甜菜多黏菌研究進展

張秀琪,張宗英,韓成貴,王 穎

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部病蟲害監(jiān)測與綠色管理重點實驗室,北京 100193)

0 引言

甜菜多黏菌(Polymyxabetae)是一種專性寄生的原生生物(protista),1958年意大利的KESKIN在甜菜根中首次發(fā)現(xiàn)P.betae,目前P.betae廣泛分布于美國、德國、法國、英國、敘利亞、伊朗、加拿大、日本和中國,是甜菜壞死黃脈病毒(beet necrotic yellow vein virus,BNYVV)、甜菜土傳病毒(beet soil-borne virus,BSBV)、甜菜土傳花葉病毒(beet soil-borne mosaic virus,BSBMV)和甜菜Q病毒(beet virus Q,BVQ)的傳播介體[1]。其中P.betae傳播的BNYVV導(dǎo)致甜菜叢根病的發(fā)生,該病害是目前世界各甜菜產(chǎn)區(qū)最重要的病毒病害。P.betae只能寄生在寄主植物的根部,目前仍無法在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng),因而研究長期受限。近年來,隨著培養(yǎng)體系的改進、檢測技術(shù)及組學(xué)的快速發(fā)展,P.betae在生物學(xué)、基因組學(xué)以及病毒與介體互作方面出現(xiàn)新的進展。本文就P.betae的分類地位、生活史、寄主范圍、培養(yǎng)體系、基因組分析、診斷與檢測技術(shù)、P.betae與病毒及寄主的互作以及綜合防治等方面進行簡要綜述。

1 甜菜多黏菌的分類地位

P.betae早期被認為是低等真菌,目前歸屬于原生生物,詳細分類為植物寄生黏菌綱(Phytomyxea)、原質(zhì)目(Plasmodiophorida)、根腫菌科(Plasmodiophoridae)、多黏菌屬(Polymyxa)。根腫菌科內(nèi)所有物種都是細胞內(nèi)專性寄生物,具備如下共有特征:十字形核分裂、游動孢子一端著生兩根不等長的鞭毛、具有多核的原質(zhì)團階段以及休眠孢子階段。多黏菌屬還包括禾谷多黏菌(Polymyxagraminis),兩者在形態(tài)上類似,可由寄主范圍及18S核糖體DNA分析加以區(qū)分。

2 甜菜多黏菌的生活史

P.betae的生活史分為休眠孢子形成期(sporogenic phase)和游動孢子囊形成期(sporangial phase)兩個主要階段。生命周期的每個階段都開始于游動孢子穿透寄主細胞[2]。游動孢子通過鞭毛運動到寄主表面,這時鞭毛會失去活力,慢慢收縮,最后消失,游動孢子在根毛表面靜止,伸出一個管狀腔穿透寄主,進入寄主細胞內(nèi)[3]。內(nèi)容物在寄主體內(nèi)擴展,將此時的形態(tài)稱為產(chǎn)孢囊原質(zhì)體,通過核分裂或相互融合形成一個大型的多核帶隔菌體,即孢子囊,成熟后形成游動孢子囊[2,4]。孢子囊形成溢管,溶解寄主細胞壁,釋放次級游動孢子,開啟新一輪的侵染[2-4]。通過減數(shù)分裂在寄主細胞內(nèi)形成單核的休眠孢子,未成熟的休眠孢子排列緊密,棱角分明,相鄰的休眠孢子外壁互相溶合,形成魚卵狀的休眠孢子堆[4]。休眠孢子堆隨著病殘體越冬,來年再釋放游動孢子進行初侵染。在侵染過程中,P.betae僅在根皮層組織內(nèi)擴展,未能在寄主根部內(nèi)皮層和中柱組織中觀察到[5]。

