超聲提取堿韭總黃酮及其抗氧化活性研究

高雪峰,高健,門(mén)中華,董貴成,李丹妮,趙鵬*

1(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭師范學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭,014030)2(河套學(xué)院 醫(yī)學(xué)系,內(nèi)蒙古 巴彥淖爾,015000)

堿韭(AlliumpolyrhizumTurcz.ex Regel)又名堿蔥、扎蒙,是百合科(Liliaceae)蔥屬(Allium)多年生草本植物。分布范圍較廣,我國(guó)北方幾乎所有省區(qū)均有天然堿韭分布,資源豐富,開(kāi)發(fā)利用潛力巨大。堿韭既是西北地區(qū)人們?nèi)粘Ｉ钪幸环N常見(jiàn)的、獨(dú)特的調(diào)味品,又是蒙古族飲食文化中主要的野生蔬菜植物,常以腌制和“奶+蔬菜植物”方式食用。除作為一種風(fēng)味獨(dú)特的綠色食品外,全草及種子均可入藥,有解毒、化瘀、消炎消腫、健胃、利尿等功效,具有抑制“赫依”、補(bǔ)血強(qiáng)身等作用,是一種藥食同源植物[1-2]。對(duì)堿韭藥理研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物是堿韭的主要活性物質(zhì)之一[3-4]。黃酮類化合物具抗菌消炎、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、調(diào)節(jié)人體分泌等多種功效,且安全性能高[5-10]。但黃酮類化合物屬于一類植物次生代謝物質(zhì),在人體內(nèi)不能直接合成,必須通過(guò)食物或藥物攝入。如今人們對(duì)添加了黃酮類物質(zhì)的保健食品的需求日益增加,對(duì)黃酮類化合物的種類和純度也有了更高的要求。從營(yíng)養(yǎng)和藥用角度來(lái)看,不同種類的黃酮類物質(zhì)的功能不同,且不同生物中所含的黃酮類物質(zhì)的種類及含量差異較大。因此,對(duì)從不同天然植物中提取、分離、純化獨(dú)特的黃酮類物質(zhì),以及如何能夠高效地提取相關(guān)黃酮類化合物的研究備受關(guān)注。

天然植物中黃酮類化合物的提取方法很多,有單一提取法[11]、輔助提取法[12],還有多種方法的耦合提取法[13],其中超聲波作為一種新型、高效的技術(shù)手段,由于具有提取效率高、操作相對(duì)簡(jiǎn)便等特點(diǎn),受到研究者的廣泛關(guān)注。其原理主要是利用超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)、熱作用、空化效應(yīng)及攪拌等作用,對(duì)植物樣品施加強(qiáng)壓以促進(jìn)其細(xì)胞壁破壞,釋放出胞內(nèi)物質(zhì),促使黃酮類物質(zhì)從植物組織內(nèi)部溶解出來(lái),提高提取效率。此外,與其他提取方法相比,超聲波提取法可有效減少高溫影響,顯著縮短提取時(shí)間,具有安全性高和效率高的優(yōu)點(diǎn)[14-17]。由于不同植物具有各自的獨(dú)特性,超聲波輔助提取法在提取黃酮類物質(zhì)的實(shí)際應(yīng)用中,對(duì)不同材料的具體操作工藝具有不同的要求,需要依據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行優(yōu)化探索[18-19]。已有研究結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)室常用的總黃酮的優(yōu)選方法有單因素法、正交設(shè)計(jì)法、Box-Behnken響應(yīng)面法等[20-21]。其中,響應(yīng)面法考慮了試驗(yàn)的隨機(jī)誤差,在尋優(yōu)時(shí)可對(duì)各個(gè)水平進(jìn)行連續(xù)性分析,可采用相應(yīng)數(shù)學(xué)模型擬合,具有簡(jiǎn)便、精度高等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用廣泛[22-24]。堿韭作為一種具有巨大開(kāi)發(fā)潛力的“藥食同源”植物,超聲波輔助提取法加以正交試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化對(duì)其黃酮類化合物的提取效果如何,尚未見(jiàn)報(bào)道。試驗(yàn)對(duì)天然堿韭總黃酮的提取工藝進(jìn)行探索優(yōu)化,并測(cè)定和分析堿韭總黃酮的抗氧化活性和還原能力,旨在為進(jìn)一步充分開(kāi)發(fā)利用堿韭提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:天然堿韭于2021年8月采自鄂爾多斯市達(dá)拉特旗,采后將根、葉、花清潔并分離,室內(nèi)自然陰干,經(jīng)粉碎后過(guò)60目篩,密封低溫冷藏備用。前期研究發(fā)現(xiàn)堿韭黃酮主要存在于葉中,因此取堿韭葉進(jìn)行提取工藝研究。

