technology， Tarim University， Aral Xinjiang 843300，China）

Abstract：【Objective】 ""In order to explore the ways for plants to obtain nitrogen nutrients in the Taklimakan Desert.

【Methods】 ""the typical legume plants Sophora alopecuroides， Tamarix ramosissima， Karelinia caspica and Inula salsoloides were used as research materials.Nitrogen-fixing bacteria were isolated from plant roots using YMA and Ashby nitrogen-free medium.It provides support for the development of nitrogen-fixing bacteria resources in the Taklimakan Desert and the protection of the ecological environment in arid areas.

【Results】 ""A total of 19 strains were isolated from Sophora alopecuroides samples， which were distributed in 11 genera.8 strains were isolated from Karelinia caspica samples and distributed in 5 genera.5 strains were isolated from Inula salsoloides samples and distributed in 5 genera.4 strains were isolated from Tamarix ramosissima samples and distributed in 2 genera.28 strains of bacteria were isolated from YMA medium， distributed in 15 genera; 8 strains of bacteria were isolated from Ashby nitrogen free medium and distributed in 7 genera.Rhizobium sp.80417 from Tamarix ramosissima， Enterobacter sp.81227 and Acinetobacter sp.81240 from Sophora alopecuroides， Paenibacillus sp.80802 and Microbacterium sp.80803 from karelinia caspica had strong nitrogen fixation ability.

【Conclusion】 ""The diversity of nitrogen-fixing bacteria has promoted the supplement of nitrogen in nutrient poor environment.

Key words：""Taklimakan Desert; Sophora alopecuroides; Tamarix ramosissima; Karelinia caspia; Inula salsoloides; nitrogen-fixing microorganism

Fund projects：""Financial and Technological Projects of the Xinjiang Production and Construction Corps \"Development and application of microbial agents from the Tarim Basin for the prevention and control of major agricultural and forest diseases in Xinjiang″（2021BC009）; Sub-project of the Xinjiang Comprehensive Scientific Investigation Project \"Investigation and collection of microbial germplasm resources in special environments\"（2022xjkk150307）; National College Students' Innovation and Entrepreneurship Training Program \"Development of biopesticides based on the fermentation products of high inhibitory active actinomycetes from the Tarim Basin\"（202210757018）

Correspondence author："""MA Guocai （1978-）， male， from Chaoyang， Liaoning， senior experimenter， research direction： micro-area analysis， （E-mail） 18845420@qq.com.

收稿日期（Received）：

2024-05-27

基金項(xiàng)目：

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)財(cái)政科技計(jì)劃項(xiàng)目“塔里木盆地來(lái)源微生物防治新疆主要農(nóng)林病害菌劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用”（2021BC009）；新疆綜合科學(xué)考察項(xiàng)目子課題“特殊環(huán)境微生物種質(zhì)資源調(diào)查與收集”（2022xjkk150307）；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“基于塔里木盆地高抑菌活性放線菌發(fā)酵產(chǎn)物的生物農(nóng)藥創(chuàng)制”（202210757018）

作者簡(jiǎn)介：

王麗君（1981-），女，山東聊城人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源，（E-mail）1489968232@qq.com

通訊作者：

馬國(guó)財(cái)（1978-），男，遼寧朝陽(yáng)人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)槲^(qū)分析，（E-mail）18845420@qq.com