3 甜菜多黏菌的寄主范圍

P.betae的寄主范圍較為有限,目前報道可侵染莧科、石竹科、罌粟科、禾本科、十字花科、旋花科和菊科等7科40余種植物(表1),但具有寄主專化型現(xiàn)象。1979年BARR等[6]在加拿大分離獲得兩個?；蚉.betaef.sp.Amaranthi和P.betaef.sp.Betae,前者只侵染反枝莧(Amaranthusretroflexus),后者主要侵染甜菜(Betavulgaris)、藜(Chenopodiumalbum)、頭狀藜(Chenopodiumcapitatum)、Amaranthushortensis等植物。ABE等[7]在日本北海道病圃中測試23科108種植物,證實P.betae可侵染藜、墻生藜(Chenopodium murale)、小藜(Chenopodiumficifolium)、馬齒莧(Portulacaoleracea)、大花馬齒莧(P.grandiflora)、甜菜(BetavulgarisL.var.saccharifera)、瑞士甜菜(B.vulgarisL.var.cicla)、平匐甜菜(B.procumbens)、菠菜(Spinaciaoleracea)、反枝莧、凹頭莧(Amaranthusblitum)、頭狀藜和藜麥(Chenopodiumquinoa)。隨后BARR等[8]首次發(fā)現(xiàn)P.betae能夠侵染白麥瓶草(Silenealba)和草地濱藜(Atriplexpatula)。1994年,在研究P.graminis對谷類作物的侵染性時偶然發(fā)現(xiàn)P.betae能夠侵染特定品種的燕麥(AvenasativaL.cv.Peniarth),這是首次發(fā)現(xiàn)P.betae可以侵染單子葉植物[9]。HUGO等[10]在花椒罌粟(Papaverargemone)、虞美人(Papaverrhoeas)、狗筋麥瓶草(Silenevulgaris)、夜花蠅子草(Silenenoctiflora)、禾葉繁縷(Stellaria graminea)、甜菜(B.vulgaris)、菠菜、雜配藜(Chenopodiumhybridum)、Chenopodiumbonus-henricus、Chenopodiumpolyspermum以及Amaranthuscaudatus-viridis的根中觀察到了P.betae的休眠孢子囊,但只有從甜菜、菠菜和Chenopodiumpolyspermum上分離得到的P.betae才能將BNYVV傳播到甜菜上。2008年,MOUHANNA等[11]在甜菜叢根病發(fā)生的土中種植的大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)、多花黑麥草(Loliummultiflorum)、高粱(Sorghumvulgare)、石茅(Sorghumhalepense)、旋花(Calystegiasepium)、薺菜(Capsellabursa-pastoris)、矢車菊(Centaureacyanus)、田旋花(Convolvulusarvensis)、牛膝菊(Galinsorga parviflora)、無香母菊(Matricariainodora)、繁縷(Stellariamedia)的根中觀察到了休眠孢子囊,通過RT-PCR驗證其為P.betae而非P.graminis。2011年,DESOIGNIES等[12]發(fā)現(xiàn)P.betae能夠侵染擬南芥。2013年,SMITH等[13]意外地在小麥根部上也檢測到P.betae。近年來,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)P.betae能夠侵染甘藍(Brassica oleracea)、蘿卜(Raphanussativus)、野蘿卜(R.raphanistrum)以及大爪草(Spergulaarvensis)[14-15]。

表1 甜菜多黏菌寄主范圍Table 1 The host range of P.betae

4 甜菜多黏菌的培養(yǎng)體系

P.betae專性寄生,至今仍無法通過人工培養(yǎng)基培養(yǎng)。1989年,TAMADA[16]用1/5的Hoagland營養(yǎng)液和Arnon溶液(102 mg/L KNO3、136 mg/L KH2PO4、236 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、48 mg/L MgSO4·7H2O、0.001 mg/L Fe-EDTA、0.6 mg/L H3BO3和0.4 mg/L MnSO4·4H2O,pH 7.0)在石英砂中培養(yǎng)甜菜建立砂培體系,成功繁殖了帶毒的P.betae。1995年,彭日荷等[17]用該營養(yǎng)液澆灌種植于河砂中的甜菜,通過將新鮮病根、干病根或病土埋入砂中、新鮮病根汁液澆灌、游動孢子接種等方法成功繁殖了P.betae,其中,病土和新鮮的病根接種15 d后才能觀察到休眠孢子,而干病根、新鮮病根汁液和游動孢子接種后7 d就能觀察到休眠孢子;觀察到P.betae從新鮮病根中釋放出來也會受到阻力,推測復(fù)雜的根際微生物對P.betae的侵染有一定的拮抗作用,所以相比于干病根、病根汁液和游動孢子接種,新鮮病根和病土接種出現(xiàn)了休眠孢子滯后現(xiàn)象。2011年,DESOIGNIES等[18]將P.betae接種在無菌培養(yǎng)的甜菜毛狀根上,于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡觀察到了P.betae的典型結(jié)構(gòu),并且PCR檢測呈陽性,成功建立了P.betae的半體外培養(yǎng)體系。