試劑:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%),西安匯普森亞環(huán)生物科技有限公司;無(wú)水乙醇、抗壞血酸、鄰菲羅啉、鐵氰化鉀、FeCl3、AlCl3、無(wú)水乙酸鈉、冰乙酸(分析純),國(guó)藥試劑有限公司;DPPH,Sigma公司;ABTS、二丁基羥基甲苯、三羥甲基氨基甲烷,Rhawn公司;NaH2PO4、K2S2O8、雙氧水、鄰苯三酚,天津南開(kāi)允公和成技術(shù)有限公司;Na2HPO4、FeSO4、三氯乙酸,濟(jì)南高達(dá)通達(dá)化工有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

儀器:N4S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;TB-114電子分析天平,河南信陵儀器設(shè)備有限公司;S30L數(shù)控超聲波清洗器,上海儀天科學(xué)儀器有限公司;H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī),南北儀器有限公司;QE-200高速多功能粉碎機(jī),上海羅納迪科學(xué)儀器有限公司;LGJ-10A真空冷凍干燥機(jī),上海利薩德儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堿韭總黃酮的提取及含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g堿韭葉粉末,以乙醇為溶劑采用超聲波輔助提取法對(duì)堿韭黃酮進(jìn)行提取。提取后過(guò)濾,收集濾液至棕色瓶中,得到試驗(yàn)的樣品提取液。

依據(jù)前期堿韭總黃酮測(cè)定方法的研究結(jié)果,選擇乙醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲波輔助提取,采用AlCl3比色法[25]進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定并計(jì)算總黃酮提取率。測(cè)定條件為:將1 mL提取液置于10 mL具刻度試管中,加入0.1 mol/L的AlCl3溶液0.8 mL,再加入pH 4.4的NaAC-HAC緩沖液2 mL,用30%(體積分?jǐn)?shù))乙醇定容至10 mL,以1 mL蒸餾水代替樣品提取液作為相應(yīng)的空白對(duì)照。搖勻后,室溫下靜置25 min,在405 nm下測(cè)定吸光度值。以蘆丁為標(biāo)樣,回歸方程A=0.102 8c+0.007 4,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

總黃酮提取率按公式(1)計(jì)算:

式中:Y,總黃酮提取率,%;ρ1,標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的待測(cè)液中總黃酮質(zhì)量濃度,mg/mL;V1,測(cè)定樣品液體積,mL;V,樣品提取液總體積,mL;V2,顯色液總體積,mL;m,稱取堿韭粉末質(zhì)量,g。

1.2.2 單因素提取方法

準(zhǔn)確稱取1.0 g堿韭葉進(jìn)行超聲波輔助提取,每個(gè)水平做3次重復(fù)。單因素及水平設(shè)定如下:

乙醇濃度(A):提取溫度60 ℃,提取時(shí)間20 min,料液比1∶40(g∶mL),功率300 W(固定反應(yīng)條件)。對(duì)設(shè)定乙醇體積分?jǐn)?shù)(10%、40%、60%、70%、80%)的黃酮提取率進(jìn)行測(cè)定考察分析。

