秭歸絲綿茶鮮葉非揮發(fā)性成分及絲形態(tài)結構分析

劉 璇，李玉川，宋育林，雷震東，李 艷，余 志，倪德江，陳玉瓊,*

（1.果蔬園藝作物種質創(chuàng)新與利用全國重點實驗室，華中農業(yè)大學，湖北 武漢 430070；2.華中農業(yè)大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070；3.秭歸縣農業(yè)農村局，湖北 宜昌 443600）

茶葉作為世界重要飲品，風味品質至關重要[1]。大量研究表明，茶葉品質受原料嫩度、品種及其栽種環(huán)境、加工工藝等因素影響較大，其中鮮葉原料被認為是影響茶葉風味品質的主要因素[2-3]。研究顯示，紅茶滋味濃強、色澤紅艷往往與大葉種茶樹葉片富含多酚，在加工過程中形成大量的茶黃素有關[4]；烏龍茶花香品質與鐵觀音等烏龍茶品種葉片富含的香氣糖苷在搖青過程釋放有關[5]。白葉一號加工的綠茶具有滋味鮮醇的風格與其原料高茶氨酸和低茶多酚含量相關[6-7]。因此，鮮葉原料中氨基酸、兒茶素、黃酮及香氣糖苷等非揮發(fā)性代謝成分對所制成品茶香味品質至關重要[8]。此外，鮮葉中含有K、Fe、Ca、Zn等多種礦質元素，它們通過影響茶樹的生理代謝，影響品質成分的形成累積，進而影響茶葉品質，同時，也是茶葉重要營養(yǎng)組成分[9]。但目前關于茶葉中元素累積的相關研究相對較少。

絲綿茶主要是以湖北秭歸縣當地土茶種為原料生產的一種優(yōu)質綠茶，其滋味醇厚鮮爽、耐泡，廣受消費者歡迎，同時，因其鮮葉富含“絲”的特點備受關注，是湖北省著名綠茶[10]。然而，絲綿茶主要內含成分特點、品質形成、“絲”的屬性及與品質的關系等都鮮有研究。因此，本研究通過超高效液相色譜四極桿飛行時間質譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole-time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF-MS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES）和掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）等技術測定茶葉非揮發(fā)性成分、微量元素以及“絲”結構，對絲綿土茶樹種不同嫩度茶鮮葉的內質成分和“絲”組織進行較為系統(tǒng)的分析，以期為秭歸絲綿茶品質提升和實際生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2020年10月于湖北宜昌秭歸絲綿茶核心產地（九畹溪蔡家坡茶園），采摘絲綿土茶樹（樹齡30 a左右）不同著生部位葉片，分別為芽下第一葉（L1）、第二葉（L2）、第三葉（L3）、第四葉（L4）、第五葉（L5）和第六葉（L6）。取樣方式：在采樣區(qū)內，分別選取20 叢茶樹，每叢選取代表性枝條1 枝，采摘不同葉位鮮葉分別放入干冰中保鮮，后于－80 ℃冰箱凍存待測。另取不同嫩度鮮葉各5 片，用打孔器取葉片同一部位用體積分數2.5%戊二醛溶液固定，后期處理后用于SEM觀察。

D4-醋氨酚（標準品，純度97%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、甲酸（色譜級）美國賽默飛世爾科技有限公司；沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-7-O-α-L-鼠李糖苷、牡荊素葡萄糖苷、楊梅素-3-O-半乳糖苷、異牡荊素-2’’-O-阿拉伯糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷、槲皮苷、山柰苷、山柰素、異牡荊素（以上試劑純度≥98%），表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、槲皮素-3-O-葡萄糖基鼠李糖苷（以上試劑純度95%），谷氨酸（純度≥99.5%），水楊酸（純度99.5%），原花青素B1、二氫山柰酚-7-O-鼠李糖苷（以上試劑純度≥97%），山柰酚-3-O-葡萄糖苷（純度≥90%），槲皮素-3-半乳糖苷、槲皮素、楊梅素、山柰酚（以上試劑純度為97%），賴氨酸、精氨酸、咖啡酸、對香豆酸、綠原酸、奎寧酸、牡荊素鼠李糖苷、(－)-表阿夫兒茶精、茶葉堿（以上試劑純度為98%），沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶氨酸、γ-氨基丁酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸（以上試劑純度為99%），天冬氨酸、蘋果酸、沒食子酸、咖啡堿、可可堿、原花青素B2、茶黃素（以上試劑純度＞99%），酒石酸、牡荊素、茶黃素-3,3’-雙沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯、茶黃素-3-沒食子酸酯（以上試劑純度≥95%）上海源葉生物科技有限公司；苯甲醇櫻草糖苷、橙花醇櫻草糖苷、苯甲醇葡萄糖苷、苯乙醇櫻草糖苷、香葉醇葡萄糖苷、青葉醇葡萄糖苷、香葉醇櫻草糖苷、青葉醇櫻草糖苷（以上試劑純度≥98%）山東大學國家糖工程技術研究中心。