5 甜菜多黏菌的基因組

DECRO?S等[19]用P.betae單孢子菌株A26-41(休眠孢子團聚集型)的游動孢子接種3周齡的單粒甜菜DH(double hapliod)系‘KWS2320’,培養(yǎng)14周后對根進行表面消毒,用CTAB法提取DNA,首次獲取了P.betaeA26-41的全基因組序列,基因組組裝由1 001個重疊群表示,累積長度為27 085 946個核苷酸。之后該課題組又通過元基因組學(xué)從未經(jīng)純化的游動孢子組裝了RES F41分離物的核基因組以及線粒體基因組,并提供了P.betae基因組的完整注釋[20]。比較發(fā)現(xiàn)RES F41和A26-41兩個分離物的核基因組高度相似,均包括約10.2 k的預(yù)測編碼基因,其中約3%是每個分離物所特有的。同時將P.betae基因組與蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)和馬鈴薯粉痂菌(Spongosporasubterranea)進行比對,盡管三者屬于同一個科,并擁有相似的生活方式,但它們擁有一些特異表達的蛋白。如與二者相比,P.betae含有錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域(ankyrin-repeat domains,Anks)的蛋白豐度更低,在P.betae中檢測到了3種含有信號肽的類PR-4蛋白,而在Plasmodiophorabrassicae和S.subterranea中未檢測到;Plasmodiophorabrassicae編碼作用于植物水楊酸的甲基轉(zhuǎn)移酶基因PbBSMT和生長素響應(yīng)基因PbGH3,而P.betae和S.subterranea并不編碼這些基因,且Plasmodiophorabrassicae在G蛋白偶聯(lián)受體的信號通路(G protein coupled receptor signaling pathway,GPCR)中相關(guān)基因的表達量遠高于P.betae和S.subterranea,這些基因參與細胞外環(huán)境信號和寄主細胞內(nèi)信號識別[20-22];在P.betae和S.subterranea中檢測到了CatSper(sperm-specific voltage-gated calcium channel)復(fù)合主體(α1-4)和輔助亞基(βδγ)的同源物,推測鈣離子信號通路可能在P.betae和S.subterranea生活史中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,這些差異預(yù)示三者可能通過不同的策略,依賴于不同的關(guān)鍵分子機制入侵寄主的根細胞并繁殖[20]。

6 甜菜多黏菌的診斷與檢測技術(shù)

6.1 顯微鏡觀察

最初只能通過光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察P.betae的不同形態(tài)以確定甜菜是否受到侵染[5,23-26],但由于從形態(tài)上難以區(qū)分P.betae和P.graminis,且難以制備合適的樣本用于觀察,因此科學(xué)家們開始嘗試用其他方法來檢測P.betae。

6.2 分子檢測

1994年,通過對ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列的限制性內(nèi)切酶分析,首次成功區(qū)分P.graminis和P.betae[27]。隨著PCR檢測快速興起,相比光學(xué)顯微鏡觀察,PCR檢測假陽性更低,且耗時減少,操作更加簡單便捷,逐漸成為P.betae檢測的主要技術(shù)[28-29],同時巢式PCR、實時PCR、Northern印跡雜交和斑點印跡雜交技術(shù)也逐步用于P.betae的檢測[28,30-32]。WARD等[33]使用EDTA裂解緩沖液、DNA提取試劑盒以及磁珠從土壤中直接提取了P.betae的DNA,結(jié)合實時熒光PCR和TaqMan技術(shù)從有叢根病危害的土壤中檢測到了P.betae,這是首次直接從土壤中檢測到P.betae。隨后一種快速從少量土壤(1.5 g)中同時提取RNA和DNA的方法,也應(yīng)用于土壤中P.betae和BNYVV的檢測[34]。

