基于宏基因組技術(shù)分析自然發(fā)酵羊肉香腸中微生物多樣性及揮發(fā)性風(fēng)味功能基因

牛 茵，吳雙慧，何濟坤，蔡自建，尤天棋，陳 娟

（西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

自改革開放后，我國的羊肉產(chǎn)業(yè)得到了快速發(fā)展，羊肉產(chǎn)量大幅提高且長期穩(wěn)居世界第一[1]。雖然我國肉羊產(chǎn)業(yè)具有較好的發(fā)展?jié)摿?，但也存在一些問題，例如對羊肉及其產(chǎn)品的深加工研究不夠，致使羊肉產(chǎn)品初級化、質(zhì)量不高、品種單一等[2]。因此，羊肉的加工方式也應(yīng)從傳統(tǒng)烹飪轉(zhuǎn)向腌制、鹵制、干制、香腸以及方便肉品等深加工方式。國內(nèi)對于羊肉香腸的研究多集中于不同加工工藝、添加劑對香腸理化性質(zhì)與風(fēng)味的影響[3-4]，以及微生物多樣性與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析[5-6]，對于羊肉香腸發(fā)酵過程中風(fēng)味形成的代謝通路與注釋到的微生物研究較少。目前，通過16S rRNA測序技術(shù)對微生物多樣性只能確定到屬水平，無法精確到種水平，且無法得到具體的代謝通路，對于風(fēng)味形成與微生物關(guān)聯(lián)分析具有一定的局限性。宏基因組直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，制備成基因文庫后通過Illumina、Roche 454、PacBio、Oxford Nanopore等平臺進(jìn)行測序[7-8]。與傳統(tǒng)的16S rRNA測序技術(shù)相比，宏基因組技術(shù)可準(zhǔn)確將樣品中的微生物鑒定至種水平，并將研究深入至基因和功能層面[9]，從而對樣品中微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，挖掘出關(guān)鍵的功能基因。目前，宏基因組技術(shù)已廣泛用于各種發(fā)酵食品中，夏亞男等[10]發(fā)現(xiàn)了酸馬奶中26 個芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼基因、40 個酮酸轉(zhuǎn)化酶編碼基因、51 個醇脫氫酶編碼基因、68 個醛脫氫酶編碼基因和34 個乙酰酯酶編碼基因。冼芳瑩等[11]對不同發(fā)酵時間的豆豉進(jìn)行研究，結(jié)果表明代謝活動在發(fā)酵階段時最旺盛，相關(guān)基因占比超過50%，其中糖苷水解酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶基因豐度最高。

宏基因組學(xué)技術(shù)在發(fā)酵香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝方面的研究多集中于催化酶與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析，缺乏對于代謝途徑中編碼酶的功能基因與其注釋微生物分析。Ferrocino[12]與Franciosa[13]等利用宏基因組技術(shù)對意大利香腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量與其代謝途徑中催化酶編碼基因豐度的變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者的變化具有一致性，即物質(zhì)代謝相關(guān)酶的變化與代謝產(chǎn)物的含量變化具有一致的趨勢。Yang Peng等[14]對福沃特香腸進(jìn)行研究，通過宏基因組技術(shù)與代謝組學(xué)技術(shù)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，木糖葡萄球菌、戊糖片球菌與半胱氨酸、蛋氨酸、脂肪酸等代謝途徑具有高度相關(guān)性。國內(nèi)目前已有宏基因組技術(shù)應(yīng)用于香腸中生物胺形成的研究[15-16]，但缺乏對于香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝的分析，僅有劉英麗等[17]采用宏基因組技術(shù)對接種不同乳酸菌的薩拉米香腸進(jìn)行研究，結(jié)果表明乳酸菌YL-1主要參與的是碳水化合物代謝途徑，同時也參與了3-甲基丁酸和苯丙氨酸代謝途徑。

