脂質(zhì)體提高輔酶Q10穩(wěn)定性與生物可接受率研究

方素瓊,陳文榮,王培建,昝勝杰

(仙樂(lè)健康科技股份有限公司,廣東 汕頭,515041)

輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)因具有抗氧化、緩解體力疲勞、提高人體免疫力、輔助降血脂等多種功能活性而被廣泛報(bào)道[1-3]。然而,作為一種高分子質(zhì)量化合物,CoQ10在水中溶解性差,小腸直接吸收水平低,導(dǎo)致其直接口服生物利用率低;同時(shí)CoQ10的穩(wěn)定性還受到光、熱等環(huán)境因素的挑戰(zhàn),這限制了CoQ10作為膳食補(bǔ)充劑在保健食品中的應(yīng)用[2]。目前,運(yùn)用制劑新技術(shù)開發(fā)高含量、高穩(wěn)定的CoQ10保健食品已成為研究熱點(diǎn)。

基于脂質(zhì)基質(zhì)的載體遞送技術(shù)在提高脂溶性活性成分的溶解性,保護(hù)其免受環(huán)境因素導(dǎo)致的降解,防止與其他食品成分的相互作用,提高其口服生物可接受率上成效顯著[4]。脂質(zhì)體為具有兩親性分子(磷脂)雙層結(jié)構(gòu)的球狀囊泡,可同時(shí)包裹親水性與親脂性活性成分,是最具有代表性的一類脂質(zhì)遞送系統(tǒng)[5]。脂質(zhì)體已廣泛應(yīng)用于活性成分,如姜黃素[6-7]和β-胡蘿卜素[8-9]等的包封。

目前,脂質(zhì)體的制備工藝大多遵循使磷脂分子暴露于水相環(huán)境從而自組裝形成雙層囊泡結(jié)構(gòu)的思路。為了實(shí)現(xiàn)目標(biāo),常用的方法有2種:其一是薄膜分散法(溶劑蒸發(fā)法),即先將磷脂分子制備成薄脂質(zhì)片,再暴露于水相環(huán)境制備脂質(zhì)體;其二為乙醇注入法(溶劑分散法),即在水性環(huán)境中以受控方式引入磷脂乙醇溶液以形成脂質(zhì)體[10]。然而此類方法制備的脂質(zhì)體多以微米級(jí)的多層囊泡形式存在,過(guò)大的粒徑和過(guò)高的多分散系數(shù)對(duì)脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和活性成分遞送效果均產(chǎn)生不利影響,因此有必要采用粒徑控制技術(shù)將脂質(zhì)體的粒徑控制在亞微米級(jí)別[10]。以高壓均質(zhì)、超聲波和微射流為代表的新型物理加工技術(shù)是減小脂質(zhì)體粒徑,降低其多分散系數(shù)的有效策略,且同時(shí)兼具成熟、安全和高效的優(yōu)勢(shì),在脂質(zhì)體生產(chǎn)中具有充足潛力[10-11]。

本研究擬制備脂質(zhì)體來(lái)提高CoQ10的穩(wěn)定性和生物可接受率,并探究高壓均質(zhì)處理對(duì)脂質(zhì)體的粒徑、電位、包封率和微觀形態(tài)等特征參數(shù)的影響。進(jìn)一步考察所制備脂質(zhì)體儲(chǔ)藏穩(wěn)定性以及模擬體外消化中CoQ10生物可接受率的差異,闡明高壓均質(zhì)技術(shù)作為CoQ10脂質(zhì)體制備新技術(shù)的潛力,為CoQ10膳食補(bǔ)充劑相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CoQ10、中鏈酸甘油酯(medium chain triglycerides,MCT)、大豆磷脂, 浙江天草生物科技股份有限公司;維生素E,豐益油脂科技有限公司;95%乙醇,南昌卓耀實(shí)業(yè)有限公司;胃蛋白酶、胰酶,美國(guó)Sigma公司;乙腈、異丙醇、正己烷、鹽酸等,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AH-Pilot高壓均質(zhì)機(jī),安拓思納米技術(shù)(蘇州)有限公司;Nano-ZS90納米粒度儀,英國(guó)Malvern Instruments公司;JEM-1230透射電子顯微鏡,日本電子株式會(huì)社;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國(guó)Agilent公司;FE20型pH計(jì),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 CoQ10脂質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法結(jié)合高壓均質(zhì)技術(shù)制備。在50 ℃水浴條件下將20 g CoQ10溶于10 g MCT中,制成CoQ10油溶液。將油溶液滴入到溶解有98.3 g大豆磷脂和0.7 g維生素E的300 g乙醇溶液中,在50 ℃水浴攪拌至澄清,作為制備脂質(zhì)體的乙醇相。將乙醇相緩慢注入870 g水中形成乳化液。乳化液在流速40 L/h、預(yù)設(shè)固定壓力(0/50/100 MPa)條件下進(jìn)行1次高壓均質(zhì)處理,再于45 ℃下減壓蒸發(fā)除去乙醇相,得到CoQ10脂質(zhì)體混懸液。將脂質(zhì)體混懸液再于相同條件下高壓均質(zhì)處理2個(gè)循環(huán),并灌裝于棕色玻璃瓶,經(jīng)85 ℃水浴殺菌30 min,即得CoQ10脂質(zhì)體樣品。脂質(zhì)體樣品根據(jù)均質(zhì)壓力差異進(jìn)行命名,分別為0 MPa:CoQ10-LP-Ⅰ、50 MPa:CoQ10-LP-Ⅱ、100 MPa:CoQ10-LP-Ⅲ。