提取溫度(B):提取時(shí)間20 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶40(g∶mL),功率300 W(固定反應(yīng)條件)。對(duì)設(shè)定不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)的黃酮提取率進(jìn)行考察分析。

提取時(shí)間(C):提取溫度60 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶40(g∶mL),功率300 W(固定反應(yīng)條件)。對(duì)設(shè)定不同提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)的黃酮提取率進(jìn)行考察分析。

料液比(D):提取溫度60 ℃,提取時(shí)間20 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,功率300 W(固定反應(yīng)條件)。對(duì)設(shè)定不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)]的黃酮提取率進(jìn)行考察分析。

提取功率(E):提取時(shí)間40 min,提取溫度60 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,料液比1∶40(g∶mL)(固定反應(yīng)條件)。對(duì)設(shè)定不同功率(250、300、350、400、450 W)的黃酮提取率進(jìn)行考察分析。

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化總黃酮提取工藝

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以總黃酮的提取率為指標(biāo),采用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),見(jiàn)表1,確定乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)和超聲功率(E)的最佳組合,從而對(duì)堿韭總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 總黃酮提取的正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for total flavonoids extraction

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化總黃酮提取工藝

在單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,經(jīng)顯著性分析,采用Design Expert 12.0建立5因素3水平的Box-Behnken模型,以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)和超聲功率(E)為試驗(yàn)因素,總黃酮提取率為響應(yīng)值,進(jìn)一步確定最佳提取工藝,自變量因素編碼及水平(表2)。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment design

1.2.5 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

稱取堿韭葉、花、根粉末,按照最優(yōu)提取工藝,得到各部位總黃酮提取液。提取液去乙醇后以真空冷凍干燥得到各部位總黃酮提取物。分別準(zhǔn)確稱取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg對(duì)照品維生素C和各部位總黃酮提取物溶于100 mL水中,配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的維生素C溶液和各部位堿韭總黃酮溶液。分別以DPPH法、鄰二氮菲法、鄰苯三酚法、ABTS法對(duì)應(yīng)測(cè)定DPPH自由基、·OH、·O2-、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率;以鐵氰化鉀法檢測(cè)其還原能力[26-27]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Design Expert 12.0、SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。采用Excel 2016軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿韭總黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

從堿韭總黃酮提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可以看出:從單因素的角度出發(fā),70%乙醇體積分?jǐn)?shù)為堿韭總黃酮提取最佳體積分?jǐn)?shù),最佳提取溫度60 ℃,最佳提取時(shí)間40 min,最佳料液比1∶30 (g∶mL),超聲功率400 W。利用SPSS 20.0軟件對(duì)單因素的5個(gè)因素進(jìn)行方差分析,由表3可知,5個(gè)因素在單因素試驗(yàn)中均P<0.01,差異極顯著。

a-乙醇體積分?jǐn)?shù);b-料液比;c-提取溫度;d-提取時(shí)間;d-提取功率圖1 各因素水平對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of various factors and levels on extraction rate of total flavonoids

表3 單因素試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of single factor experiment

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化堿韭總黃酮的提取工藝

正交試驗(yàn)優(yōu)化堿韭總黃酮的提取工藝如表4所示,提取工藝優(yōu)化過(guò)程中,以L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),并對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析。R值與該因素對(duì)提取率影響呈正相關(guān)。提取率受各因素的影響程度由大到小依次為:B>C>A>E>D。最佳工藝組合為A1B2C1D1E1,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,提取溫度55 ℃,提取時(shí)間30 min,料液比1∶30(g∶mL),超聲功率250 W,在該提取條件下堿韭葉總黃酮提取率(4.86±0.11)%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為2.32%,表明精密度良好。

對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表5所示。通過(guò)F臨界值和F比可判定該因素對(duì)堿韭總黃酮提取率的差異顯著與否。5個(gè)因素均對(duì)堿韭總黃酮提取率的影響不顯著。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析Table 4 Orthogonal experiment results and range analysis of extraction of total flavonoids