目前，已有發(fā)酵香腸中微生物多樣性與揮發(fā)性風(fēng)味形成的關(guān)聯(lián)分析，但是缺乏對于發(fā)酵過程中微生物種水平的變化與代謝通路的研究，對于功能基因與注釋到的微生物也研究較少。因此，本研究以自然發(fā)酵羊肉香腸不同發(fā)酵時間點的樣品作為實驗對象，采用宏基因組技術(shù)結(jié)合直系同源蛋白分組比對（Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups，eggNOG）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZy）數(shù)據(jù)庫對基因和酶的豐度與功能進(jìn)行注釋，探究揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝通路與微生物和酶的關(guān)系，旨在為自然發(fā)酵羊肉香腸中風(fēng)味物質(zhì)代謝通路的揭示與風(fēng)味功能基因的挖掘提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉 四川天地羊生物工程有限責(zé)任公司；豬腸衣成都市當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

白砂糖、食鹽（均為食品級）均為市售；亞硝酸鈉（食品級）四川金山制藥有限公司；抗壞血酸（食品級）盛達(dá)食品添加劑有限公司；硝酸鈉、葡萄糖（均為分析純）成都科隆化學(xué)品有限公司；DNA提取試劑盒（QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit）德國Qiagen公司；TruSeq Nano DNA LT Sample Prepararion Kit 試劑盒美國Illumina 公司；AgencourtAMPure XP（A63881）美國Beckman Coulter公司；KAPA Library Quantification Kits（KK4824）美國Kapa Biosystems公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop 2000分光光度計 美國Thermo公司；XHF-D 高速分散器 寧波新芝生物有限公司；5409HJ507060冷凍離心機、Centrifuge 5418R臺式離心機 德國Eppendorf公司；MyCycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Covaris S220超聲打斷儀 香港Gene有限公司；LC 480定量PCR儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肉發(fā)酵香腸的制備與取樣

根據(jù)吳雙慧等[16]的方法，取羊肉按照肥瘦質(zhì)量比4∶1攪成肉餡，每1 000 g羊肉中加入食鹽25 g、蔗糖和葡萄糖各5 g、硝酸鈉和亞硝酸鈉各70 mg、抗壞血酸500 mg，充分?jǐn)嚢韬笤?～4 ℃條件下腌制24 h。將腌制好的肉餡灌入清洗好的腸衣中，晾曬于室外，自然發(fā)酵26 d。

在相同條件下分別發(fā)酵3 批羊肉香腸，在發(fā)酵0、5、14 d和26 d每批次各取1 份樣品，每個時間點共3 份樣品，貯藏于－80 ℃用于宏基因組技術(shù)分析，由于操作失誤，第14天丟失1 份樣品。

1.3.2 宏基因組技術(shù)分析

采用DNA提取試劑盒對樣品中微生物總DNA進(jìn)行提取，并對提取DNA濃度與完整性進(jìn)行分析。采用橋式PCR對DNA樣品進(jìn)行擴增并用TruSeq Nano DNA LT Sample Prepararion Kit試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建。采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺對文庫進(jìn)行測序，用Trimmomatic和bowtie2軟件對其進(jìn)行拆分、質(zhì)量剪切、去除宿主污染等操作。使用MEGAHIT軟件進(jìn)行宏基因組的拼接，使用prodigal軟件對拼接后的scaffold進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測，并將其翻譯為氨基酸序列。使用CDHIT與bowtie2軟件對所有樣本中預(yù)測出的基因進(jìn)行非冗余基因集的構(gòu)建，并統(tǒng)計基因在對應(yīng)樣本中的豐度信息。最后使用DIAMOND、hmmscan軟件對基因集代表序列與KEGG、CAZy等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。同時得到各樣本中物種的相對豐度，接著進(jìn)行樣本相似性聚類、排序檢驗以及差異統(tǒng)計比較等分析，使用R軟件完成統(tǒng)計分析和作圖。每個樣品的有效數(shù)據(jù)量分布在15.48～18.53 G。建庫測序及數(shù)據(jù)分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用WPS Office軟件對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的微生物代謝途徑進(jìn)行分析繪圖，采用Origin 2022軟件對各組樣品CAZy數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果與代謝相關(guān)酶豐度結(jié)果進(jìn)行分析作圖，利用R語言4.0對eggNOG與KEGG代謝通路進(jìn)行分析作圖，采用SPSS Statistics 22軟件對酶豐度結(jié)果進(jìn)行算術(shù)平均處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間羊肉香腸中微生物的菌群結(jié)構(gòu)

