代謝工程改造熱帶假絲酵母生產(chǎn)鼠尾草酸

霍達(dá),陳獻(xiàn)忠,楊海泉,曹鈺

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

鼠尾草酸(carnosic acid, CA),一種易溶于油脂,不溶于水,耐高溫的油溶性酚類二萜化合物,在自然界中廣泛存在于牛至、鼠尾草、迷迭香、百里香等唇形科植物中[1]。CA表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能和化學(xué)性質(zhì),比如抗氧化[2]、抗炎[3]、抗腫瘤[4]以及抗微生物等特性被建議作為預(yù)防劑和治療神經(jīng)退行性疾病,還可將其用于增香的食品添加劑[5-6]等,這使其在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品工業(yè)等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[7-10],其需求量也是逐年提高。對(duì)于萜類生產(chǎn),相較于目前已經(jīng)廣泛用于萜類合成的釀酒酵母而言,熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)具有耐高溫、魯棒性強(qiáng)[11]、產(chǎn)油脂[12]、具有豐富的膜結(jié)構(gòu)[13-15]等特點(diǎn)。伴隨著代謝工程、合成生物學(xué)等生物技術(shù)的飛速發(fā)展,針對(duì)于萜類化合物的生物合成,常見(jiàn)的代謝工程改造策略有“推拉”策略、模塊化工程、亞細(xì)胞區(qū)室化、蛋白質(zhì)工程等。2015年,IGNEA等[16]報(bào)道了一個(gè)模塊化的萜烯生產(chǎn)平臺(tái),同時(shí)挖掘和鑒定鼠尾草和迷迭香中抗氧化劑CA和相關(guān)二萜的生物合成途徑中的酶系。在代謝工程改造方面,WEI等[17]通過(guò)融合蛋白共表達(dá)和不同過(guò)氧化氫酶的過(guò)表達(dá)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)工程等代謝工程和合成生物策略在釀酒酵母中構(gòu)建CA的生物合成途徑異源生產(chǎn)CA,其搖瓶發(fā)酵和5 L補(bǔ)料分批發(fā)酵產(chǎn)量分別為24.65 mg/L和75.18 mg/L。

本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建生產(chǎn)次丹參酮二烯并帶CRISPR Cas9編輯系統(tǒng)的尿嘧啶缺陷型熱帶假絲酵母1C2PM04作為出發(fā)菌株。進(jìn)行如下代謝改造:利用模塊化工程與酵母不同亞細(xì)胞區(qū)室的空間組合,將來(lái)源于鼠尾草的鐵銹醇合酶基因(CYP76AH24)、鼠尾草酸合酶基因(CYP76AK6)和來(lái)源于擬南芥的細(xì)胞色素還原酶基因(ATR1)以模塊化的方式導(dǎo)入胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體中進(jìn)行過(guò)表達(dá)構(gòu)建下游鼠尾草酸合成途徑(圖1)并探究C.tropicalis在細(xì)胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體中分別進(jìn)行CA合成的潛力;通過(guò)融合基因表達(dá)策略,進(jìn)一步消耗前體增加CA池;過(guò)表達(dá)ATR1,增加電子供體數(shù)目提高CA產(chǎn)量;敲除ERG9并通過(guò)CRISPR dCas9系統(tǒng)下調(diào)另一個(gè)拷貝的ERG9,這使得代謝通量導(dǎo)向合成CA前體GGPP的萜類合成途徑。

圖1 熱帶假絲酵母中鼠尾草酸的參考代謝途徑Fig.1 Reference metabolic pathway of carnosic acid in C.tropicalis

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株和引物

本實(shí)驗(yàn)中所用的基因克隆載體pMD19-T Simple,大連TaKaRa公司;用于載體構(gòu)建的大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109,江南大學(xué)工業(yè)微生物資源與管理中心保藏;質(zhì)粒PBRP01、Ts-GRE-gda-URA3、Ts-gEi-PGAP1-dCas9-TENO1,本實(shí)驗(yàn)室保藏;菌株1C2PM04為生產(chǎn)CA前體次丹參酮二烯的尿嘧啶(URA3)缺陷型菌株;本研究中構(gòu)建菌株見(jiàn)電子版增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035384,下同);本研究所用PCR引物見(jiàn)電子版增強(qiáng)出版附表2,引物合成、密碼子優(yōu)化后的基因合成以及基因測(cè)序,蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基、試劑和儀器

