綠色電子供給和細(xì)胞代謝調(diào)控型反硝化研究

劉 超, 范心韻, 張學(xué)萌, 陳 闖, 朱夢茹, 陳銀廣

(同濟(jì)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實驗室, 上海 200092)

0 引 言

氮素循環(huán)是生物圈內(nèi)基本的物質(zhì)循環(huán)過程之一,微生物在不同價態(tài)的含氮物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。由于含氮產(chǎn)品的大量生產(chǎn)和使用,水環(huán)境中的氮污染問題日趨嚴(yán)重,主要包括市政生活污水、工業(yè)含氮廢水以及氮肥施用過程中的地表水污染。作為全球氮循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),微生物反硝化是去除水環(huán)境中硝酸鹽污染、實現(xiàn)氮元素返回大氣和維持氮平衡的重要途徑[1-2]。反硝化微生物通常以有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)為電子供體,硝酸鹽為電子受體,使硝酸鹽逐步還原為亞硝酸鹽、一氧化氮、氧化亞氮,最后形成氮?dú)狻Ｆ渲?依賴于有機(jī)碳源供給的異養(yǎng)反硝化是目前主流的生物脫氮工藝,對于具有低碳氮比特性的市政污水等,通常需要額外補(bǔ)加昂貴的乙酸、葡萄糖等商品碳源以獲得較好的反硝化效果,這導(dǎo)致了運(yùn)行成本提高和碳排放量增加。在“雙碳”目標(biāo)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的背景下,開發(fā)商品碳源投加減量或無機(jī)自養(yǎng)低碳反硝化的脫氮新技術(shù)成為學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界的共識。

已有文獻(xiàn)主要綜述了以S、Fe、H2等無機(jī)物作為電子供體的硫基自養(yǎng)[3-4]、鐵基自養(yǎng)[5-6]和氫基自養(yǎng)低碳反硝化技術(shù)[7-8]。近年來,科研界不僅致力于開發(fā)新型反硝化無機(jī)綠色電子供體如光生電子[9-12],還對短鏈氣態(tài)烷烴[13-16]、有機(jī)廢棄物[17-20]等綠色有機(jī)碳源開展了大量研究。同時,也有國內(nèi)外學(xué)者在不增加有機(jī)碳源的前提下,通過提升電子供體的利用效率獲得高效的反硝化性能,達(dá)到節(jié)約碳源的生物脫氮目的[21-24]。本文首先系統(tǒng)梳理了光電反硝化過程中光敏劑的種類、主導(dǎo)功能微生物、光敏劑-微生物復(fù)合方式以及光電營養(yǎng)反硝化的應(yīng)用現(xiàn)狀;然后歸納總結(jié)了近年來生物反硝化過程中使用的短鏈氣態(tài)烷烴等綠色有機(jī)碳源;最后從促進(jìn)電子傳遞和增強(qiáng)反硝化酶活性兩方面,探討分析了基于細(xì)胞代謝調(diào)控提升電子供體利用效率來促進(jìn)反硝化的作用原理,以期拓展對高效脫氮機(jī)制的理解,并展望反硝化生物脫氮技術(shù)的未來發(fā)展方向。

1 光生電子驅(qū)動厭氧反硝化

光生電子驅(qū)動的厭氧反硝化是一種新興的硝酸鹽還原過程,主要基于光敏劑-脫氮微生物雜化復(fù)合體。清潔的光能激發(fā)光敏劑產(chǎn)生光電子,供給不能利用光能的脫氮微生物進(jìn)行反硝化代謝,又稱之為光電營養(yǎng)反硝化。光電營養(yǎng)反硝化效應(yīng)因其在太陽能利用方面的優(yōu)異表現(xiàn)和對生物地球化學(xué)過程的新認(rèn)識,且光生電子兼具低碳綠色環(huán)保和成本低廉等優(yōu)勢,受到研究人員和環(huán)境工程師廣泛關(guān)注。