宏基因組測序和去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，樣本中共得到67 377 條序列。對所得序列進(jìn)行物種注釋，共鑒定出43 個門、60 個綱、112 個目、201 個科、465 個屬和2 156 個種的微生物。選取種水平上相對豐度前30的微生物繪制柱狀圖。

由圖1可以看出，第0天樣品中相對豐度前5的微生物為流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，20.39%）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，18.75%）、酒類酒球菌（Oenococcus oeni，10.02%）、單核細(xì)胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes，5.24%）和斯氏弓形菌（Arcobacter trophiarum，5.19%）；第5天樣品中優(yōu)勢菌屬為金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、Vibriosp.SM1977、酒類酒球菌與Vibrio rumoiensis，相對豐度分別為16.53%、13.86%、9.68%、6.50%和3.79%；在第14天樣品中相對豐度前5的微生物有3 種是葡萄球菌，分別為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus，16.52%）、馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum，10.53%）與金黃色葡萄球菌（10.71%），其他兩種優(yōu)勢菌為流感嗜血桿菌（11.73%）與酒類酒球菌（6.03%）；至第26天時，樣品中優(yōu)勢菌屬又變?yōu)榱鞲惺妊獥U菌（18.62%）、金黃色葡萄球菌（16.11%）、酒類酒球菌（8.89%）、單核細(xì)胞性李斯特菌（4.70%）和斯氏弓形菌（4.65%）。

從發(fā)酵過程的菌相變化可以看出，流感嗜血桿菌經(jīng)歷了從相對豐度20.39%下降至11.73%然后回升至18.62%的變化過程，可以看出其降低趨勢是由腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌相對豐度的明顯上升引起。由此推測腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌等凝固酶陰性葡萄球菌是四川羊肉香腸在自然發(fā)酵過程中外界環(huán)境賦予的微生物，在發(fā)酵14 d成為優(yōu)勢菌群，但是凝固酶陰性葡萄球菌的競爭優(yōu)勢無法保持，后期被流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌和斯氏弓形菌超過。金黃色葡萄球菌在第14天相對豐度降至最低后回升至16.11%，與流感嗜血桿菌的變化趨勢一致，推測原因是金黃色葡萄球菌與流感嗜血桿菌的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。酒類酒球菌在整個發(fā)酵過程中相對豐度比較穩(wěn)定，保持在前5范圍內(nèi)，是自然發(fā)酵羊肉香腸中競爭能力較強的內(nèi)在微生物。單核細(xì)胞性李斯特菌和斯氏弓形菌在發(fā)酵第0天和第26天的相對豐度分別位居第4位和第5位，發(fā)酵過程中（第5天和第14天）它們的相對豐度下降，沒有進(jìn)入前5范圍內(nèi)。隨著發(fā)酵進(jìn)行，弧菌的相對豐度不斷下降，發(fā)酵14 d后不在相對豐度前5范圍內(nèi)。

由上述結(jié)果可以看出，在四川香腸傳統(tǒng)的自然發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，沒有特別優(yōu)勢（相對豐度超過25%）的菌屬，在相對豐度前5的優(yōu)勢菌屬中葡萄球菌、酒類酒球菌起著重要作用，眾多研究表明葡萄球菌屬是發(fā)酵肉制品中的常見優(yōu)勢菌，更是決定肉制品風(fēng)味的優(yōu)勢微生物[18-19]，而酒類酒球菌目前主要應(yīng)用于酒類的發(fā)酵[20]，暫未應(yīng)用于香腸發(fā)酵中，可作為香腸潛在發(fā)酵劑進(jìn)行研究。此外，發(fā)酵過程中存在有流感嗜血桿菌、單核細(xì)胞性李斯特菌、斯氏弓形菌和弧菌等致病菌，在第0天就具有較高的相對豐度，推測原因可能來源于原料肉。傳統(tǒng)自然發(fā)酵香腸中未添加發(fā)酵劑乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌，對致病菌的抑制效果較差，安全性存在一定的問題，使用發(fā)酵劑是提高發(fā)酵肉制品安全性的重要手段。