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.3 響應(yīng)面法對(duì)提取工藝的優(yōu)化

響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6,為降低試驗(yàn)中不可控制因素對(duì)試驗(yàn)的干擾,中點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)BLOCK設(shè)置為2個(gè),由表可知試驗(yàn)共有46個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)(包括40個(gè)因析點(diǎn)和6個(gè)零點(diǎn)),采用軟件Design Expert 12.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,分析結(jié)果見(jiàn)表7。

利用多元回歸擬合,得到總黃酮提取率(Y)與乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)和超聲功率(E)的回歸方程為Y(%)=4.680-0.136 5A-0.152 1B+0.057 9C+0.086 9D-0.124 4E+0.075 8AB+0.003 5AC+0.032 5AD+0.034 2AE+0.074 5BC-0.054 0BD-0.042 2BE+0.000 3CD+0.020 3CE+0.011 2DE-0.125 5A2-0.267 0B2-0.159 8C2-0.072 2D2-0.238 2E2,對(duì)該回歸方程進(jìn)行方差分析,擬合度和可信度較高,該模型差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),決定系數(shù)R2為0.84,變異系數(shù)值=3.42%<10.00%,可用于設(shè)計(jì)范圍內(nèi)的預(yù)測(cè)。通過(guò)5個(gè)影響因素的F值大小可得各因素對(duì)堿韭葉總黃酮提取率的影響大小為:B>A>E>D>C。模型一次項(xiàng)中具極顯著水平(P<0.01)的有A、B和E,顯著水平(P<0.05)的有D;二次項(xiàng)A2達(dá)到顯著水平(P<0.05),B2和C2的回歸系數(shù)均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。響應(yīng)曲面坡度陡峭與平滑程度對(duì)應(yīng)因素改變敏感程度[28],各因素交互作用對(duì)堿韭葉中總黃酮提取率影響的等高線以及響應(yīng)曲面如圖2所示。堿韭葉總黃酮的提取率受各因素交互影響作用不明顯。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Box-Behnken experimental results

續(xù)表6

表7 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of Box-Behnken experiment results

通過(guò)軟件對(duì)二次多項(xiàng)式回歸方程進(jìn)行分析預(yù)測(cè),堿韭葉總黃酮超聲波輔助提取法的最佳提取工藝條件:提取溫度50.00 ℃,提取時(shí)間39.30 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)62.28%,料液比1∶38.04 (g∶mL),超聲功率389.44 W,在該條件下堿韭葉總黃酮提取率為5.24%。結(jié)合實(shí)際操作情況,將最佳提取工藝再次優(yōu)化改為:提取溫度50 ℃,提取時(shí)間40 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,料液比1∶40 (g∶mL),超聲功率400 W,以此工藝建立的數(shù)學(xué)模型,設(shè)置6次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),獲得的堿韭葉總黃酮提取率的實(shí)際測(cè)得值為(5.47±0.035)%,預(yù)測(cè)值為5.22%,RSD為0.65%。按照上述修正條件提取堿韭葉總黃酮,將提取液濃縮,冷凍干燥得到總黃酮粉末,按照AlCl3比色法檢測(cè)并計(jì)算純度,總黃酮純度(%)=堿韭葉總黃酮質(zhì)量/堿韭葉總黃酮粉末質(zhì)量×100,計(jì)算得堿韭葉總黃酮純度為(34.59±0.13)%。

a-乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度;b-乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間;c-乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比;d-乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率; e-提取溫度和提取時(shí)間;f-提取溫度和料液比;g-提取溫度和超聲功率;h-提取時(shí)間和料液比; i-提取時(shí)間和超聲功率;j-料液比和超聲功率圖2 各因素交互作用總黃酮提取率的等高線與響應(yīng)面圖Fig.2 Contour and response surface plots showing the interactive effects of extraction conditions on total flavonoids extraction rate