1.1 光敏劑種類

在光敏劑-微生物雜化體系中,光敏劑的類別決定了光生電子的供給能力。目前,應(yīng)用于光電反硝化體系的光敏劑主要包括固相的TiO2[25]、CdS[9]、赤鐵礦[26]、C3N4[27]和溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)等[11]。例如,CHEN等首次構(gòu)建了TiO2光陽極與微生物陰極體系,陽極在30 mW/cm2的紫外光照射下產(chǎn)生的電子傳遞給陰極的脫氮微生物[25]。該反應(yīng)體系硝酸鹽還原率超過了95%,且該效率與乙酸作碳源、碳氮比為9的異養(yǎng)反硝化脫氮效率相當(dāng)。研究人員又通過硫化鎘-脫氮硫桿菌Thiobacillusdenitrificans雜化復(fù)合體(T.denitrificans-CdS)高效還原硝酸鹽[28],但該體系受反應(yīng)過程中產(chǎn)生的超氧化物自由基等活性氧物質(zhì)和游離亞硝酸影響,反硝化副產(chǎn)物氧化亞氮N2O含量較高。隨后,CHEN等利用Mn3O4納米酶修飾T.denitrificans-CdS,構(gòu)建了T.denitrificans-CdS@Mn3O4復(fù)合體系,發(fā)現(xiàn)Mn3O4可以有效淬滅活性氧,使得硝酸鹽還原率顯著提升和N2O排放量大幅降低[10]。與添加人工合成的光敏劑不同,生物自合成材料具有生物相容性好等特性。反硝化微生物銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa通過在胞內(nèi)合成硒化物/硫化物量子點(diǎn)[12],自組裝形成光敏劑-生物復(fù)合體,實現(xiàn)了低碳氮比廢水中硝酸鹽的有效去除。

考慮到光照的持續(xù)供給問題,研究人員開發(fā)了一種新型光敏劑,氰酰胺功能化的庚嗪環(huán)基聚合物(NCN-CNx)[27]。與傳統(tǒng)的光電反硝化體系相比,該體系在黑暗環(huán)境下表現(xiàn)出優(yōu)異的硝酸鹽去除性能,因為深色光催化劑(NCN-CNx)可以儲存光生電子,并根據(jù)需要在無光照條件下通過石墨烯助催化劑釋放電子供反硝化微生物使用。進(jìn)一步分析表明,NCN-CNx主要增強(qiáng)了反硝化微生物的硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶和過氧化氫酶活性,并提高了電子傳遞速率。這些發(fā)現(xiàn)為延時光催化劑促進(jìn)反硝化的機(jī)理和建立硝酸鹽晝夜連續(xù)去除的光催化系統(tǒng)提供了新的見解。

DOM的生物地球化學(xué)歸趨在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有重要的環(huán)境意義。DOM與微生物互作關(guān)系的認(rèn)識通常僅限于DOM作為電子穿梭體或異養(yǎng)菌的碳源。有趣的是,研究人員最近證明了DOM在陽光照射的水生態(tài)系統(tǒng)中作為光敏劑,驅(qū)動模式反硝化微生物脫氮硫桿菌進(jìn)行脫氮代謝,且微生物反硝化基因(包括Nar、Nir、Nor和Nos)的表達(dá)顯著上調(diào)[11]。這不僅提供了一種促進(jìn)地表水環(huán)境中光驅(qū)反硝化的策略,而且由于DOM成本低且應(yīng)用廣泛,DOM主導(dǎo)的光電反硝化技術(shù)極具前景。

1.2 功能微生物

脫氮微生物為光電反硝化過程提供關(guān)鍵的硝酸鹽還原反應(yīng)模塊。微生物純培養(yǎng)技術(shù)有利于確定實驗因素和研究脫氮代謝途徑。目前,應(yīng)用于光電反硝化過程的主要純菌為脫氮硫桿菌Thiobacillusdenitrificans和銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa。Thiobacillusdenitrificans是一種廣泛分布的嚴(yán)格化能自養(yǎng)生物,具有“硝酸鹽→亞硝酸鹽→一氧化氮→氧化亞氮→氮?dú)狻钡耐暾剡€原途徑,是研究反硝化過程的模式生物[29]。起初,它被發(fā)現(xiàn)能夠接受外部固體電極的電子進(jìn)行反硝化[30-32]。近年來,眾多研究證明盡管T.denitrificans無法直接利用光能,卻可以吸收光激發(fā)光敏劑產(chǎn)生的電子進(jìn)行生長代謝并實現(xiàn)硝酸鹽的去除[10-11, 28]。Pseudomonasaeruginosa也具有完整的硝酸鹽還原為氮?dú)獾纳x途徑,被證實可以有效利用光生電子進(jìn)行厭氧反硝化反應(yīng)[12, 26]。與T.denitrificans不同,P.aeruginosa可以進(jìn)行異養(yǎng)生長,這表明能夠接收外部光電子的微生物具備作為光電反硝化體系構(gòu)建模塊的潛力。后續(xù)研究可以深入解析不同微生物對光生電子的吸收和利用路徑,如調(diào)控該途徑的關(guān)鍵運(yùn)輸?shù)鞍缀?或介質(zhì),尋找更優(yōu)的電子傳遞路徑,并可借助基因工程等手段調(diào)控電子代謝過程,促進(jìn)電子的高效吸收與利用。