2.2 數(shù)據(jù)庫注釋分析

2.2.1 eggNOG分析

由圖2可以看出，利用eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋到11 份樣品中共計36 935 個基因，4 個階段樣品分別注釋到14 688、29 007、24 956 個和24 223 個基因，去除功能未知的R和S兩部分后，被注釋到最多的與代謝相關(guān)的3 個功能單元為氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝（4 個階段樣品注釋基因數(shù)量和占比分別為1259 個，8.57%；2 538 個，8.75%；2313 個，9.27%；2209 個，9.12%）、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝（869 個，5.92%；1 854 個，6.39%；1 725 個，6.91%；1 718 個，7.09%）與無機離子轉(zhuǎn)運和代謝（983 個，6.65%；1 840 個，6.34%；1 621 個，6.50%；1 579 個，6.52%）?？梢钥闯?，發(fā)酵5 d樣品不論是注釋基因總數(shù)還是功能單元基因數(shù)都是最多的，但是從占比來看發(fā)酵14 d樣品氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝功能單元最高，發(fā)酵26 d樣品碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝功能單元最高。

圖2 不同發(fā)酵時間羊肉香腸eggNOG代謝通路統(tǒng)計Fig.2 Statistics of eggNOG metabolic pathways in fermented mutton sausage at different fermentation times

2.2.2 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋分析

經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫注釋后，樣品中共有39 319 個基因。將4 個階段樣品中的8 205、15 925、14 157 個和13 566 個非冗余基因在KEGG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行注釋，4 組樣品功能注釋基因主要歸屬為5大類代謝通路，主要功能基因二級代謝途徑均有33 類。由圖3可知，4 個階段樣品中代謝相關(guān)基因數(shù)量分別為4 890、10 047、8 944 個和8 625 個，注釋最多的6 條代謝通路包括碳水化合物代謝（4 個階段樣品注釋基因數(shù)量分別為1 044、2 126、1 884、1 861 個）、氨基酸代謝（931、1 839、1 664、1 598 個）、能量代謝（710、1 598、1 192、1 126 個）、輔酶因子與維生素代謝（619、1 232、1 111、1 071 個）、核苷酸代謝（535、1 124、1 005、970 個）與脂肪酸代謝（279、622、566、527 個）。上述結(jié)果表明，發(fā)酵過程中碳水化合物代謝與氨基酸代謝是被注釋到最多的兩條代謝途徑，是風(fēng)味物質(zhì)形成的重要途徑，發(fā)酵至5 d這兩條代謝途徑注釋到的基因數(shù)量最多。

圖3 羊肉香腸基因的KEGG代謝通路統(tǒng)計Fig.3 Statistics of KEGG metabolic pathways of genes in fermented mutton sausage

2.2.3 CAZy數(shù)據(jù)庫注釋分析

香腸基因序列與CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對后，在樣品中共鑒定出901 個碳水化合物酶。將4 組樣品香腸基因序列與CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果如圖4所示。發(fā)酵0 d樣品中共注釋到基因357 個，糖苷水解酶與糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因數(shù)量最多，都是123 個，碳水化合物酯酶編碼基因最少，只有22 個；發(fā)酵5 d樣品檢出了755 個相關(guān)基因，糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因數(shù)量最多（311 個），輔助氧化還原酶編碼基因數(shù)量最少（28 個）；發(fā)酵14 d與26 d樣品分別注釋到562 個與586 個基因，發(fā)酵14 d樣品中糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因數(shù)量最多（216 個），糖苷水解酶編碼基因（219 個）是發(fā)酵26 d樣品中注釋最多的基因。可以看出糖苷水解酶與糖基轉(zhuǎn)移酶是發(fā)酵過程中與碳水化合物相關(guān)的主要酶，且發(fā)酵5 d樣品注釋到的基因數(shù)最多。