6.3 血清學(xué)檢測

MUTASA-GOTTGENS等[35]通過cDNA文庫篩選,獲得編碼P.betae特異性谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白(glutathione-S-transferase,GST)的cDNA,表達純化該蛋白制備的抗血清能夠特異性檢測P.graminis和P.betae,2003年KINGSNORTH等[36]在MUTASA-GOTTGENS的基礎(chǔ)上,建立了一種基于ELISA的多克隆抗體的檢測方法,此后ELISA廣泛用于P.betae的田間檢測。

7 甜菜多黏菌與病毒及寄主的互作

1964年KESKIN等[23]發(fā)現(xiàn)甜菜叢根病的發(fā)生與P.betae有關(guān),1973年TAMADA[37]證明P.betae傳播的BNYVV為叢根病的病原。P.betae持久性傳播BNYVV,其休眠孢子在土中至少可生存15年[38]。

TAMADA等[39]通過S0(RNA-1+2)的17代機械接種獲得了2種通讀蛋白部分缺失的RNA2突變體RNA-2a和RNA-2b,并用分別含有這2種突變體的P.betae(S-0a和G-0b)進行傳毒實驗,發(fā)現(xiàn)只有野生型突變體S0能夠傳播,而突變型不能傳播,且含有RNA3和RNA4的突變型依舊不能傳播,因此推測RNA2編碼的通讀蛋白在P.betae傳播BNYVV的過程中發(fā)揮著重要的作用,為了更好地確定RNA2通讀蛋白上與菌傳相關(guān)的區(qū)域,又構(gòu)建了一系列的C端丙氨酸掃描突變體,確定KTER基序與菌傳效率密切相關(guān)[40],P.graminis傳播的SBWMV的通讀蛋白上也存在類似的基序[41]。

LEMAIRE等[42]利用不同RNA組分的BNYVV分離物,通過P.betae接種甜菜發(fā)現(xiàn),不含有全長RNA3和RNA4的病毒分離物傳播效率低,而能夠成功侵染甜菜的分離物具有全長RNA3和RNA4,說明在自然侵染條件下,RNA3和RNA4影響P.betae傳播BNYVV的效率。TAMADA等[43]卻認為RNA3和RNA4在P.betae傳毒過程中發(fā)揮著不同的作用。他們利用S0、S3(RNA-1+2+3)、S4(RNA-1+2+4)、S34(RNA-1+2+3+4)四個不同的分離物,用P.betae對甜菜進行傳毒實驗,發(fā)現(xiàn)S34的傳毒效率遠高于S4,且被侵染的根中病毒含量更高,S4的傳毒效率遠高于S3,S0的傳毒效率極低;而這些分離物在機械接種局部寄主番杏時,S4和S0在接種葉中增殖情況無差異,說明S0的傳毒效率低下不是由于病毒增殖能力降低而引起的;當(dāng)用稀釋過的P.betae接種甜菜時,S3侵染的根中病毒含量高于S4和S0,說明RNA3影響病毒在根中的繁殖,而與傳毒效率無關(guān),決定傳毒效率的是RNA4,RAHIM等[44]用O11-3(RNA1+2+3)、O11-4(RNA1+2+4)、O11(RNA1+2+3+4)及其RNA4突變體接種大果甜菜也得到了相似結(jié)論。RAHIM和韓成貴等[44-45]用BNYVV RNA4侵染性克隆構(gòu)建系列編碼框突變體,通過傳毒實驗證明RNA4編碼區(qū)各種缺失突變體都顯著抑制P.betae的傳播,說明RNA4編碼的p31蛋白對于P.betae的傳播是必需的。