混合微生物體系對培養(yǎng)環(huán)境條件要求相對于純菌更低,穩(wěn)定性高,更接近實際自然環(huán)境,被廣泛應(yīng)用于光電營養(yǎng)反硝化。ZHANG等通過在負(fù)載了C3N4/TiO2復(fù)合材料的海綿上原位培養(yǎng)生物膜,成功構(gòu)建了光敏劑-生物膜雜化體系[33]。微生物群落分析表明,酸桿菌門Actinobacteria和綠彎菌門Chloroflexi得以大量富集。以往研究發(fā)現(xiàn),Actinobacteria和Chloroflexi對于氮循環(huán)過程中硝酸鹽和亞硝酸鹽的還原具有重要作用[34-35]。與易受光催化影響的單一細(xì)菌物種相比,生物膜在該耦合系統(tǒng)中更能抵抗不利條件,表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性。ZHU等則發(fā)現(xiàn)在光電營養(yǎng)反硝化體系的構(gòu)建過程中,反硝化微生物鞘氨醇單胞菌科Sphingomonadaceae、黃單胞菌科Xanthomonadaceae、幾丁質(zhì)菌科Chitinophagaceae和環(huán)桿菌科Cyclobacteriaceae的豐度大幅提升[36]。ZHOU等的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的微生物富集現(xiàn)象[27]。

1.3 光敏劑-微生物復(fù)合方式與光電反硝化的應(yīng)用

光敏劑與微生物的結(jié)合位置決定了微生物吸收光生電子的行為和路徑。如圖1(a)所示,最初的研究是將光敏劑制作成陽極,光照激發(fā)陽極半導(dǎo)體材料產(chǎn)生電子,經(jīng)外部導(dǎo)線傳輸至陰極電極,陰極室的微生物從電極上攝取電子進(jìn)行反硝化反應(yīng)[25]。這種構(gòu)建方式可以將光生電子產(chǎn)生模塊與微生物催化單元有效分開,避免了光照對微生物細(xì)胞的潛在不利影響,但是該過程涉及“光生電子→電極→微生物”多級電子傳輸步驟。為了縮短電子的傳輸步驟和距離,光敏劑被負(fù)載在反硝化微生物的細(xì)胞表面,光敏劑中產(chǎn)生的光生電子直接穿過細(xì)胞膜并輸送到細(xì)胞內(nèi)以驅(qū)動或增強(qiáng)生物反硝化代謝過程[10, 28, 37](圖1(b))。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)電子跨膜轉(zhuǎn)移需要克服細(xì)胞膜屏障,傳輸動力學(xué)較為緩慢[38-39],限制了光電反硝化反應(yīng)速率。圖1(c)展示了一種巧妙的雜化體系構(gòu)建方式[12],通過在微生物胞內(nèi)合成很小尺寸的量子點(diǎn),使得光生電子直接在胞內(nèi)產(chǎn)生,從而不僅明顯縮減電子至胞內(nèi)代謝反應(yīng)位點(diǎn)的距離還規(guī)避了電子的跨膜傳質(zhì)障礙。

近年來,從最初的實驗室硝酸鹽配水實驗,光電反硝化研究逐步面向?qū)嶋H廢水和地表水等實際場景。例如,ZHU等在地表水中原位構(gòu)建了光敏劑TiO2-周叢生物膜系統(tǒng),其中,TiO2不但優(yōu)化了周叢生物膜中反硝化微生物的組成,為微生物提供光生電子,而且通過刺激細(xì)胞外聚合物的分泌(尤其是腐殖酸和蛋白質(zhì))促進(jìn)光生電子傳遞,從而有效去除了地表水中硝酸鹽,為光電營養(yǎng)反硝化在實際水體環(huán)境中的應(yīng)用提供了堅實基礎(chǔ)[36]。又有研究發(fā)現(xiàn),在不添加外源電子供體的條件下,Pseudomonasaeruginosa-CdSexS1-x生物雜化體系能夠以光激發(fā)產(chǎn)生的電子為能源進(jìn)行脫氮生物代謝反應(yīng),從而有效去除城市污水、養(yǎng)殖廢水和電鍍廢水中的硝酸鹽[12],有力驗證了光電營養(yǎng)反硝化在實際水處理場景中的適用性。