1.2 儀器與設備

6520型Q-TOF液相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；JSM-6390LV型SEM 日本電子株式會社；M410型火焰分光光度計 英國Sherwood公司；AA3 流動注射分析儀 德國SEAL 公司；6300型ICP-OES儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

非揮發(fā)性成分測定[8]：樣品經液氮充分研磨后，稱取200 mg加入2 mL預冷的體積分數75%甲醇溶液（內含7.5 μg/mL的D4-醋氨酚，內標）4 ℃避光浸提12 h。取上清液過0.22 μm濾膜，使用UPLC-Q-TOF-MS進行成分測定，代謝物定性通過與課題組自建茶樹次級代謝物標品庫，進行質荷比和特征二級碎片比對。代謝物相對含量（mg/g）根據內標物計算。

氮和磷元素測定[11]：稱取0.05 g樣品于消化玻璃試管中，加入2 mL濃硫酸于消化爐中消化。冷卻后，定容至20 mL，使用流動注射分析儀測定。

金屬元素測定[12]：稱取樣品0.40 g于消解管中，加入2 mL鹽酸、2 mL氫氟酸、6 mL硝酸，于190 ℃條件下微波消解40 min后，在消化爐中180 ℃消解50 min。冷卻后超純水定容至25 mL，使用ICP-OES測定元素含量。

葉片形態(tài)結構觀察[13]：樣品用乙醇進行脫水后置于乙酸異戊酯溶液中靜置20 min，干燥后，葉片橫切，噴金后放入掃描電鏡腔室中觀察。

茶鮮葉組織及微管束數目統(tǒng)計采用甲苯胺藍染色法[14]。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 非揮發(fā)性代謝物含量分析

茶葉非揮發(fā)性成分數量龐大，主要包括生物堿、多酚類、氨基酸、糖類等物質，這些代謝物質對滋味形成具有重要貢獻[15]。采用UPLC-Q-TOF-MS技術對樣品進行非揮發(fā)性成分測定，通過標準品對照，共鑒定出87 種化合物，包括氨基酸19 種、黃酮33 種、兒茶素6 種、生物堿3 種、酚酸14 種、香氣糖苷10 種和原花青素2 種（圖1）。從圖2發(fā)現(xiàn)，非揮發(fā)性化合物在不同嫩度處理間存在明顯差異。而采摘葉位相近鮮葉中的非揮發(fā)性成分距離相對較近，如L1和L2主要分布在第2象限；L3和L4分布在第4象限；L5和L6非揮發(fā)性成分最接近，分布在第3象限。由此可知，鮮葉嫩度對其非揮發(fā)性成分影響顯著，嫩度相近的原料組非揮發(fā)性成分含量接近。

圖1 非揮發(fā)性成分的熱圖分析Fig.1 Heatmap analysis of non-volatile components

圖2 非揮發(fā)性成分的OPLS-DAFig.2 OPLS-DA plot of non-volatile components

非揮發(fā)性成分含量分析顯示各類物質含量在不同嫩度鮮葉間差異顯著（圖3）。L3的氨基酸類物質含量顯著高于其余組，其次為L4和L2。從氨基酸組分看，L3中茶氨酸含量為6.15 mg/g，顯著高于其余組（圖1）；色氨酸、蘇氨酸、亮氨酸等大多數物質在L1和L2中含量相對較高；而嫩度較低的L5和L6中精氨酸、色氨酸等物質含量相對較低。整體上，氨基酸主要富集在嫩度較高的葉位[16-17]。