P.betae不同寄主?；蛿y帶或傳播BNYVV的能力也存在差異,分離自藜、反枝莧和馬齒莧的P.betae專化型既無法侵染甜菜,也不能攜帶BNYVV;帶毒甜菜?；蚉.betae在侵染小藜后可脫毒成為無毒菌株,而當(dāng)這些無毒P.betae重新從感染BNYVV的甜菜植株獲毒后可以再次傳播病毒[38]。通過免疫金標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)RNA3編碼的p25和RNA4編碼的p31是病毒唯一定位于P.betae游動孢子細胞核中的蛋白,很有可能在傳毒中發(fā)揮著積極的作用;同時,研究發(fā)現(xiàn)病毒在P.betae內(nèi)滯留超過了一個生命周期,因此推測P.betae不僅僅是BNYVV的傳播介體,也很有可能是病毒新的宿主[4]。

轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)無毒的P.betae侵染甜菜時,大部分防御相關(guān)基因表達下調(diào),例如:抗性基因類似物(resistance gene analogues,RGA)、轉(zhuǎn)錄因子、細胞壁過氧化物酶家族,而參與氧化還原動態(tài)平衡的基因表達上調(diào),如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferase,GSTs)。當(dāng)帶BNYVV的P.betae侵染甜菜時,P.betae生活史的第一個階段明顯加快,且植物防御通路基因、病程相關(guān)蛋白、與細胞壁完整性相關(guān)基因以及酚類化合物的合成上調(diào)。表明甜菜與P.betae為共生關(guān)系,BNYVV能夠促進P.betae的侵染從而達到快速傳播的目的[46]。

8 綜合防治方法

8.1 農(nóng)業(yè)栽培防治

P.betae在pH 5.5～8.5侵染性較強[15],pH不會影響休眠孢子的存活,但是酸性環(huán)境能夠抑制孢子的萌發(fā),降低游動孢子的游動和存活率,因此可以通過調(diào)節(jié)土壤pH達到防治的目的,但同時也要注意作物適宜的pH[47]。由于P.betae的休眠孢子可以在土壤中存活多年,因此輪作非常必要,輕病田4年以上輪作,重病田7年以上輪作。

低溫不利于P.betae的侵染,因此可以提前播種期,避開敏感期。培育壯苗,增強植株的抗病能力也能起到一定的防治作用[48-49]。同時要做好農(nóng)具機械消毒工作,拔除并焚燒病株,控制病原傳播以及土壤中孢子的含量[50]。另外,做好病蟲害的防治工作,及時中耕、除草、間苗定苗,及時追肥澆水、保證灌水質(zhì)量,保持田間不積水,地塊通風(fēng),營造良好的生長條件,增強植株自身的抗病能力,但同時也要注意灌溉的時期以及排水,防止土壤水分飽和及土壤溫度升高刺激游動孢子的萌發(fā)和釋放[47]。

8.2 化學(xué)防治

用甲基溴、1,3-二氯丙烯或甲胺咪唑鈉等對甜菜田進行土壤熏蒸可以顯著減少病害,提高產(chǎn)量,但該方法成本較高以及會對環(huán)境產(chǎn)生不良影響,因此不適合大規(guī)模的使用[47,51-52]。