圖1 光電營養(yǎng)反硝化過程中光生電子傳遞途徑Fig. 1 Photogenic electron transfer pathway in the process of photoelectric nutrition denitrification

2 綠色有機(jī)碳源介導(dǎo)生物反硝化

2.1 短鏈氣態(tài)烷烴

天然氣中的短鏈氣態(tài)有機(jī)烷烴主要包括甲烷、乙烷、丙烷等。近年來,以氣態(tài)烷烴作為電子供體,硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體的厭氧反硝化相關(guān)研究引起人們的廣泛關(guān)注。其中,甲烷作為天然氣中占比最高(60%～80%)的烷烴,其主導(dǎo)的反硝化過程被稱為反硝化型厭氧甲烷氧化(Denitrifying Anaerobic Oxidation of Methane,DAOM),因兼具溫室氣體甲烷控制和氮素去除的雙重功能備受推崇。DAOM一般發(fā)生在湖泊、河流底泥和濕地土壤等自然環(huán)境以及污水處理廠中,由DAOM古菌(模式微生物為ANME-2d中的CandidatusMethanoperedensnitroreducens)和DAOM細(xì)菌(模式微生物為NC10門中的CandidatusMethylomirabilisoxyfera)進(jìn)行[14, 40]。近期研究者逐漸關(guān)注丙烷、丁烷等其他短鏈氣態(tài)烷烴作為反硝化電子供體的可能性。例如,GUO等通過富集培養(yǎng)、同位素標(biāo)記實驗和多維宏組學(xué)方法,首次發(fā)現(xiàn)了一種新型的丙烷厭氧氧化耦合反硝化過程并揭示其細(xì)胞代謝機(jī)制。該細(xì)菌屬于Firmicutes門Symbiobacteriia綱譜系,被命名為CandidatusAlkanivoransnitroreducens[15]。

如圖2所示,DAOM古菌、DAOM細(xì)菌和丙烷厭氧反硝化菌的代謝途徑存在較大的差異。在硝酸鹽還原過程中,由于DAOM古菌僅表達(dá)硝酸鹽還 原酶,只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[40]。DAOM細(xì)菌雖然缺少硝酸鹽還原酶,但能夠表達(dá)將亞硝酸鹽還原為氮?dú)獾囊幌盗蟹聪趸竅41]。與DAOM細(xì)菌相比,DAOM古菌還能夠表達(dá)產(chǎn)氨亞硝酸鹽還原酶,將亞硝酸鹽還原為銨進(jìn)而利用[14]。在甲烷氧化過程中,DAOM古菌通過反向產(chǎn)甲烷途徑將甲烷轉(zhuǎn)化為二氧化碳,而DAOM細(xì)菌通過甲烷單加氧酶利用反硝化過程產(chǎn)生的氧氣來氧化甲烷[41]。與DAOM古菌和DAOM細(xì)菌不同,Ca.A.nitroreducens能夠在氧化丙烷的同時進(jìn)行完整的反硝化過程,并能夠?qū)喯跛猁}還原為銨,同時還表達(dá)了一氧化氮→氧化亞氮→氮?dú)獾拇x通路[15]。研究結(jié)果表明,Ca.A.nitratireducens參與厭氧丙烷氧化的關(guān)鍵基因主要是Akylsuccinate synthase alpha subunit (AssAD),其在富馬酸介導(dǎo)下完成丙烷活化第一步,生成琥珀酸丙酯/異琥珀酸丙酯。Ca.A.nitratireducens含有進(jìn)一步降解琥珀酸丙酯/異琥珀酸丙酯所需的所有基因,包括用于碳骨架重排的甲基丙二酰輔酶a變位酶(McmA)基因、用于脫羧的丙酰輔酶a羧化酶(PccB)基因和β氧化的關(guān)鍵基因等(圖2(c))[15]。

圖2 DAOM古菌Ca. M. nitroreducens、DAOM細(xì)菌Ca. M. oxyfera和丙烷厭氧反硝化菌Ca. A. nitroreducens的代謝途徑Fig. 2 Metabolic pathways of nitrate reduction in DAOM archaea Ca. M. nitroreducens, DAOM bacteria Ca. M. oxyfera and propane anaerobic denitrification bacteria Ca. A. nitroreducens