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10,酵母粉5,蛋白胨10。

YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨20。

2×YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,酵母粉20,蛋白胨50。

MM培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(yeast nitrogen base, YNB)6.7,(NH4)2SO4Cl10。

SM培養(yǎng)基:在MM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加0.06 g/L尿嘧啶。

5-氟乳清酸(5-fluoroorotic acid,5-FOA)培養(yǎng)基:在SM培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2 g/L的5-FOA;對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基在原培養(yǎng)基上加入20 g/L瓊脂粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60,酵母粉10,蛋白胨20。

CA標(biāo)準(zhǔn)品、正十二烷(色譜純)、正己烷(色譜純)等,阿拉丁試劑公司;5-FOA、YNB、酵母RNA提取試劑盒等,生工生物工程(上海)股份有限公司;一步克隆試劑盒、熒光定量PCR試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;高速臺(tái)式離心機(jī),上海聯(lián)邁生物工程有限公司;WD-9403B 瓊脂糖凝膠電泳儀,北京市六一儀器廠;UV2000110紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海尤尼科有限公司;PCR擴(kuò)增儀,杭州米歐儀器有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物清潔試劑盒、瓊脂糖電泳凝膠回收試劑盒,康寧生命科學(xué)(吳江)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 整合框的構(gòu)建

以PUC57-CYP76AH24為模板,AH24-F和AH24-R為引物,PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的鐵銹醇合酶基因CYP76AH24并對(duì)其進(jìn)行試劑盒純化后備用;對(duì)質(zhì)粒PBRP01進(jìn)行NheI和SalI雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收8.2 kb片段并進(jìn)行試劑盒純化;將上述兩純化后的DNA片段通過(guò)一步克隆試劑盒進(jìn)行連接得到質(zhì)粒Ts-CYP76AH24-CarB。以PUC57-CYP76AK6為模板,AK6-F和AK6-R為引物,PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的鼠尾草酸合酶基因CYP76AK6并對(duì)其進(jìn)行試劑盒純化后備用;使用SpeI和XbaI對(duì)質(zhì)粒Ts-CYP76AH24-CarB雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳回收8.0 kb片段并進(jìn)行試劑盒純化;將上述兩純化后的DNA片段通過(guò)一步克隆試劑盒進(jìn)行連接得到質(zhì)粒Ts- PGAP1-CYP76AH24-TENO1-TPGK1-CYP76AK6-PFBA1。以FCPRA為模板,以CPR-F和CPR-R為引物,PCR擴(kuò)增4.0 kb片段PFBA1-ATR1-TADH2并對(duì)其進(jìn)行試劑盒純化后備用;對(duì)質(zhì)粒Ts-PGAP1-CYP76AH24-TENO1-TPGK1-CYP76AK6-PFBA1進(jìn)行NotI單酶切,瓊脂糖凝膠電泳回收后備用;將上述兩純化后的DNA片段通過(guò)一步克隆試劑盒進(jìn)行連接得到質(zhì)粒Ts-ATR-C(電子版增強(qiáng)出版附圖1-a,https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035384,下同)。對(duì)質(zhì)粒Ts-GRE3-gda324-URA3-GRE3(電子版增強(qiáng)出版附圖2)進(jìn)行EcoRI單酶切,并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行PCR清潔試劑盒純化,同時(shí)用MluI酶切質(zhì)粒Ts-ATR-C后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收,將上述兩純化后的DNA片段通過(guò)一步克隆試劑盒進(jìn)行連接,獲得重組質(zhì)粒Ts-GRE3-gda324-URA3-C(電子版增強(qiáng)出版附圖1-b);使用MluI酶切質(zhì)粒Ts-GRE3-gda324-URA3-C得到片段GRE3-gda324-URA3-PGAP1-CYP76AH24-TENO1-TPGK1-CYP76AK6-PFBA1-PFBA1-ATR1-TADH2,對(duì)所得片段進(jìn)行純化。