圖4 羊肉香腸基因的CAZy代謝通路統(tǒng)計Fig.4 Statistics of CAZy metabolic pathways of genes in fermented mutton sausage

2.3 羊肉香腸揮發(fā)性風(fēng)味代謝途徑基因分析

風(fēng)味是決定發(fā)酵香腸品質(zhì)的指標(biāo)之一，參照文獻(xiàn)[21-23]繪制發(fā)酵香腸的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)微生物代謝途徑，并將本研究中自然發(fā)酵羊肉香腸注釋到的氨基酸非氧化脫羧代謝途徑、脂肪酸β-氧化途徑與葡萄糖分解代謝途徑所需酶以及相應(yīng)的微生物標(biāo)注如圖5所示。發(fā)酵香腸最終風(fēng)味是發(fā)酵和成熟過程中化學(xué)反應(yīng)和微生物代謝反應(yīng)共同作用的結(jié)果。香腸中的微生物可以利用碳水化合物、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及其他營養(yǎng)物質(zhì)水解產(chǎn)生單糖、游離脂肪酸和游離氨基酸等風(fēng)味前體物質(zhì)，并進(jìn)一步在微生物和酶的協(xié)同作用下代謝產(chǎn)生醛類、酮類、醇類、酯類等對風(fēng)味具有貢獻(xiàn)作用的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[24]。

圖5 發(fā)酵羊肉香腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)微生物代謝途徑Fig.5 Microbial metabolic pathways of volatile flavors substances in fermented mutton sausage

2.3.1 氨基酸代謝分析

氨基酸代謝過程需要先經(jīng)過轉(zhuǎn)氨酶的作用形成相對應(yīng)的α-酮酸，再經(jīng)過氧化或非氧化脫羧途徑形成相應(yīng)的醛、醇、酸與酯類等重要的風(fēng)味物質(zhì)。大量研究表明支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶是支鏈氨基酸代謝形成風(fēng)味物質(zhì)支鏈醛、醇、酸途徑的關(guān)鍵酶[25-26]，同時也有部分研究認(rèn)為谷氨酸脫氫酶也會影響支鏈氨基酸代謝途徑[27-28]。由表1可以看出，本實驗樣品中編碼支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（EC 2.6.1.42）的ilvE基因簇共有15 個，注釋到的微生物為葡萄球菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬與嗜冷桿菌屬，編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（EC 2.6.1.57）的tyrB基因有6 個，由嗜冷桿菌屬、發(fā)光桿菌屬與弧菌屬產(chǎn)生，未在樣品中檢出甲硫氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因。共有34 個基因編碼了谷氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4），注釋到微生物為葡萄球菌屬、弧菌屬、嗜冷桿菌屬、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬與海單胞菌屬。

表1 羊肉香腸基因組中氨基酸代謝主要相關(guān)基因和酶Table 1 Amino acid metabolism-related enzymes and genes in the genome of fermented mutton sausage

氨基酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨反應(yīng)后形成的α-酮酸可經(jīng)酮酸轉(zhuǎn)化酶催化形成相應(yīng)的醛、醇、酸。酮酸轉(zhuǎn)化可分為氧化與非氧化脫羧兩種途徑，α-酮酸經(jīng)α-酮酸脫羧酶可直接形成支鏈醛被稱為非氧化脫羧途徑[29]，在本實驗樣品中未發(fā)現(xiàn)編碼α-酮酸脫羧酶的基因。氧化脫羧途徑指α-酮酸經(jīng)α-酮酸脫氫酶復(fù)合體、乙酸激酶與磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶共同作用催化形成支鏈酸，再經(jīng)醛脫氫酶與醇脫氫酶氧化形成醛與醇[30]，本實驗樣品中共有14 個基因編碼了α-酮酸脫氫酶，脫氫酶E1和E2復(fù)合體共同注釋到的微生物為葡萄球菌屬，乙酸激酶編碼基因12 個，由葡萄球菌屬、明串珠菌屬、嗜冷桿菌屬等產(chǎn)生，磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因17 個，注釋微生物有葡萄球菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬等。樣品中共有41 個乙醇脫氫酶編碼基因，28 個醛脫氫酶基因，主要是由葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬等產(chǎn)生。