2.4 體外抗氧化活性檢測(cè)

2.4.1 堿韭總黃酮對(duì)DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、·O2-和·OH的清除作用

如圖3所示,0.2～1.2 mg/mL堿韭總黃酮能夠有效清除DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、·O2-和·OH,最高清除率分別為87.87%、98.86%、91.68%和98.35%。堿韭不同部位提取的總黃酮對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用隨濃度的增加而降低,對(duì)·O2-和·OH的清除作用則隨濃度的增加而增加。各部位總黃酮的總體清除效果為葉>花>根。在質(zhì)量濃度≤0.4 mg/mL時(shí),堿韭葉總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除作用最佳,與維生素C清除效果相近(P>0.05)。經(jīng)SPSS 20.0軟件計(jì)算堿韭葉、花、根總黃酮和維生素C對(duì)DPPH自由基清除的IC50值分別為2.490、1.116、0.555、5.543×10-11mg/mL。在質(zhì)量濃度≤0.6 mg/mL,堿韭葉和花總黃酮對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除作用明顯,清除效果顯著高于維生素C(P<0.05)。IC50值分別為3.23、2.08、34.19、0.10 mg/mL。在質(zhì)量濃度≥0.6 mg/mL,堿韭葉、花、根總黃酮對(duì)·O2-的清除作用均明顯高于維生素C(P<0.05)。IC50值分別為0.320、0.426、0.638、0.770 mg/mL。在質(zhì)量濃度≥0.6 mg/mL,堿韭葉、花總黃酮對(duì)·OH的清除作用均高于維生素C,隨著濃度增加其清除效果顯著高于維生素C(P<0.05)。堿韭葉、花、根總黃酮和維生素C對(duì)·OH的IC50值分別為0.025、6.567×10-6、0.021、861.345 mg/mL。表明,堿韭黃酮對(duì)4種自由基均有一定的清除作用,葉和花的清除效果優(yōu)于根。IC50值是指自由基清除率為50%時(shí),抗氧化劑的濃度值,IC50值越小抗氧化能力越好。由IC50值可知,堿韭總黃酮的自由基清除能力十分顯著,對(duì)·O2-和·OH的清除率高于維生素C,清除效果優(yōu)于對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽(yáng)離子自由基清除率;c-·O2-清除率;d-·OH清除率圖3 不同濃度堿韭總黃酮對(duì)自由基的清除率Fig.3 Free radical scavenging rate of total flavonoids from Allium polyrhizum Turcz.ex Regel at different concentration

2.4.2 堿韭總黃酮的還原能力

堿韭總黃酮的還原能力的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同濃度堿韭總黃酮的還原能力Fig.4 Reducing ability of total flavonoids from Allium polyrhizum Turcz.ex Regel at different concentration

在0.2～1.2 mg/mL,堿韭不同部位提取的總黃酮的還原能力隨濃度的增加而增加,通過(guò)試驗(yàn)得出,提取物質(zhì)量濃度與總黃酮還原能力存在劑量效益關(guān)系,隨著質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)的升高,堿韭總黃酮還原能力逐漸增強(qiáng)。各部位總黃酮的還原能力均大于維生素C,且還原能力為根>花>葉。