1.2.2C.tropicalis的氯化鋰轉(zhuǎn)化

熱帶假絲酵母氯化鋰轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)[18],以尿嘧啶缺陷型菌株1C2PM04為出發(fā)菌株,以URA3基因?yàn)楹Y選標(biāo)記,將純化后的DNA片段轉(zhuǎn)入宿主內(nèi)涂布于MM固體培養(yǎng)基后,在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。

1.2.3C.tropicalis轉(zhuǎn)化子的篩選與URA3的重復(fù)使用

挑取1.2.2節(jié)MM固體培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子提取基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證,將鑒別正確的轉(zhuǎn)化子涂布于5-FOA固體培養(yǎng)基上,對(duì)篩選標(biāo)記基因URA3進(jìn)行彈出,經(jīng)PCR驗(yàn)證標(biāo)記彈出后將純化后的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序,挑取鑒定正確的菌株進(jìn)行甘油管保藏。在上述基礎(chǔ)上重復(fù)使用篩選基因URA3[19],并對(duì)GRE3和XKS基因進(jìn)行敲除以及表達(dá)盒的整合。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

通過(guò)軟件Beacon Designer 7.9,設(shè)計(jì)熒光定量PCR所需引物QAH-F和QAH-R等。參考文獻(xiàn)[20]測(cè)定CYP76AH24、ATR1、ERG9等基因的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.5 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將重組菌株于YPD固體平板上劃線培養(yǎng)2 d后,在平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)接于20 mL YPD液體培養(yǎng)基中,置于200 r/min,30 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)1 d至OD600值達(dá)到8.0～10.0,后轉(zhuǎn)接于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,令其初始OD600值為0.1,將其置于30 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng),間隔12 h檢測(cè)OD600值,發(fā)酵96 h后取發(fā)酵液檢測(cè)。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物中CA的提取及檢測(cè)

CA的提取:取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心3 min,離心結(jié)束后吸去上清液后用無(wú)菌水洗滌2次。向沉淀中加入1 mL 3 mol/L的HCl溶液,置于沸水浴3 min后冰浴1 min快速冷卻,12 000 r/min離心3 min后棄去上清液,用1 mL無(wú)菌水再次洗滌沉淀。向沉淀加入1 mL甲醇,渦旋振蕩10 min后12 000 r/min離心5 min,取上清液500 μL置于干凈離心管中待檢測(cè)。

CA的檢測(cè):采用LC-MS檢測(cè)分析。LC檢測(cè)條件為BEH C18液相色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×150 mm),流動(dòng)相為100%甲酸-40 min;30%乙腈70%甲酸-45 min;80%乙腈20%甲酸-50 min;100%乙腈-55 min;100%甲酸,檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm,柱溫45 ℃,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA的生物合成

為構(gòu)建下游CA模塊,根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選擇了可以承擔(dān)兩步酶促反應(yīng)的雙功能酶CYP76AH24以及CYP76AK6,前者可以將次丹參酮二烯經(jīng)兩步酶催化轉(zhuǎn)化為11-羥基鐵銹醇,而后者將催化合成的11-羥基鐵銹醇轉(zhuǎn)化為CA。根據(jù)熱帶假絲酵母密碼子偏好性以及特殊性對(duì)CYP76AH24、CYP76AK6以及ATR1進(jìn)行全序列密碼子優(yōu)化以及基因合成,以1C2CM02為出發(fā)菌株,通過(guò)CRISPR Cas9系統(tǒng)在C.tropicalis基因組中的GRE3位點(diǎn)上分別整合了上述3條外源基因。其中整合框質(zhì)粒Ts-GRE3-gda324-URA3-C用MluⅠ單酶切(圖2-a),凝膠電泳回收并純化13.5 kb片段用于轉(zhuǎn)化,使用GRE3同源臂外側(cè)引物UGRE3-F和GRE3同源臂內(nèi)側(cè)引物UGRE3-R驗(yàn)證重組菌株基因組,正確轉(zhuǎn)化子條帶大小為1.0 kb(圖2-b),得到單拷貝菌株M02-CS。提取產(chǎn)物后經(jīng)LC-MS檢測(cè)鑒定,CA標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為5.55 min,而處理后的發(fā)酵液在該時(shí)間處測(cè)得對(duì)應(yīng)特征峰并對(duì)比標(biāo)品質(zhì)譜峰形完全一致(圖2)。結(jié)果顯示,在C.tropicalis中成功表達(dá)關(guān)于CA生物合成的外源基因。