8.3 抗性品種

具有P.betae抗性的甜菜資源主要包括濱海甜菜(Betamaritima)、白花甜菜(B.corollinae)和碗狀花甜菜(B.patellares)[53]。濱海甜菜對P.betae的抗性屬于數(shù)量遺傳,盡管這能增加抗性保持時間,但對抗性品種的選育帶來了困難[54]。P.betae游動孢子侵染甜菜后,休眠孢子堆在感病品種根部的表皮細胞中大量形成,在抗性甜菜中,游動孢子能夠穿透根部表皮,但是很少觀察到進一步擴散,以及形成休眠孢子[55-56],通過單體附加系的研究,證明誘導(dǎo)休眠孢子形成的基因位于寄主植物的IV和VIII染色體上[57]。2009年ASHER等[58]從100多份野生甜菜種質(zhì)資源中篩選出了2個抗P.betae的基因,定位于IV和IX染色體上,分別命名為pb1和pb2,在回交子一代群體中,對P.betae和BNYVV的抗性QTL共定位在染色體IV上,表明對叢根病的抗性受傳播介體抗性的影響,這與之前BARR等人觀察到的現(xiàn)象是一致的[55]。抗BNYVV基因已在高產(chǎn)的甜菜品種中廣泛運用,但目前已出現(xiàn)抗病品種“抗性喪失”的報道[59-60],未來pb1/pb2將會給甜菜抗性育種帶來新的可能性。

8.4 生物防治

2003年,王琦等[61]從甜菜叢根病重病田的輕病株根面和根內(nèi)分離得到了26個放線菌,其中3個鏈霉菌屬(Streptomyces)分離物可以拮抗P.betae,其代謝液能夠抑制P.betae休眠孢子的萌發(fā),使游動孢子游動減緩。芽孢桿菌分泌的環(huán)狀脂肽能夠誘導(dǎo)甜菜產(chǎn)生系統(tǒng)抗性從而增強對P.betae的抗性[62]。此外,惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、籃狀菌(Talaromyces)和木霉(Trichoderma)也能降低P.betae的種群數(shù)量[63-64]。

9 討論與展望

多黏菌本身對寄主植物的影響較小,但由于其常作為病毒介體傳播病毒,對甜菜、小麥以及其他寄主存在著巨大的威脅。多黏菌屬目前包括2個種,其中P.graminis傳播至少15種病毒,包括土傳小麥花葉病毒(soil-borne wheat mosaic virus)、小麥梭條花葉病毒(wheat spindle streak mosaic virus)、小麥黃花葉病毒(wheat yellow mosaic virus)、水稻條紋壞死病毒(rice stripe necrosis virus)[65]。P.betae除了傳播BNYVV之外,同時它也能傳播甜菜土傳花葉病毒、甜菜土傳病毒和甜菜Q病毒,這3種病毒偶爾會與BNYVV復(fù)合侵染甜菜[1]。

P.betae和P.graminis從形態(tài)上難以區(qū)分,WARD等[29,66-67]通過ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列成功地區(qū)分了P.graminis和P.betae。進一步根據(jù)rDNA序列將P.graminis分為5個核糖型,同時有研究表明溫度和寄主范圍等生態(tài)特征與核糖型之間存在一定的聯(lián)系[68]。LEGRèVE等[69]根據(jù)生態(tài)特征以及ITS序列將P.graminis分為了5個?；?P.graminisf.sp.temperata、P.graminisf.sp.tepida、P.graminisf.sp.tropicalis、P.graminisf.sp.subtropicalis以及P.graminisf.sp.colombiana,這5個?；团cWARD和MORALES等提出的5個核糖型Pg-I、Pg-II、Pg-IIIaorb、Pg-IVaorb以及Pg-V相對應(yīng)。陳建平[70]團隊分析了被土傳小麥病毒侵染的小麥根部P.graminis的核糖型,發(fā)現(xiàn)中國傳播土傳小麥病害的P.graminis屬于核型Ib(Pg-Ib)的一個亞支,也可能屬于核型IIa(Pg-IIa)。然而目前關(guān)于P.betae遺傳多樣性的研究還較少,前人試圖根據(jù)ITS區(qū)域分析P.betae的遺傳多樣性,但均發(fā)現(xiàn)P.betae在ITS區(qū)并沒有多態(tài)性,因此通過比較基因組學(xué)尋找更精確的基因標(biāo)記(genotyping markers)以明確P.betae的遺傳多樣性對于推動P.betae的研究具有重要意義。此外,當(dāng)BNYVV存在時,P.betae生活史的第一個階段會加快,從而促進病毒的侵染速度,植物抗逆基因表達水平上調(diào)[46],若能明確其中的機制,對于抗性品種培育具有指導(dǎo)意義。