污水處理廠厭氧段產(chǎn)生的甲烷一部分逸散入大氣,另一部分仍溶解在污水中(10～30 mg/L)[13]。通過在反硝化段馴化引入DAOM古菌和細(xì)菌,能夠利用污水中溶解的甲烷作為電子供體進(jìn)行反硝化脫氮,不僅可以減少乙酸等商品碳源的投入,還能夠避免甲烷進(jìn)入大氣而加劇溫室效應(yīng)。已有較多研究在實驗室規(guī)模下將DAOM古菌和細(xì)菌引入反硝化系統(tǒng),并實現(xiàn)了長期高效的運(yùn)行。經(jīng)過馴化,同時存在DAOM微生物和厭氧氨氧化微生物的顆粒污泥,具備1.0 kg N/(m3·d)的脫氮速率[42]。將DAOM過程和厭氧氨氧化過程耦合的生物膜系統(tǒng),能夠?qū)崿F(xiàn)85%的溶解性甲烷去除和超過99%的脫氮效果。質(zhì)量平衡研究表明DAMO細(xì)菌和DAMO古細(xì)菌確實共同促進(jìn)了甲烷和氮素的去除,這項技術(shù)可用于降低污水處理廠碳足跡和常規(guī)有機(jī)碳源的使用[13]。丙烷和丁烷同樣在實驗室規(guī)模下被用作反硝化的電子供體,研究表明微氧條件下丙烷和丁烷能夠支持相關(guān)微生物進(jìn)行反硝化,硝酸鹽去除速率約為40～50 mg/(L·d)[16]。盡管烷烴營養(yǎng)型反硝化具有諸多優(yōu)勢,但穩(wěn)定的烷烴供應(yīng)、氣液傳質(zhì)、關(guān)鍵功能微生物生長速率慢和富集周期長等方面仍亟待解決以實現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用。

2.2 有機(jī)廢棄物

不同碳源構(gòu)成了異養(yǎng)反硝化生長與代謝的基礎(chǔ)。一方面,反硝化微生物可利用的碳源多種多樣,比如乙酸等揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)、糖類、醇類,碳源的種類會影響反硝化微生物的脫氮性能[43-44],也決定了硝酸鹽還原速率和其中間產(chǎn)物如亞硝酸鹽與N2O的積累[45]。另一方面,有機(jī)廢棄物富含多糖等高生物降解性物質(zhì),通過厭氧生物發(fā)酵作用產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物VFAs、易降解糖類葡萄糖等,是異養(yǎng)反硝化過程的優(yōu)質(zhì)碳源[17, 20]。近年來,國內(nèi)外大量研究使用市政污泥、餐廚垃圾發(fā)酵液為代表的液態(tài)碳源和木質(zhì)纖維素類廢棄物為代表的固體碳源作為反硝化外加碳源,以替代昂貴的甲醇、乙酸、葡萄糖等商品碳源,在降低反硝化的運(yùn)營成本基礎(chǔ)上,還能實現(xiàn)廢棄物的減量化,充分響應(yīng)低成本綠色脫氮水處理技術(shù)的發(fā)展趨勢[18, 46-47]。

以有機(jī)廢物發(fā)酵液作為反硝化脫氮的外加碳源不僅能夠獲得優(yōu)異的脫氮效果,還能減少反應(yīng)過程中氧化亞氮等的排放,因此備受研究人員青睞。例如,ZHU等發(fā)現(xiàn)使用剩余污泥堿性發(fā)酵液作為碳源,反硝化脫氮性能良好,且產(chǎn)生的N2O和NO的排放相比于商品碳源乙酸實驗組分別減少了68.7%和50.0%[48]。又有學(xué)者綜合比較了初沉污泥、濃縮的廢活性污泥、餐廚垃圾、廚余垃圾、脂類廢物和乳清粉6種有機(jī)廢棄物厭氧發(fā)酵液作為反硝化脫氮的碳源潛力[18]。結(jié)果表明,以發(fā)酵液為碳源的反硝化脫氮性能均優(yōu)于常規(guī)碳源投加組(甲醇和乙酸)。其中,乳清粉發(fā)酵液實驗組的反硝化速率最高,達(dá)到了17.6 mg NOx-N/(g VSS·h),幾乎是以甲醇為碳源組的4倍,且氮去除率高達(dá)99%,無亞硝酸鹽積累。值得注意的是,發(fā)酵液中的銨和磷需要進(jìn)行回收以防止氮磷負(fù)荷增加,同時過濾等相質(zhì)分離工藝是處理發(fā)酵液獲得反硝化液態(tài)碳源的重要步驟[17, 49]。