2.2 下游途徑模塊化、區(qū)室化對(duì)CA生物合成的影響

外源基因區(qū)室化是將某些特定的代謝途徑定位在不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)或區(qū)室內(nèi),比如胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等。在本研究中,在C.tropicalis胞內(nèi)不同細(xì)胞區(qū)室獨(dú)有的理化環(huán)境來(lái)構(gòu)建生產(chǎn)二萜類化合物的平臺(tái),選取實(shí)驗(yàn)室前期篩選所得的過(guò)氧化物酶體信號(hào)肽(ICL、PTS1、ePTS1、POS4-A、BnICL)中較為優(yōu)秀的ePTS1作為本實(shí)驗(yàn)中用于將CA模塊定位在過(guò)氧化物酶體的信號(hào)肽[21]。因此,在CYP76AH24、CYP76AK6以及ATR1蛋白質(zhì)C端添加過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)肽并將其過(guò)表達(dá)構(gòu)建重組質(zhì)粒以獲得更優(yōu)秀的產(chǎn)CA菌株。通過(guò)此策略,成功構(gòu)建了單拷貝菌株M04-CS和M04-PS以及雙拷貝菌株M04-CD和M04-PD。隨后將上述重組菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,通過(guò)LC-MS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物,CA產(chǎn)量見(jiàn)圖3-a,菌株M04-PS、M04-PD、M04-CS和M04-CD的CA產(chǎn)量分別為1.21、2.85、4.64、10.25 mg/L。當(dāng)在外源基因C端后添加過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)肽時(shí),能夠在M04-PD和M04-PS的發(fā)酵液中檢測(cè)到CA。這表明CA前體物質(zhì)次丹參酮二烯可以穿過(guò)C.tropicalis的亞細(xì)胞器過(guò)氧化物酶體,以及上述外源基因可以在C.tropicalis過(guò)氧化物酶體中正常表達(dá)。根據(jù)圖3-b生長(zhǎng)曲線顯示,相對(duì)于單拷貝菌株,雙拷貝菌株的生長(zhǎng)情況明顯受到抑制,推測(cè)過(guò)表達(dá)下游CA模塊會(huì)加重細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)以及過(guò)量的CA可能對(duì)細(xì)胞膜具有損傷作用,影響生長(zhǎng)[22]。

a-重組菌株的CA產(chǎn)量測(cè)定;b-重組菌株的生長(zhǎng)情況圖3 重組熱帶假絲酵母鼠尾草酸產(chǎn)量以及生長(zhǎng)曲線Fig.3 Production of carnosic acid and growth curve in recombinant C.tropicalis

以肌動(dòng)蛋白基因(ACT)為內(nèi)參基因,通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)出發(fā)菌株ATCC 20336、M04-CS、M04-CD、M04-PS和M04-PD中的外源基因CYP76AH24、CYP76AK6及ATR1的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)結(jié)果顯示,由于ATCC 20336基因組中未整合外源基因,因此在對(duì)照組中無(wú)法檢測(cè)到對(duì)應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄信號(hào);而M04-CD和M04-PD均過(guò)表達(dá)相關(guān)基因,其mRNA相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于單拷貝菌株M04-CS和M04-PS(圖4)。結(jié)果表明,成功在M04-CD中過(guò)表達(dá)CA途徑外源基因,其搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量相對(duì)較高,將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行代謝工程改造。

圖4 外源基因在不同重組菌株中的表達(dá)水平Fig.4 Gene expression levels of exogenous gene in different yeast strains