圖3 非揮發(fā)成分含量分析Fig.3 Contents of non-volatile components

L3、L1和L2中黃酮含量相對較高，隨著鮮葉嫩度降低，其總量降低。黃酮物質中，山柰酚及其糖苷類、槲皮素糖苷類、楊梅素糖苷和原花青素的相對含量在細嫩部位（L1和L2）中積累較多，而牡荊素和異牡荊素糖苷等物質在嫩度較低的L5和L6中含量較高。

L1和L2中兒茶素含量顯著高于其余組，隨著嫩度降低，其含量出現(xiàn)不同程度的降低趨勢（圖3）。從兒茶素組分看，L1和L2中表沒食子兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯含量相對較高。生物堿含量變化趨勢主要受含量最高的咖啡堿影響，L1中咖啡堿含量顯著高于其余處理，L2、L3和L4間差異不明顯，L5和L6中咖啡堿含量最低。

有機酸可增加茶葉滋味的層次感。由圖3可知，L3和L4中的有機酸總量顯著高于其余組，L1含量最低，顯著低于其余各嫩度葉片。其余組間有機酸含量差異不明顯。莽草酸為主要的有機酸成分，其含量在L3和L4中顯著高于其余組，而剩余組間莽草酸含量差異不明顯。除此之外，絲綿茶鮮葉越細嫩，咖啡酸、沒食子酸和檸檬酸的含量越高。

L2和L1中揮發(fā)性糖苷的含量顯著高于其余組，隨著嫩度的降低，其含量明顯降低，其中主要是以苯乙醇葡萄糖苷和橙花醇櫻草糖苷的含量變化為主。

2.2 元素含量分析

茶鮮葉由蛋白質、氨基酸、生物堿等有機代謝物組成，除C和H外，N和P也是重要組成元素，此外，茶鮮葉中還存在多種無機元素，如鉀、鈣、鎂、鐵和鋅等。這些元素不僅是植物生命不可缺少元素，對茶葉品質的形成影響重大[18]。

由表1可知，N、P、K、Zn和Cu在嫩度最高的L1中的含量顯著高于其余組，其次為L2組，之后隨著嫩度的下降基本上呈現(xiàn)下降趨勢。Ca、Fe和Mn元素在嫩度較高的L1和L2中含量相對較低，且顯著低于其余組，主要富集于嫩度較低的葉位。S和Se元素隨著嫩度的降低呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，L3中的含量最高，顯著高于其余組。此外，Mg元素在L1和L2中的含量最高，顯著高于其余葉位，其他葉位間無顯著差異。

表1 不同嫩度絲綿茶鮮葉元素含量Table 1 Mineral element contents of fresh leaves of Simian tea with different tenderness

2.3 絲綿茶鮮葉“絲”含量及結構分析

將同一枝稍鮮葉的芽頭、一葉、二葉、三葉和四葉，分別沿葉子中間橫斷部位小心撕開，觀察其“絲”的部位及數量（圖4A）。“絲”主要在葉片主脈及側脈，其中，四葉中“絲”最明顯，其次為三葉，一葉和二葉的“絲”明顯減少，芽頭僅能觀察到少量的“絲”，而比四葉更成熟的葉片因葉質較脆，能觀察到的“絲”也較少。因此，一定成熟度的葉片容易拉出絲，太嫩或太老的葉片“絲”都不明顯。

圖4 SEM下絲形態(tài)及絲所處葉片主脈部位Fig.4 Filamentary morphology and main vein position with filamentary structures under SEM

將鮮葉沿著較為發(fā)達的主側脈部位橫向撕開，通過SEM直接觀察“絲”的結構，發(fā)現(xiàn)茶鮮葉“絲”多以三股并行卷曲或單股卷曲的形式存在（圖4D）。為研究茶葉“絲”的所在部位，進一步對鮮葉主脈橫切面進行觀察，發(fā)現(xiàn)茶葉絲出自螺紋和環(huán)紋導管（圖4C），且主要集中在木質部內（圖4B）。