例如,富含纖維素的生物質(zhì)例如稻草、秸稈、玉米芯、木屑等均可作為反硝化的固體緩釋碳源,用于低成本處理含氮污水[18-19, 46]。ZHU等使用玉米粉作為反硝化菌PseudomonasstutzeriPCN-1的碳源,不但脫氮效果良好,而且與琥珀酸鹽、葡萄糖、乙酸鹽、檸檬酸鹽等碳源相比,反硝化過程中溫室氣體氧化亞氮的排放降低了52.07%～99.81%[50]。又有研究證實堿預(yù)處理的玉米芯作為焦化廢水反硝化脫氮的固體碳源時,廢水中90%的硝酸鹽能夠被有效去除[51]。SUN等選取玉米芯、小麥秸稈、鋸末和核桃殼4種農(nóng)業(yè)廢棄物作為發(fā)硝化的固體碳源,發(fā)現(xiàn)玉米芯和小麥秸稈實驗組的脫氮性能與商品碳源乙酸鈉組相當(dāng)[18]。機(jī)理研究發(fā)現(xiàn),反硝化性能最初依賴于固體碳源釋放的溶解性有機(jī)物,而與纖維素和半纖維素分解相關(guān)的糖苷水解酶、碳水化合物酯酶表達(dá)上調(diào)和GAPDH等糖酵解功能基因的富集,是保證電子供體持續(xù)供應(yīng)的內(nèi)在驅(qū)動力。

2.3 微生物內(nèi)碳源

除了常見的乙酸等胞外碳源,反硝化功能菌還可利用內(nèi)碳源進(jìn)行氮代謝。微生物的內(nèi)碳源主要包括細(xì)胞內(nèi)的聚羥基鏈烷酸酯、聚-β-羥基丁酸、聚-β-羥基戊酸、聚-β-羥基-2-甲基戊酸等,內(nèi)碳源的使用能夠有效減少外部碳源的投加,節(jié)省運(yùn)營成本,是低碳脫氮水處理的重要途徑。內(nèi)碳源的形成過程通常包括厭氧-缺氧階段。如圖3所示,厭氧階段反硝化聚磷菌和反硝化聚糖菌降解儲存在細(xì)胞中的聚磷酸鹽或糖原,獲得吸收VFAs合成聚羥基鏈烷酸酯的能量;缺氧階段,微生物分解細(xì)胞內(nèi)碳源產(chǎn)生大量電子用于硝酸鹽的還原,并合成聚磷酸鹽或者糖原[52-55]。內(nèi)源性反硝化適用于低碳氮比污水的深度脫氮[56]。FAN等研究發(fā)現(xiàn),反硝化聚磷菌與反硝化聚糖菌在缺氧脫氮除磷過程中具有協(xié)同作用,其充分利用了內(nèi)碳源實現(xiàn)低碳脫氮,有效解決了市政污水處理碳源不足的問題[57]。

根據(jù)文獻(xiàn)報道,反硝化聚磷菌主要包括CandidatusAccumulibacter、Dechloromonas、Acinetobacter、Thauera等,反硝化聚糖菌有Competibacter、Defluviicoccus、Contendobacter、Sphingobium以及Amaricoccus等[58-60]?；旌暇褐蟹聪趸哿拙途厶蔷纳婧蛢?nèi)碳源合成能力主要受溶解氧、胞外物質(zhì)等因素的影響。例如,低溶解氧濃度能夠明顯增強(qiáng)微生物細(xì)胞基質(zhì)利用、能量合成和代謝調(diào)控相關(guān)功能基因的活性,有利于聚磷菌Dechloromonas的生長增殖和維持較高的脫氮除磷代謝效率[60]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)胞外聚合物中的有機(jī)物如酪氨酸類物質(zhì),能夠被微生物用于合成細(xì)胞內(nèi)碳源聚羥基鏈烷酸酯[61]。有些內(nèi)碳源反硝化菌還能夠與同步硝化反硝化[58, 62]、厭氧氨氧化[63]、短程硝化[64]相關(guān)聯(lián)。例如,WANG等發(fā)現(xiàn)反硝化聚磷菌Thauerasp.菌株以2.85、1.98和2.42 mg N/(L·h)的平均速率同時去除氨、亞硝酸鹽和硝酸鹽[58]。LU等采用內(nèi)碳源反硝化耦合厭氧氨氧化工藝,在進(jìn)水碳氮比為3.16時,使得出水總氮低至1.87 mg/L;反硝化聚糖菌在缺氧階段使用細(xì)胞內(nèi)碳源將硝酸鹽還原并積累大量亞硝酸鹽提供給厭氧氨氧化菌,實現(xiàn)深度脫氮[63]。