2.3 下調(diào)ERG9對(duì)CA合成的影響

在熱帶假絲酵母中,法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate, FPP)是生物合成CA途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),其有2個(gè)分支代謝途徑:麥角固醇合成途徑和二萜類合成途徑。C.tropicalis作為二倍體酵母其角鯊烯合酶為一對(duì)等位基因,為使得FPP池代謝通量盡可能地流向二萜類合成途徑,因此選擇先敲除掉其中一條等位基因以此構(gòu)建GE0,再通過(guò)CRSPR-dCas9系統(tǒng)靶向ERG9不同區(qū)域下調(diào)另一條等位基因構(gòu)建GEA、GEB等菌株,構(gòu)建過(guò)程參考1.2.1節(jié)。將重組菌株M04-CD、GE0、GEB、GEC等分別接種于30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,相對(duì)于對(duì)照菌株M04-CD,下調(diào)ERG9的重組菌株的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制,與預(yù)期相符(圖5-a)。利用LC-MS分別測(cè)量了對(duì)照菌株及重組菌株CA生產(chǎn)情況,如圖5-b所示,在重組熱帶假絲酵母GEA、GEB等菌株中成功調(diào)控了內(nèi)源基因ERG9,相對(duì)于對(duì)照組轉(zhuǎn)錄水平,C.tropicalisGEB中ERG9轉(zhuǎn)錄水平顯著降低,并且該菌株中CA產(chǎn)量相對(duì)應(yīng)提高到對(duì)照菌株產(chǎn)量的2.6倍(圖5-c)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CA的產(chǎn)量和ERG9的表達(dá)水平是負(fù)相關(guān)的,即對(duì)內(nèi)源基因ERG9轉(zhuǎn)錄的抑制促使熱帶假絲酵母中CA的積累。

a-重組菌株GE0～GEF的生長(zhǎng)情況;b-重組菌株GE0～GEF的ERG9轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定;c-重組菌株GE0～GEF的CA產(chǎn)量測(cè)定圖5 GE0～GEF菌株CA產(chǎn)量、相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平以及生長(zhǎng)曲線Fig.5 Production of carnosic acid, relative transcription level and growth curve in recombinant C.tropicalis GE0-GEF

2.4 CYP76AH24和ATR1融合表達(dá)對(duì)CA合成的影響

有研究表明,將細(xì)胞色素P450基因(CYP450)與細(xì)胞色素還原酶基因與已編碼“Ser-Thr”的堿基密碼linker連接,設(shè)計(jì)引物提高A/T相對(duì)含量,這會(huì)使細(xì)胞色素P450和CPR活性得到提高,進(jìn)而影響下游萜類合成與修飾[23]。因此,將ATR1通過(guò)連接肽的形式連接在CYP76AH24的C端進(jìn)行融合表達(dá),進(jìn)一步提高下游模塊的催化效率以更好地合成CA。為測(cè)試柔性linker(G4S, G4S×2, G4S×3)和剛性linker(E3AK, E3AK×2, E3AK×3)哪種類型的linker更適合細(xì)胞色素和細(xì)胞色素還原酶的融合表達(dá),以1C2PM04為出發(fā)菌株,以強(qiáng)啟動(dòng)子PGAP1,分別使用剛性和柔性類型linker構(gòu)建并表達(dá)關(guān)鍵酶融合蛋白,得到重組菌株HD01～HD06,構(gòu)建過(guò)程參考1.2.1節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6,CYP76AH24和ATR1融合表達(dá)不會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成影響(圖6-a),剛性linker可以提高CA的產(chǎn)量,其中以E3AK×2融合表達(dá)CYP76AH24和ATR1的重組菌株HD05的CA產(chǎn)量達(dá)到15.75 mg/L,是對(duì)照菌株M04-CD的1.54倍(圖6-b)。結(jié)果表明,通過(guò)剛性linker融合表達(dá)CYP76AH24和ATR1可以提高CA產(chǎn)量,推測(cè)可能是兩種蛋白以復(fù)合體形式表達(dá)可以提高其中一種酶的活性進(jìn)而提高催化效率。對(duì)重組熱帶假絲酵母菌株HD05進(jìn)行ERG9敲除和下調(diào)構(gòu)建HD07,其CA產(chǎn)量為40.75 mg/L,構(gòu)建過(guò)程參考1.2.1節(jié),后續(xù)會(huì)在此菌株上繼續(xù)進(jìn)行代謝改造。

a-重組菌株HD01～HD06的CA產(chǎn)量測(cè)定; b-重組菌株HD01～HD06的生長(zhǎng)情況圖6 HD01～HD06菌株的CA產(chǎn)量以及生長(zhǎng)曲線Fig.6 Production of carnosic acid and growth curve in recombinant C.tropicalis HD01-HD06