由圖6可以看出，樣品發(fā)酵至14 d氨基酸代謝相關(guān)酶豐度最高，乙醇脫氫酶（EC 1.1.1.1）與醛脫氫酶（NAD＋）（EC 1.2.1.3）是所有酶中豐度最高的，谷氨酸脫氫酶（NAD（P）＋）（EC 1.4.1.3）僅在發(fā)酵0 d與5 d組有微量注釋（豐度小于0.001），NAD依賴性醛脫氫酶（EC 1.2.1.54）僅在發(fā)酵0 d有注釋。

圖6 氨基酸代謝相關(guān)酶豐度Fig.6 Abundance of enzymes associated with amino acid metabolism

2.3.2 脂肪酸代謝分析

脂肪的自動氧化反應(yīng)常被認(rèn)為是發(fā)酵香腸中最重要的化學(xué)反應(yīng)，特別是多不飽和脂肪酸的氧化反應(yīng)。脂肪經(jīng)自動氧化產(chǎn)生大量的氫過氧化物，氫過氧化物會進(jìn)一步分解為風(fēng)味前體物質(zhì)[31]。除自氧化外，不飽和脂肪酸可經(jīng)β-氧化途徑產(chǎn)生4或5-羥基酸再環(huán)化形成內(nèi)酯類化合物，游離的飽和脂肪酸可經(jīng)不完全β-氧化途徑生成β-酮酸，后經(jīng)脫羧形成少1 個碳原子的甲基酮。不完全β-氧化是指在原有β-氧化途徑的基礎(chǔ)上，中間產(chǎn)物β-酮脂酰-CoA不經(jīng)硫解酶降解形成少2 個碳原子的脂肪酸與乙酰-CoA，而是在硫酯酶的作用下降解為β-酮酸再經(jīng)脫羧形成甲基酮[32-33]。

由表2可以看出，本實驗樣品中參與脂肪酸β-氧化的微生物有葡萄球菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬等，編碼硫酯酶基因的微生物為葡萄球菌、明串珠菌屬、嗜冷桿菌屬與弧菌屬等，未見編碼環(huán)化酶的基因與微生物。脂肪酸代謝所需酶編碼基因共92 個，其中不完全β-氧化所需硫酯酶編碼基因共39 個。

由圖7可以看出，除?；?CoA脫氫酶（EC 1.3.99.-）與硫酯酶I（EC 3.1.1.5）外，其余與脂肪酸代謝相關(guān)酶的豐度均在發(fā)酵至14 d達(dá)到最大值，羥脂酰-CoA脫氫酶（EC 1.1.1.35）與硫酯酶（EC 3.1.2.-）是豐度最高的兩種酶，乙酰-CoA氧化酶（EC 1.3.3.6）僅在發(fā)酵5 d中有檢出，豐度為0.001 34，烯脂酰-CoA水合酶（EC 4.2.1.17）僅在發(fā)酵0 d與26 d中有檢出，且豐度均低于0.001 3。

圖7 脂肪酸代謝相關(guān)酶豐度Fig.7 Abundance of enzymes associated with fatty acid metabolism