3 討論

天然堿韭在我國(guó)整個(gè)北疆分布廣泛,營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值突出,其所富含的黃酮類化合物尤其引人關(guān)注[3, 29]。探索出安全高效、得率較高的提取工藝是堿韭黃酮有效開(kāi)發(fā)利用的基礎(chǔ)。前期研究顯示,超聲波輔助提取堿韭總黃酮的方法效果較好且安全便捷[14-16]。試驗(yàn)采用超聲波輔助提取堿韭總黃酮,通過(guò)單因素、正交試驗(yàn)、響應(yīng)面法分析,各因素對(duì)提取率的影響程度由大到小分別為:單因素:提取溫度>提取時(shí)間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率;正交試驗(yàn):提取溫度>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率>料液比;響應(yīng)面法:提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率>料液比>提取時(shí)間。影響堿韭總黃酮提取率的主要因素是提取溫度,這可能與溫度對(duì)平衡濃度的影響較大有關(guān),溫度升高使質(zhì)量傳遞過(guò)程加快,黃酮在堿韭表面的脫附作用增強(qiáng),達(dá)到平衡的時(shí)間縮短[30],而溫度過(guò)高則引起黃酮類化合物結(jié)構(gòu)被氧化破壞導(dǎo)致其提取率降低,這與響應(yīng)面法提取溫度與提取時(shí)間的交互作用結(jié)果相一致。同時(shí),溫度升高有助于加速超聲波產(chǎn)生的熱作用、空化效應(yīng)等作用,促進(jìn)其細(xì)胞壁破壞,釋放出胞內(nèi)物質(zhì),提高黃酮的提取效率。對(duì)比正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法,各因素對(duì)提取率的影響程度變化基本一致,唯一的差別在于提取時(shí)間,造成這種差異可能與提取時(shí)間在正交試驗(yàn)中對(duì)總黃酮提取率的影響不顯著,在響應(yīng)面試驗(yàn)中與其他因素交互作用不明顯有關(guān)。由響應(yīng)面曲線可以看出當(dāng)提取時(shí)間在30～40 min時(shí),黃酮提取率變化趨于平緩,變化幅度較小。

許多研究報(bào)道中對(duì)植物黃酮的提取采用乙醇熱回流法,但通過(guò)堿韭黃酮提取試驗(yàn)[參照洋蔥最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行[31],準(zhǔn)確稱取1.0 g堿韭葉粉加80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇30 mL,在80 ℃下回流提取2.5 h,總黃酮提取率達(dá)(3.46±0.71)%]表明,無(wú)論是用正交試驗(yàn),還是用響應(yīng)面法,黃酮提取率均極顯著(P<0.01)高于乙醇熱回流法,分別達(dá)到其1.55倍和1.74倍。由于溫度是影響堿韭總黃酮提取的主要因素,而乙醇熱回流法存在遇熱不穩(wěn)定的情況,由此可能導(dǎo)致提取率較低且提取效果不穩(wěn)定。超聲波輔助提取技術(shù)可有效解決這一缺陷,試驗(yàn)穩(wěn)定性和可重復(fù)性明顯提升。由試驗(yàn)結(jié)果可知,響應(yīng)面法總黃酮提取率較正交試驗(yàn)提高了0.60%,極顯著優(yōu)于正交試驗(yàn)(P<0.01)。超聲波輔助提取可有效提高堿韭總黃酮的提取率,響應(yīng)面法確定的提取工藝參數(shù)模型具有代表性,通過(guò)該法得到的總黃酮提取率高于同樣超聲波輔助提取法測(cè)得的《中國(guó)藥典》記錄植物韭菜籽[19]以及洋蔥[31]、沙蔥[32]的總黃酮提取率,能夠高效提取堿韭中的黃酮類化合物,且堿韭黃酮具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。與其他提取方法相比,該法通過(guò)超聲波空穴作用和加速介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)過(guò)程,促進(jìn)乙醇穿透植物組織,使黃酮類物質(zhì)獲得較高的加速度和動(dòng)能,加速黃酮溶解于乙醇中。可有效減少高溫影響,顯著縮短提取時(shí)間,具有安全性高和效率高的優(yōu)點(diǎn),隨著超聲波技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,必將在天然產(chǎn)物有效成分提取領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