為進一步明確絲綿茶中“絲”的數量與鮮葉嫩度之間的關系，采用甲苯胺藍染色法結合光學顯微鏡進一步統(tǒng)計鮮葉的主脈導管數量和周圍的維管束個數（表2、圖5）。甲苯胺藍是一種多色堿性染料，可將木質化部分染成藍綠色，韌皮部染成藍紫色，其他部分染成淺藍綠色[19]，如圖5所示。結果發(fā)現(xiàn)主脈導管數量在不同嫩度葉間差異顯著。隨著葉片嫩度降低，可視導管數目有增加趨勢。L1和L2主脈導管數差異不明顯，顯著低于其余各組；L3和L4間差異不明顯，顯著低于L5，L6主脈導管數最多，顯著高于其余各組。側脈部位的維管束數量在嫩度最高的L1中僅有85 個，顯著低于其余各組，其次是L2維管束數量，其余各組維管束數量差異不明顯。

表2 不同嫩度絲綿茶鮮葉主脈導管及維管束數目Table 2 Numbers of main vein vessels and vascular bundles in fresh leaves of Simian tea with different tenderness

圖5 絲綿茶不同嫩度鮮葉甲苯胺藍染色組織形態(tài)Fig.5 Toluidine blue stained sections of fresh leaves of Simian tea with different tenderness

3 討論與結論

茶葉作為傳統(tǒng)飲品，人們除對其本身營養(yǎng)品質的較高要求外，越來越注重其健康屬性、文化屬性以及獨特性[20]。比如一些富含特殊成分及風味的高花青素紫鵑茶、高氨基酸的白化品種和黃化品種加工的茶以及一些富含特殊花果香的茶異軍突起，受到消費者青睞[21-22]。秭歸絲綿茶不僅自身風味品質優(yōu)異，而且以富含“絲”的特點受到廣泛關注。于松慧等[23]通過拉曼光譜和共聚焦拉曼成像技術對“絲”的成分進行檢測，發(fā)現(xiàn)茶鮮葉“絲”中含有纖維素、半纖維素及木質素成分。可以初步判斷茶鮮葉絲主要為與導管相關的物質，其在茶葉加工過程中可以更有效地實現(xiàn)葉片內水分和內含物的輸導與重新分布，而自身結構和成分也會產生顯著變化，例如纖維素特征峰強度降低，可能降解生成了一些可溶性糖類物質，形成茶葉滋味品質[24]。

本研究在此基礎上，通過SEM對鮮葉中的“絲”進行觀察分析，發(fā)現(xiàn)其形態(tài)多為螺紋、環(huán)紋管狀，且主要富集于葉脈維管束的木質部。植物葉片維管束分布于葉肉組織中，是植物水分、無機鹽及有機物質的一種輸導系統(tǒng)并兼有支撐植物體的作用[25-26]。因此，植物葉片維管束的數量對植物生長發(fā)育發(fā)揮重要影響。絲綿土茶種葉片絲豐富，說明其維管束發(fā)達，為茶樹旺盛生長輸送所需營養(yǎng)元素，葉片累積更多有機物提供保障。這也可能是絲綿茶內含物豐富，滋味醇厚鮮爽、耐泡的重要原因。但絲綿茶鮮葉富含絲的屬性對其品質的形成的直接關系，仍有待進一步探究。

此外，不同嫩度葉片結構分析顯示，幼嫩葉片維管束相對于成熟葉片維管束數量少，這可能與維管束在幼嫩葉片中還未完全分化形成有關。越成熟葉片，雖然維管束越發(fā)達，但木質部中纖維逐漸增多，組織變得更加堅硬，不利于茶葉加工過程中的塑形[27]。

絲綿土茶種不同嫩度鮮葉原料的非揮發(fā)性物質和礦質元素差異顯著，隨著原料嫩度的降低，其氨基酸、黃酮、兒茶素、咖啡堿及揮發(fā)性糖苷類物質含量呈下降趨勢，這與前人有關茶樹鮮葉嫩度與代謝物關系的研究結果一致[28-29]，而酚酸類物質在較成熟的葉片中累積較多，可能不利于茶葉滋味品質。通過元素分析發(fā)現(xiàn)，隨著嫩度的降低，絲綿茶鮮葉中Zn、Cu、N、P、K含量顯著下降，而Fe、Mn、S、Ca含量的變化趨勢與之相反。由此說明，元素在不同嫩度鮮葉間，存在不同富集情況。

綜上所述，絲綿茶鮮葉在葉位較嫩的一葉（L1）、二葉（L2）和三葉（L3）的“絲”含量和內質成分豐富，因此在實際生產中，采摘較細嫩的一芽一、二、三葉有利于絲綿茶品質的提升。