1.3.2 粒徑、電位與微觀結(jié)構(gòu)

稱取10 mg脂質(zhì)體樣品,用4 mL去離子水稀釋,于室溫 (25 ℃)下平衡30 min后,使用激光粒度儀測(cè)量其粒徑、多分散指數(shù)和電位,使用透射電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.3 包封率

精密稱取0.2 g脂質(zhì)體樣品,加入2 mL正己烷振蕩萃取未包封的CoQ10,10 000 r/min離心10 min,吸取上層正己烷定容至10 mL,測(cè)量CoQ10的含量。CoQ10脂質(zhì)體樣品的包封率(encapsulation efficiency,EE)按公式(1)計(jì)算:

式中:minitial,初始添加的CoQ10總質(zhì)量,mg;munloaded,未包封CoQ10的質(zhì)量,mg。

CoQ10含量的測(cè)定采用HPLC進(jìn)行,色譜柱選擇C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相由乙腈和異丙醇(65∶10,體積比)組成,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm,進(jìn)樣量20 μL,柱溫35 ℃。

1.3.4 貯藏穩(wěn)定性

將 CoQ10脂質(zhì)體樣品置于40 ℃條件下貯藏30 d,每10 d記錄其粒徑、CoQ10保留率、酸價(jià)和過(guò)氧化值。

CoQ10保留率(retention rate,RR)按公式(2)計(jì)算:

式中:EEt,特定時(shí)間CoQ10-LP樣品的包封率,%;EEinitial,CoQ10-LP樣品的初始包封率,%。

酸價(jià)和過(guò)氧化值的測(cè)定分別參照GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測(cè)定》和GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》的方法進(jìn)行。

1.3.5 體外消化特性

取新鮮制備的CoQ10脂質(zhì)體樣品進(jìn)行模擬體外消化實(shí)驗(yàn),并以等含量的CoQ10粉末作為對(duì)照。取7.5 mL脂質(zhì)體與7.5 mL人工唾液混合,調(diào)節(jié)pH值至6.8,在37 ℃下孵育2 min后,加入2 mL含有15.3 mg/L胃蛋白酶的模擬胃液,用鹽酸將混合物調(diào)節(jié)至pH 2.5,在37 ℃下孵育2 h以模擬胃消化過(guò)程。收集30 mL胃消化食糜,加入1.5 mL模擬腸液和3.5 mL膽鹽溶液,將pH值調(diào)節(jié)至7.0,加入2.5 mL胰酶溶液(36 mg /mL)在37 ℃下孵育2 h以模擬小腸消化。

在小腸消化的特定時(shí)間間隔,取適量消化食糜,于15 000 r/min離心30 min,分離并吸取上清液0.1 mL,加入0.1 mL乙醇振蕩均勻,用1 mL正己烷萃取,10 000 r/min離心10 min分離正己烷,用前述HPLC方法測(cè)量CoQ10的量。根據(jù)公式(3)計(jì)算CoQ10的生物可接受率:

式中:mmicelle,膠束中CoQ10的質(zhì)量,mg;minitial,樣品中CoQ10的質(zhì)量,mg。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用Origin進(jìn)行繪圖,利用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CoQ10脂質(zhì)體的表征