自由基是影響細(xì)胞衰老凋亡的最重要的因素之一,如何有效清除體內(nèi)過(guò)量自由基是營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。IC50值可以有效評(píng)價(jià)黃酮類化合物的抗氧化活性,通常將IC50值低于10 mg/mL作為黃酮類化合物具有良好抗氧化活性的重要指標(biāo)[33]。通過(guò)體外抗氧化活性試驗(yàn)研究表明,堿韭總黃酮對(duì)4種自由基均有一定的清除作用,其中葉和花的清除效果優(yōu)于根,這與堿韭總黃酮在不同部位的含量分布相一致。由IC50值可知,堿韭總黃酮對(duì)·O2-和·OH的清除率明顯高于維生素C,表明堿韭黃酮與維生素C相比,在清除不同自由基方面各有優(yōu)劣,堿韭黃酮具有成為一種優(yōu)質(zhì)天然抗氧化劑的潛質(zhì),有望從食品抗氧化劑及防腐劑等方面得到開(kāi)發(fā)利用。除了自由基清除能力以外,還原能力也是物質(zhì)衡量抗氧化能力的重要指標(biāo)。對(duì)堿韭不同部位還原能力測(cè)定結(jié)果顯示,堿韭葉、花、根提取的總黃酮的還原能力均大于維生素C,表明堿韭黃酮的抗氧化性總體上優(yōu)于維生素C。然而,與總黃酮含量及對(duì)·O2-等4種自由基清除能力表現(xiàn)不同的是,堿韭各部分還原能力表現(xiàn)為根>花>葉的情況,根部黃酮含量低卻顯示出最高的還原力。這可能與堿韭不同部位黃酮類化合物的種類和分子結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。不同分子抗氧化的機(jī)制不同,如采用直接清除自由基、螯合金屬離子、抑制脂質(zhì)氧化作用、激活體內(nèi)抗氧化酶活性等[34]。如果根部黃酮類化合物分子的結(jié)構(gòu)是某種高活力形式的分子,在不同的抗氧化性測(cè)定方法中,其有可能在含量低的情況下反而在某些抗氧化指標(biāo)方面表現(xiàn)出高活性[35-36]。植物不同部位黃酮類化合物抗氧化性在不同指標(biāo)上出現(xiàn)不同表現(xiàn),這種情況不僅堿韭上如此,前人在沙蔥[32]、金蓮花[37]、粉綠鐵線蓮[38]等相關(guān)研究中均有類似報(bào)道。然而,堿韭黃酮類分子如何具體分類,不同黃酮分子實(shí)現(xiàn)抗氧化性的機(jī)制如何,許多研究目前還不夠清晰,需要進(jìn)一步深入探討。

4 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)單因素、正交試驗(yàn)、響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的綜合比較,確定了超聲波輔助提取堿韭總黃酮最佳提取工藝條件為:乙醇體積分?jǐn)?shù)60%,提取溫度50 ℃,提取時(shí)間40 min,料液比1∶40 (g∶mL),超聲功率400 W。此時(shí)總黃酮提取率可達(dá)(5.47±0.035)%。該法優(yōu)于傳統(tǒng)乙醇熱回流法,與其他提取方法相比,具有減少高溫影響,安全性能高,提取時(shí)間短的優(yōu)勢(shì)。體外抗氧化活性研究表明,堿韭總黃酮有較強(qiáng)的體外抗氧化作用,能夠有效清除DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、·O2-和·OH,對(duì)·O2-和·OH的清除效果優(yōu)于對(duì)DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基的清除效果,葉和花的清除效果優(yōu)于根。各部位總黃酮的還原能力均大于維生素C,且還原能力根>花>葉。天然堿韭總黃酮含量較為可觀,有較強(qiáng)的體外抗氧化作用,且資源量充足,是一種值得開(kāi)發(fā)利用的藥用和食用植物資源。本試驗(yàn)為進(jìn)一步分離、鑒定黃酮單體成分和其生物活性成分提供最優(yōu)提取方案。在后期的研究中可以使用堿韭葉作為研究對(duì)象進(jìn)行總黃酮的提取,并進(jìn)一步研究發(fā)掘堿韭總黃酮的其他生物功效,為堿韭黃酮的深入開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)和實(shí)踐參考,也可為其他植物中的黃酮類化合物提取提供有益參考。