固氮菌的篩選及其對(duì)菜場(chǎng)垃圾堆肥化的影響

王曉輝，姜 虎，刁 婥，張立菲，張 穎*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，哈爾濱 150056）

隨著城市化進(jìn)程加快，環(huán)境問題，特別是城市生活垃圾處理問題已成為關(guān)注焦點(diǎn)。直接傾倒和簡(jiǎn)易填埋處理方式對(duì)土壤、地下水、大氣等都會(huì)造成現(xiàn)實(shí)的影響和潛在危害。特別是填埋場(chǎng)的滲瀝水，由于未進(jìn)行必要的收集和處理，導(dǎo)致水源污染。垃圾填埋場(chǎng)污染地下水源，嚴(yán)重污染、破壞垃圾填埋場(chǎng)周邊環(huán)境的情況時(shí)有發(fā)生。如何解決垃圾問題，已引起全社會(huì)的高度重視[1]。

堆肥是目前廣泛應(yīng)用且能有效處理城市生活垃圾的方法之一，其實(shí)質(zhì)就是利用微生物在一定溫度、濕度和pH條件下，使城市有機(jī)物質(zhì)發(fā)生生物化學(xué)降解，形成一種類似腐殖質(zhì)土壤的物質(zhì)，用作肥料和改良土壤。堆肥化的產(chǎn)物稱為堆肥。堆肥是一種深褐色、質(zhì)地松散、有泥土味的物質(zhì)。這種物質(zhì)的主要成分是腐殖質(zhì)，其養(yǎng)料價(jià)值不高，是一種極好的土壤改良劑和調(diào)節(jié)劑。城市生活垃圾在堆肥過程中往往會(huì)損耗大量的氮，使其含量大大降低。然而，氮是農(nóng)作物生長的三大要素之一，對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有重要意義[2]。

石春芝等曾嘗試在堆肥中加入固氮菌和纖維素分解菌，利用兩者的互生作用（纖維素分解菌可將堆肥中的一些枯枝、落葉、樹皮、朽木等有機(jī)組分分解成化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的物質(zhì)，為固氮菌提供碳源）來提高堆肥的含氮量，從而提高堆肥的肥效[3]。但其只是初步嘗試，所用菌種為廣東省微生物研究所直接提供的褐球固氮菌，未對(duì)菌種進(jìn)行篩選。陳世和等曾對(duì)城市生活垃圾堆肥過程中的主要微生物的分離、鑒定和酶活力進(jìn)行研究[4]。本試驗(yàn)從土壤中篩選出優(yōu)勢(shì)固氮菌，在菜場(chǎng)垃圾中加入這些固氮菌，利用其生物作用來提高堆肥的含氮量，從而提高堆肥質(zhì)量，縮短堆肥周期。

1 材料與方法

1.1 固氮菌的篩選

1.1.1 原理

自生固氮菌具有固氮能力，能在無氮培養(yǎng)基上生長繁殖。取pH 6.5以上的耕作土壤，經(jīng)過適當(dāng)處理后，加入到無氮培養(yǎng)基上，在適合的溫度下培養(yǎng)3 d，在平板表面就會(huì)出現(xiàn)褐色、粘稠、半透明的菌落。加1%淀粉可促進(jìn)褐球固氮菌的生長，而維涅蘭德固氮菌則是該屬中唯一能利用鼠李糖的固氮菌。如加入蔗糖并調(diào)pH 5～6的范圍時(shí)可促進(jìn)拜氏固氮菌的生長。最后挑取典型的菌落，在無氮培養(yǎng)基平板上經(jīng)過數(shù)次劃線便可得到純種的單菌落。

1.1.2 材料

樣品：上海師范大學(xué)校園泥土。

培養(yǎng)基：阿須貝（Ashby）無氮培養(yǎng)基。

1.2 堆肥化的處理方法[5]

1.2.1 擴(kuò)大培養(yǎng)

分別將各培養(yǎng)基上的菌種接種于盛有300 mL對(duì)應(yīng)碳源的Ashby培養(yǎng)液的三角瓶中，在28℃下振蕩培養(yǎng)3 d，待培養(yǎng)液混濁。將得到的三種菌種及它們的混合菌種分別倒入裝有菜葉的桶中。具體方法如下：塑料桶裝菜葉10 kg，大小約為8 cm×5 cm，以5%的接種量接種。接種后將塑料桶置于室溫下，早晚各攪動(dòng)1次，并保持濕潤。間隔3 d用下述方法對(duì)堆肥的全氮，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的含量進(jìn)行測(cè)定。具體的處理方法見表1。

表1 具體處理方法Table1 Treatment methods of the compost

1.3 全氮，硝態(tài)氮，銨態(tài)氮的測(cè)定[6]

樣品中全氮量的測(cè)定：半微開氏法（K2SO4-CuSO4-Se蒸餾法）；樣品中銨態(tài)氮含量的測(cè)定：蒸餾滴定法（2NKCl浸提-蒸餾法）；樣品中硝態(tài)氮含量的測(cè)定：酚二黃酸比色法

1.4 固氮菌降解菜場(chǎng)垃圾中微生物數(shù)量的變化處理過程中的數(shù)量分析[7]

稀釋涂布法：分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏I號(hào)培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基和豆芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)細(xì)菌、放線菌、霉菌和酵母菌。

分別用以淀粉、鼠李糖、蔗糖和葡萄糖為唯一碳源的無氮培養(yǎng)基培養(yǎng)分離計(jì)數(shù)褐球固氮菌、維涅蘭德固氮菌、拜氏固氮菌以及它們的混合固氮菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選出的菌株