如圖1-a所示,所制備的脂質(zhì)體樣品均為具有半透明外觀的液體制劑,且隨均質(zhì)壓力的提高,樣品的透明度有所提升,這與脂質(zhì)體粒徑隨均質(zhì)壓力下降,從而引起的懸浮液中大顆粒光散射現(xiàn)象減弱有關(guān)[12]。CoQ10-LP-Ⅰ粒徑為(538.26±11.25) nm,多分散指數(shù)0.247±0.044;CoQ10-LP-Ⅱ的粒徑為(240.21±7.23) nm,多分散指數(shù)為0.138±0.027;對(duì)于CoQ10-LP-Ⅲ,粒徑則進(jìn)一步下降為(130.17±3.13) nm,多分散指數(shù)0.096±0.011。多分散指數(shù)是脂質(zhì)體粒徑分布集中程度的度量[12]。隨著樣品制備過(guò)程均質(zhì)壓力的增加,粒徑和多分散指數(shù)呈下降的趨勢(shì),說(shuō)明在更高的均質(zhì)壓力條件下,微通道中強(qiáng)大的剪切力、沖擊力和空化力使脂質(zhì)體分散成更小且更均勻的顆粒[13-14]。磷脂分子構(gòu)成的雙層球狀囊泡為親脂性活性成分提供了嵌入空間和吸附位點(diǎn)[15]。如圖1-b所示,所有脂質(zhì)體樣品的包封率均為96%左右,代表脂質(zhì)體有效改善了CoQ10溶解性,實(shí)現(xiàn)較高水平包封。同時(shí),各脂質(zhì)體樣品電位值(約-30 mV)無(wú)顯著差異(P>0.05),這不同于CHUNG等[16]所報(bào)道的脂質(zhì)體電位絕對(duì)值和包封率隨均質(zhì)壓力和次數(shù)增大而降低的規(guī)律,其原因可能是后者所選擇的更大的均質(zhì)壓力梯度和樣品材料性質(zhì)差異。

a-外觀、粒徑與多分散指數(shù);b-電位與包封率圖1 脂質(zhì)體的表征Fig.1 Characterization of liposomes 注:相同顏色柱子上不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

如圖2所示,無(wú)壓力條件(0 MPa)下制備的脂質(zhì)體樣品CoQ10-LP-Ⅰ具有最大的囊泡結(jié)構(gòu),且形狀規(guī)整度較差,表面粗糙程度更高。相比之下,壓力條件(50和100 MPa)下的CoQ10-LP-Ⅱ和CoQ10-LP-Ⅲ樣品均為表面光滑、形狀近圓的較小囊泡,這與粒徑測(cè)量結(jié)果相一致。

a-CoQ10-LP-Ⅰ;b-CoQ10-LP-Ⅱ;c-CoQ10-LP-Ⅲ圖2 CoQ10脂質(zhì)體的微觀結(jié)構(gòu)Fig.2 Microstructure of CoQ10 liposomes

2.2 穩(wěn)定性分析

如圖3所示,粒徑分析表明,脂質(zhì)體在貯藏期間粒徑呈增大趨勢(shì),這與貯藏期間脂質(zhì)體聚集、絮凝、聚結(jié)和顆粒融合,導(dǎo)致形成較大的囊泡有關(guān)[17-18]。在貯藏終點(diǎn),CoQ10-LP-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ粒徑分別增大至(650.12±18.30)、(351.02±18.12)、(331.64±15.53) nm,其中CoQ10-LP-Ⅲ粒徑增幅最大。對(duì)此可能的原因是更高的均質(zhì)壓力在將脂質(zhì)體破碎成更小粒徑顆粒的同時(shí),增大了比表面積,從而導(dǎo)致界面厚度下降,脂質(zhì)體物理穩(wěn)定性降低[19]。此外,脂質(zhì)體在貯藏期間的聚集、絮凝和融合對(duì)脂質(zhì)體的酸價(jià)和過(guò)氧化值均造成了不利影響。CoQ10-LP-Ⅰ的酸價(jià)和過(guò)氧化值均高于其余脂質(zhì)體樣品,說(shuō)明50 MPa和100 MPa條件的高壓均質(zhì)處理在一定程度上改善了脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性。此外,相較于CoQ10-LP-Ⅱ,100 MPa處理的CoQ10-LP-Ⅲ具有更高的酸價(jià)和過(guò)氧化值[分別為(38.27±2.63) mg/g和(1.33±0.02) g/100 g]。可能是兩方面原因?qū)е?其一是囊泡融合過(guò)程中發(fā)生的脂質(zhì)氧化;其二則是過(guò)度加工,即過(guò)高均質(zhì)壓力導(dǎo)致的更高頻率碰撞和更高壓力閥門溫度對(duì)脂質(zhì)氧化穩(wěn)定性的潛在破壞[19-20],這說(shuō)明過(guò)高壓力的均質(zhì)處理對(duì)脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性具有負(fù)面作用。