圖3 反硝化聚磷菌和反硝化聚糖菌脫氮原理示意圖Fig. 3 Diagram of nitrate removal by denitrifying polyphosphate accumulating bacteria and glycogen accumulating bacteria

3 基于細(xì)胞代謝調(diào)控的高效反硝化

反硝化的本質(zhì)是微生物利用電子供體還原高價態(tài)硝態(tài)氮的過程。與前文所述優(yōu)化電子供體的思路不同,學(xué)者們發(fā)現(xiàn)在不增加碳源的前提下,通過提升電子利用效率也能夠促進(jìn)反硝化,從而達(dá)到節(jié)約碳源的目的。其中,調(diào)控反硝化過程的電子傳遞和消耗備受關(guān)注。

3.1 促進(jìn)電子傳遞

近年來,通過添加氧化還原介體,提高電子傳遞調(diào)控蛋白活性或表達(dá)水平來促進(jìn)電子傳遞增強(qiáng)反硝化脫氮的研究備受關(guān)注。氧化還原介體能夠可逆地氧化和還原,在多個氧化還原反應(yīng)中充當(dāng)電子載體,并通過降低總反應(yīng)活化能來加速反應(yīng)[24, 66]。一些外源的氧化還原介體,諸如腐殖酸[67]、醌類物質(zhì)[23, 68]、Fe-Pd/多壁碳納米管[69]等,已被廣泛報道用于促進(jìn)微生物反硝化脫氮。氧化還原介體大多含有醌、酚等氧化還原基團(tuán),在反硝化過程中可能具有類似于泛醇/泛醌的功能,在電子傳輸中起重要作用[70]。例如,生物炭中含有大量具有氧化還原特性的醌類化合物,一些官能團(tuán)還可以作為反硝化細(xì)菌的直接電子供體,直接或間接促進(jìn)種間電子轉(zhuǎn)移。SATHISHKUMAR等探究了不同溫度下制備的生物炭對反硝化的影響,結(jié)果表明,400 ℃制備的生物炭含有較多的氧化還原活性物質(zhì),刺激C型細(xì)胞色素等導(dǎo)電物質(zhì)的生成,提高了電子傳遞效率從而促進(jìn)反硝化過程[21]。又如,JIA等通過在微生物細(xì)胞中原位合成鈀納米顆粒[22],發(fā)現(xiàn)其能夠顯著提升Fe-S中心活性并加速電子傳遞,從而促進(jìn)反硝化脫氮。外源投加半胱氨酸也被證實提高了反硝化細(xì)菌胞內(nèi)電子傳遞相關(guān)蛋白的表達(dá),增強(qiáng)了反硝化效果[71]。盡管外源氧化還原供體可以加速反硝化過程,但是由于其價格高昂且有副產(chǎn)物產(chǎn)生,不適合大規(guī)模工程應(yīng)用。因此,近年來一些研究者聚焦于微生物分泌的內(nèi)源性氧化還原介質(zhì),如黃素類、吩嗪類和細(xì)胞色素類等,并探究了其對反硝化過程的影響[72-73]。WANG等發(fā)現(xiàn)微生物分泌的胞外聚合物在電子傳遞鏈中起到類似于醌環(huán)的作用,可以作為電子載體,加速電子傳輸,使得硝酸鹽還原率增加了1.42倍[24]?？梢?通過內(nèi)源產(chǎn)生的氧化還原介質(zhì)提高電子傳遞效率能夠強(qiáng)化電子供體的利用,在不額外增加商品碳源的前提下,提升反硝化性能,對低成本生物脫氮具有重要意義。

圖4 常規(guī)反硝化過程電子傳遞途徑示意圖Fig. 4 The schematic diagram of canonical electron transport pathway of denitrification process