結(jié)果見表2，由表2可見，2.1%淀粉可促進(jìn)褐球固氮菌的生長，維涅蘭德固氮菌則是該屬中唯一能利用鼠李糖的固氮菌，加入蔗糖并調(diào)pH 5～6時(shí)可促進(jìn)拜氏固氮菌的生長。我們?cè)?組無氮培養(yǎng)基中加入不同碳源，即1%淀粉，鼠李糖，蔗糖并將pH值調(diào)至5～6，所以我們分別得到3種菌種即褐球固氮菌，拜氏固氮菌及維涅德蘭固氮菌。褐球固氮菌和拜氏固氮菌菌落數(shù)相似，維涅德蘭固氮菌的菌落數(shù)明顯少于褐球固氮菌和拜氏固氮菌。

2.2 五組堆肥裝置中含氮量的變化

2.2.1 全氮含量的變化

全氮的含量隨時(shí)間變化見圖1。由圖1中可知接種混合固氮菌的堆肥裝置中的全氮含量最高，接下來依次為褐球固氮菌，拜氏固氮菌，維涅蘭德固氮菌，最后是空白，且各組的全氮含量呈上升趨勢(shì)從第7天開始趨于穩(wěn)定。

表2 篩選得到的菌株Table2 Results of selected strains

圖1 全氮含量的變化Fig.1 Changes of total nitrogen

2.2.2 銨態(tài)氮含量的變化

在反應(yīng)進(jìn)行中，銨態(tài)氮的含量隨時(shí)間的變化見圖2。從圖2中可知接種混合菌種的堆肥裝置中的銨態(tài)氮含量最高，接下來依次為褐球固氮菌，拜氏固氮菌，維涅德蘭固氮菌，含量最低的為空白。且各組中的銨態(tài)氮含量均呈上升趨勢(shì)但從第7天開始下降而到第13天后趨于穩(wěn)定。

2.2.3 硝態(tài)氮含量的變化

硝態(tài)氮的含量隨時(shí)間的變化見圖3。

由圖3可知，接種混合固氮菌的堆肥裝置中的硝態(tài)氮含量最高，接下來依次為褐球固氮菌，拜氏固氮菌，維涅蘭德固氮菌。含量最低的為空白。各組中硝態(tài)氮含量都呈上升趨勢(shì)，到第13天開始趨于穩(wěn)定。

圖2 銨態(tài)氮含量的變化Fig.2 Changes of ammonium nitrogen

圖3 硝態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of nitrate nitrogen

2.2.4 堆肥過程中菜葉的變化情況

接種混合菌種的菜葉5 d后周邊開始糜爛，12 d后菜葉已基本糜爛，接種褐球固氮菌、拜氏固氮菌、維涅蘭德固氮菌的菜葉分別在7、9、10 d后菜葉周邊開始糜爛，14、17、19 d后菜葉基本糜爛。而未接種固氮菌的菜葉（空白）一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束即21 d后都未見糜爛。說明混合菌種的堆肥周期最短，接下來依次為褐球固氮菌、拜氏固氮菌、維涅蘭德固氮菌。

3 討論與結(jié)論

在固氮菌的作用下，接種混合固氮菌的堆肥中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量增加最多，接下來依次為褐球固氮菌、拜氏固氮菌、維涅蘭德固氮菌。由于第五組堆肥中加了混合固氮菌后，三種固氮菌共同作用于菜葉，所以其堆肥中氮含量要比其他組的多。

在低溫堆肥初期，五組堆肥中氮含量的變化趨勢(shì)相似?？瞻捉M中未加固氮菌，但其全氮，銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量增加。

在堆肥中期，銨態(tài)氮含量的、降低，而硝態(tài)氮的含量增加可能是由于一部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氨類物質(zhì)從堆肥中逸出；一部分銨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮。接種固氮菌的堆肥中，固氮菌大量生長繁殖，使堆肥中的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量比空白組多。接種褐球固氮菌的堆肥中的全氮，銨態(tài)氮，硝態(tài)氮的含量要比接種拜氏固氮菌，維涅蘭德固氮菌高。

堆肥中全氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量變化及堆肥周期說明混合菌種的堆肥效果比單一菌種堆肥效果好，其中褐球固氮菌的堆肥效果比拜氏固氮菌及維涅蘭德固氮菌好。

在堆肥物料中加入自生固氮菌提高堆肥中的含氮量和堆肥肥效。而固氮菌本身具有的生物活性增加肥料的生物學(xué)性能，將其施用于土壤，增加土地肥力和土壤中的功能微生物數(shù)量，有利于土壤中物質(zhì)分解與轉(zhuǎn)化，改良土壤，保護(hù)環(huán)境。

[1]臧又超.我國城市生活垃圾現(xiàn)狀與管理問題[J].環(huán)境保護(hù),1998(8):41-43.

[2]Tang Y J.Research of the refuse and its treatment in Shanghai City[J].Chongqing Environ Sci，1997,19(2):30-32.

[3]石春芝,蒲一濤,鄭宗坤,等.垃圾堆肥固氮菌對(duì)堆肥含氮量的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2002,8(4):419-421.

[4]陳世和,張所明,宛玲,等.城市生活垃圾堆肥處理的微生物特性研究[J].上海環(huán)境科學(xué),1989,8(8):17-21.

[5]Chen H B,Tao H,Feng Q L,et al.Study for the status quo of municipal refuse disposal in China[J].J Wuhan Urban Construct Instit,1997,14(3):40-44.

[6]Pu Y T,Zhong Y H,Zhou W L.The mixed culturing of nitrogen-fisation bacteria and cellulose decomposing organism and the effects on the decomposing of the household garbage[J].Eniviron Sci Technol,1999,84(1):15-18.

[7]沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,1999(6):214-215.