值得注意的是,CoQ10在貯藏過(guò)程中保留率的變化并未顯示出與均質(zhì)壓力的關(guān)聯(lián)趨勢(shì),且貯藏終點(diǎn)各樣品保留率均維持在較高水平(>85%),證明脂質(zhì)體是CoQ10穩(wěn)態(tài)化遞送的有效手段。

a-粒徑;b-酸價(jià);c-過(guò)氧化值;d-CoQ10保留率圖3 CoQ10脂質(zhì)體貯藏穩(wěn)定性的變化Fig.3 Changes in storage stability of CoQ10 liposomes

2.3 模擬體外消化特性

脂質(zhì)載體在消化過(guò)程中伴隨著油脂消化釋放出的游離脂肪酸在膽鹽作用下膠束重組,為親脂性活性成分提供增溶的疏水區(qū)域,從而提高其生物可接受率[21]。研究考察了模擬腸道消化實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)的膠束相外觀圖像,并根據(jù)膠束中CoQ10含量計(jì)算其生物可接受率。如圖4-a所示,CoQ10原料對(duì)照組的膠束相外觀為澄清透明狀,幾乎無(wú)顏色,絕大部分CoQ10經(jīng)離心而沉淀到離心管底部,說(shuō)明絕大部分未被有效利用。相比之下,脂質(zhì)體組膠束相均呈淡黃色,代表其所包封的CoQ10在在消化過(guò)程中被轉(zhuǎn)移至膠束相,能夠被生物體所吸收利用。生物可接受率的測(cè)算從數(shù)值層面展示了脂質(zhì)體包封對(duì)CoQ10生物利用的提高程度(圖4-b),其中原料對(duì)照組生物可接受率數(shù)值趨近于0,幾乎不能被生物利用,這與其直接口服生物利用率極低相對(duì)應(yīng)[22]。脂質(zhì)體包封后,CoQ10-LP-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ生物可接受率分別提升為(20.86±1.26)%、(31.97±1.62)%和(31.61±2.72)%,說(shuō)明脂質(zhì)體包封對(duì)CoQ10生物可接受率提升顯著。此外,50、100 MPa壓力均質(zhì)處理的脂質(zhì)體膠束相顏色更深,生物可接受率更高,說(shuō)明高壓均質(zhì)處理對(duì)CoQ10脂質(zhì)體生物可接受率的改善具有積極意義。

a-消化終點(diǎn)膠束相外觀;b-CoQ10生物可接受率圖4 CoQ10脂質(zhì)體的模擬體外消化特性Fig.4 In vitro digestion properties of CoQ10 liposomes

3 結(jié)語(yǔ)

本研究使用脂質(zhì)體包封的方式改善CoQ10的穩(wěn)定性和生物可接受率,并研究了均質(zhì)處理?xiàng)l件對(duì)脂質(zhì)體理化特性、穩(wěn)定性和消化特性的影響。表征結(jié)果表明,均質(zhì)處理有效降低了脂質(zhì)體的粒徑和多分散指數(shù),對(duì)脂質(zhì)體的電位和包封率幾乎未造成影響。穩(wěn)定性分析顯示,均質(zhì)處理對(duì)脂質(zhì)體的貯藏穩(wěn)定性有一定程度的改善,但過(guò)高的均質(zhì)壓力可能對(duì)脂質(zhì)體的酸價(jià)和過(guò)氧化值造成不利影響。模擬體外消化實(shí)驗(yàn)表明,脂質(zhì)體包封對(duì)CoQ10生物可接受率提升顯著,同時(shí)均質(zhì)處理對(duì)生物可接受率也具有積極意義。綜上,使用高壓均質(zhì)手段構(gòu)建脂質(zhì)體是實(shí)現(xiàn)CoQ10高穩(wěn)定、高生物可接受率遞送的有效手段,對(duì)開發(fā)CoQ10營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品具有重要參考意義。