3.2 增強(qiáng)反硝化酶活性

反硝化過程中的電子消耗過程主要依賴與反硝化相關(guān)酶的活性,而反硝化酶的活性受到碳源種類和含量、溫度、pH和溶解氧等因素的影響。除了優(yōu)化上述反應(yīng)條件,在電子傳遞基礎(chǔ)上,還有一些研究探討了對反硝化酶活性的調(diào)控。提高反硝化酶活性通常不是獨(dú)立的生物化學(xué)過程,而是與群落結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及電子傳遞等要素息息相關(guān)。例如,WANG等制備的Fe-Pd/多壁碳納米管誘導(dǎo)電子流向反硝化代謝和促進(jìn)電子傳遞的同時,使得亞硝酸鹽還原酶活性提高了203.9%[69]。又有研究發(fā)現(xiàn)將廢棄活性污泥中提取的胞外聚合物用作氧化還原介體,投加到反硝化生物反應(yīng)器中,不僅促進(jìn)了電子傳遞,還使得硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶活性分別提高了29.7%和25.4%[24]。SONG等利用生物炭與聚氨酯海綿復(fù)合的新型生物載體,不但提高了反硝化細(xì)菌和電活性細(xì)菌豐度,而且提高了硝酸鹽還原酶的活性[74]。

除了上述采用功能性材料調(diào)控反硝化酶活性的方法,物理學(xué)的磁場和電場調(diào)控也是提高反硝化酶活性的重要手段。例如,WANG等采用物理方法設(shè)置微弱磁場,顯著增強(qiáng)了以糖蜜為碳源的反硝化系統(tǒng)中各個反硝化酶的活性,并優(yōu)化了脫氮微生物的群落結(jié)構(gòu)[75]。又有研究證實0.2 V的直流輸出電壓的弱電刺激能夠大幅增強(qiáng)硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶活性,使得低碳氮比廢水的反硝化脫氮效率顯著提升[76]。又如,LAGUM等開發(fā)出了一種新型電誘導(dǎo)膜生物反應(yīng)器,通過增強(qiáng)反硝化酶的活性提高污水的處理效果,同時降低對碳源和堿度的依賴[77]?？梢?反硝化酶主導(dǎo)的電子消耗過程雖然是反硝化氮代謝的末端環(huán)節(jié),卻直接關(guān)系著硝酸鹽還原為氮?dú)獾男阅?有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步精準(zhǔn)調(diào)控以獲得更高效的電子利用效率和反硝化性能。

4 總結(jié)與展望

目前,國內(nèi)外學(xué)者針對反硝化脫氮技術(shù)開展了大量研究。本文首先介紹了新型無機(jī)電子供體驅(qū)動的光電營養(yǎng)反硝化體系的構(gòu)建原理與應(yīng)用現(xiàn)狀,然后著重綜述了丙烷等短鏈氣態(tài)烷烴、有機(jī)廢棄物和細(xì)胞內(nèi)碳源等綠色有機(jī)電子供體的研究進(jìn)展,最后歸納總結(jié)了基于細(xì)胞代謝調(diào)控提升電子供體利用效率來促進(jìn)反硝化的作用原理及應(yīng)用進(jìn)展。未來有必要重點(diǎn)關(guān)注以下幾個方面的研究。

(1)在光電反硝化領(lǐng)域,重點(diǎn)開發(fā)低毒價廉和光捕獲性能優(yōu)越的環(huán)境友好型光敏劑,在分子層面揭示光敏劑-微生物界面電子轉(zhuǎn)移的微生物學(xué)和材料化學(xué)機(jī)制,研發(fā)高效反應(yīng)器,提高綠色光電子的供給效率,并嘗試開展更多的工程規(guī)模研究,推進(jìn)該技術(shù)的實際應(yīng)用進(jìn)程。

(2)通過優(yōu)化氣液傳質(zhì)、加快關(guān)鍵功能微生物的生長與富集等手段提高烷烴利用型反硝化脫氮性能;從底物結(jié)構(gòu)等角度進(jìn)一步解析有機(jī)廢棄物碳源化過程的深層機(jī)制,探明發(fā)酵液中非碳源物質(zhì)如輔酶、維生素等對反硝化脫氮的影響;從物種競爭協(xié)作等生態(tài)學(xué)角度研究微生物內(nèi)碳源積累和利用機(jī)制,查明內(nèi)源反硝化的關(guān)鍵限速步驟。

(3)進(jìn)一步發(fā)展反硝化微生物的細(xì)胞調(diào)控手段,提升電子利用效率。例如,反硝化微生物細(xì)胞內(nèi)電子受體硝酸鹽和代謝中間產(chǎn)物(亞硝酸鹽、一氧化氮、氧化亞氮)之間存在對電子的競爭,通過精準(zhǔn)調(diào)控電子在各個反硝化酶之間的分配比例,有望構(gòu)建更高效的反硝化生物脫氮系統(tǒng)。