2.3.3 碳水化合物代謝分析

香腸發(fā)酵過程中，微生物可以代謝碳水化合物形成有機酸，例如乳酸、乙酸等，是影響香腸風(fēng)味的重要物質(zhì)。同時，碳水化合物發(fā)酵也會生成一些其他的重要風(fēng)味物質(zhì)如雙乙酰、乙偶姻等[34]。葡萄糖經(jīng)糖酵解后形成丙酮酸，丙酮酸是碳水化合物分解代謝的中間產(chǎn)物，也是風(fēng)味前體物質(zhì)。其能經(jīng)丙酮酸甲酸裂解酶或是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體催化生成甲酸與乙酰-CoA。乙酰-CoA可直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)，也可經(jīng)磷酸?；D(zhuǎn)移酶與乙酸激酶代謝形成乙酸，或是在α-乙酰乳酸合成酶的作用下形成雙乙酰、α-乙酰乳酸[35-36]。由表3可以看出，本實驗樣品中碳水化合物代謝途徑共有217 個編碼基因，其中138 個編碼脫氫酶的基因主要由葡萄球菌屬、明串珠菌屬、弧菌屬等微生物產(chǎn)生；編碼乙酰乳酸合酶的基因共42 個，主要注釋微生物為葡萄球菌屬、明串珠菌屬、弧菌屬等；檢出8 個乙酰脫羧酶基因，對應(yīng)葡萄球菌屬、明串珠菌屬、發(fā)光桿菌屬3 種微生物；磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶與乙酸激酶同時也參與了氨基酸代謝，與氨基酸代謝的結(jié)果相印證，樣品中未見乙偶姻還原酶的編碼基因。

表3 羊肉香腸基因組中碳水化合物代謝主要相關(guān)基因和酶Table 3 Carbohydrate metabolism-related enzymes and genes in the genome of fermented mutton sausage

由圖8可以看出，樣品發(fā)酵至14 d碳水化合物代謝相關(guān)酶的豐度達(dá)到最大值，丙酮酸脫氫酶E1復(fù)合體（EC 1.2.4.1）與乙醇脫氫酶（EC 1.1.1.1）是豐度最高的兩種酶，NAD依賴性醛脫氫酶（EC 1.2.1.54）僅在發(fā)酵0 d中有注釋，豐度為0.001 31。

圖8 碳水化合物代謝相關(guān)酶豐度Fig.8 Abundance of enzymes associated with carbohydrate metabolism

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明自然發(fā)酵羊肉香腸中微生物多樣性豐富，流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、酒類酒球菌是發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，發(fā)酵至14 d時腐生葡萄球菌與馬胃葡萄球菌的豐度升至最大值，達(dá)到27.05%。通過與eggNOG、KEGG、CAZy 3 個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，樣品中注釋到的基因數(shù)分別為36 935、39 319、901 個，發(fā)酵至5 d樣品被注釋到的基因數(shù)最多，碳水化合物代謝和氨基酸代謝是eggNOG和KEGG數(shù)據(jù)庫中注釋最多的代謝途徑，糖苷水解酶與糖基轉(zhuǎn)移酶是CAZy數(shù)據(jù)庫中注釋最多的碳水化合物酶。通過對KEGG代謝通路的分析，發(fā)現(xiàn)共有167 個編碼基因參與氨基酸代謝，其中關(guān)鍵的支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸脫氫酶與α-酮酸脫氫酶復(fù)合體分別被15、6、34、14 個基因所編碼，注釋到的微生物主要為葡萄球菌、假單胞菌、嗜冷桿菌與弧菌等；脂肪酸代謝所需酶編碼基因共有92 個，注釋到的微生物為葡萄球菌、不動桿菌與嗜冷桿菌，不完全β-氧化所需硫酯酶共有39 個編碼基因，主要由葡萄球菌與明串珠菌產(chǎn)生；碳水化合物代謝途徑共有217 個編碼基因，注釋微生物為葡萄球菌、明串珠菌、弧菌、嗜冷桿菌等。3 條風(fēng)味代謝途徑中大部分酶的豐度在發(fā)酵至14 d達(dá)到最大值，與發(fā)酵過程中注釋微生物腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌的相對豐度在14 d達(dá)到最大值的趨勢相同，在一定程度上證實了發(fā)酵過程中凝固酶陰性葡萄球菌對發(fā)酵香腸風(fēng)味形成的重要作用。本研究揭示了羊肉香腸發(fā)酵過程中微生物的多樣性、風(fēng)味物質(zhì)代謝途徑及關(guān)聯(lián)的酶以及注釋微生物的關(guān)系，明確了自然發(fā)酵羊肉香腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的途徑，挖掘了代謝過程中的關(guān)鍵酶與功能基因，對于解析羊肉香腸中微生物的動態(tài)變化以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成具有一定的參考價值。