2.5 增加細(xì)胞色素還原酶拷貝數(shù)提高CA產(chǎn)量

細(xì)胞色素P450是一種血紅蛋白類酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中。由于其具有脫烷基化、脫氨、氧化、羥基化等多種催化活性,CYP450在許多代謝途徑中發(fā)揮重要作用,如萜類、固醇類的生物合成途徑等。作為一種含鐵氧化酶,底物與CYP450的結(jié)合位點(diǎn)和其蛋白中血紅素-Fe3+復(fù)合物十分接近,催化反應(yīng)方程式為NADPH+H++RH+O2→NADP++H2O+ROH。細(xì)胞色素氧化還原伴侶細(xì)胞色素還原酶的作用為從上述方程中NADPH中傳遞一個(gè)電子將Fe3+還原為Fe2+使CYP450發(fā)揮功能,因此CPR傳遞電子這一步驟極有可能為CYP450氧化還原酶反應(yīng)的限速步驟。為研究細(xì)胞色素還原酶和細(xì)胞色素P450拷貝數(shù)比值對(duì)CA合成的影響,以HD07作為出發(fā)菌株,在熱帶假絲酵母基因組DPP3位點(diǎn)整合ATR1基因,進(jìn)一步過(guò)表達(dá)細(xì)胞色素還原酶,得到重構(gòu)組菌株HD08和HD09,構(gòu)建過(guò)程參考1.2.1節(jié)。將對(duì)照菌株HD07以及重組菌株HD08和HD09進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。如圖7所示,細(xì)胞色素還原酶基因ATR1的過(guò)表達(dá)使CA產(chǎn)量顯著提高,單拷貝菌株HD08較HD07提高1.21倍,雙拷貝菌株HD09較HD07提高1.92倍,產(chǎn)量達(dá)到78.24 mg/L。結(jié)果顯示,細(xì)胞色素還原酶基因ATR1拷貝數(shù)的增加使得胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)電子供體數(shù)量增加,可以有效提高CA的產(chǎn)量。

圖7 重組熱帶假絲酵母HD08和HD09菌株CA產(chǎn)量Fig.7 Production of carnosic acid in recombinant C.tropicalis HD08 and HD09

3 結(jié)論

本研究以熱帶假絲酵母1C2PM04出發(fā),鑒定表達(dá)了來(lái)源于鼠尾草的外源基因SfCYP76AH24和SfCYP76AK6以及來(lái)源于擬南芥的AtATR1,在熱帶假絲酵母胞質(zhì)中實(shí)現(xiàn)了CA的合成。通過(guò)將ATR1以連接linker的形式連接在SfCYP76AH24的C端,提高復(fù)合體CYP76AH24-ATR1催化CA前體次丹參酮二烯的催化效率,使得CA積累。敲除了內(nèi)源角鯊烯合酶基因ERG9,減少二萜類前體FPP的消耗,使更多的碳通量流向CA合成途徑。增加細(xì)胞色素還原酶拷貝數(shù),提高電子供體數(shù)量,進(jìn)而提高CA生物合成能力。經(jīng)過(guò)上述代謝改造后,最終獲得了一株以葡萄糖為底物生產(chǎn)CA的熱帶假絲酵母重組菌株HD09,經(jīng)發(fā)酵后其CA產(chǎn)量較初始菌株M04-CD提高7.6倍。但目前還存在一些問(wèn)題,比如將CA導(dǎo)向過(guò)氧化物酶體中后產(chǎn)量較胞內(nèi)產(chǎn)量更低,具體的代謝機(jī)理還未曾得知;過(guò)表達(dá)下游CA模塊和敲除或下調(diào)內(nèi)源基因ERG9都會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的抑制以及CA產(chǎn)量還有進(jìn)一步提升空間等。本研究構(gòu)建了以熱帶假絲酵母利用底物葡萄糖生產(chǎn)二萜類化合物CA的生物合成平臺(tái),得到了一株CA搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量78.24 mg/L的重組菌株,為針對(duì)假絲酵母利用葡萄糖生產(chǎn)二萜類化合物的代謝改造和進(jìn)一步研究提供了參考。