己二酸生物合成的途徑改造以及發(fā)酵條件優(yōu)化

支睿,李國輝*,毛銀,鄧禹*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

近些年來,隨著碳中和概念的提出和環(huán)境保護(hù)意識(shí)的逐漸增強(qiáng),通過全生物法合成工業(yè)化學(xué)品原料得到了廣泛的關(guān)注。伴隨著近年來代謝工程和合成生物學(xué)的不斷發(fā)展,利用如大腸桿菌(Escherichiacoli)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)等模式微生物合成二元羧酸的研究取得了一定的進(jìn)展[1-3]。己二酸是一種中長鏈二元羧酸,可應(yīng)用于尼龍材料、食品添加劑以及生物可降解塑料等多種工業(yè)制品中[4-5]。

生物法生產(chǎn)己二酸主要有3種路徑:逆/順β-氧化途徑結(jié)合ω-氧化途徑、逆己二酸降解途徑以及α-酮庚二酸途徑。在逆/順β-氧化途徑結(jié)合ω-氧化途徑中,CLOMBURG等[6]通過在大腸桿菌中過表達(dá)硫解酶、3-羥基乙酰輔酶A脫氫酶/脫水酶、反式烯酰輔酶A還原酶、ω-羧化酶、醇脫氫酶以及醛脫氫酶編碼基因構(gòu)建該途徑,通過敲除與己二酸合成途徑競爭碳流的部分基因,合成了170 mg/L己二酸。DENG等[7]發(fā)現(xiàn)一株嗜熱放線菌(Thermobifidafusca) B6可以通過逆己二酸降解途徑天然產(chǎn)己二酸,該途徑包括β-酮硫解酶、3-羥?；o酶A脫氫酶、3-羥基己二酰輔酶A脫氫酶、5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶以及己二酰輔酶A合成酶[2],在大腸桿菌中異源表達(dá)上述6個(gè)酶后,更換啟動(dòng)子提高限速酶5-羰基-2-戊烯酰輔酶A還原酶的表達(dá)量,敲除ldhA、atoB和sucD基因減少乳酸以及乙酸積累,增加丁二酰輔酶A積累,使己二酸產(chǎn)量達(dá)到1.8 g/L。α-酮庚二酸途徑包括高檸檬酸合成酶、高檸檬酸脫水酶、順高烏頭酸脫水酶、蘇式異高檸檬酸脫氫酶、α-酮庚二酸脫羧酶以及轉(zhuǎn)氨酶,TURK等[8]以此構(gòu)建了一條6-氨基己酸的合成路線,然而副產(chǎn)物己二酸的產(chǎn)量(0.32 g/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目標(biāo)產(chǎn)物6-氨基己酸(0.02 g/L),推測是大腸桿菌中內(nèi)源的半醛脫氫酶催化己二酸半醛生成了己二酸?？偟膩砜?逆己二酸降解途徑是一種有效的己二酸合成代謝途徑[9],但存在反應(yīng)途徑較長、外源基因表達(dá)不平衡等問題,導(dǎo)致難以對其進(jìn)行改造調(diào)控。

在微生物中過表達(dá)外源基因往往會(huì)對菌體生長產(chǎn)生代謝負(fù)擔(dān)[10],在模式微生物中代謝途徑基因大多利用T7啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá),而該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄以及翻譯強(qiáng)度較強(qiáng),對菌體造成的代謝負(fù)擔(dān)較大從而導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量無法提高[11],LIU等[12]在3-羥基丙酸代謝途徑中利用T7啟動(dòng)子分別表達(dá)一種丙二酰輔酶A還原酶的兩個(gè)表達(dá)模塊,3-羥基丙酸產(chǎn)量僅達(dá)到0.15 g/L。后續(xù)通過平衡兩個(gè)模塊的表達(dá)水平,3-羥基丙酸的產(chǎn)量達(dá)到3.72 g/L,較之前有了顯著提升。XU等[13]通過更換啟動(dòng)子調(diào)節(jié)紫色桿菌素代謝途徑基因的表達(dá)水平,使該產(chǎn)物的產(chǎn)量較對照提升了3.2倍。同樣,LIU等[14]通過更換啟動(dòng)子強(qiáng)度確定了玉米黃質(zhì)合成途徑中SgcE10與SgcE表達(dá)水平的最優(yōu)比例,高于或低于該比例都會(huì)導(dǎo)致玉米黃質(zhì)產(chǎn)量顯著下降。此外,還可以通過更換、優(yōu)化復(fù)制子、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)等[15-17]方法對代謝途徑基因的表達(dá)水平進(jìn)行優(yōu)化。

為協(xié)調(diào)逆己二酸降解途徑基因表達(dá),本研究將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的逆己二酸降解途徑分為4個(gè)模塊,選取不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒并進(jìn)行組合,利用構(gòu)建的己二酸生物傳感器開展高通量篩選驗(yàn)證,最終最優(yōu)組合產(chǎn)量達(dá)到120.60 mg/L。在此基礎(chǔ)上,開展發(fā)酵條件優(yōu)化,己二酸產(chǎn)量達(dá)到240.49 mg/L,較對照提升了16.65倍。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109、DH5α為構(gòu)建質(zhì)粒的宿主菌株;大腸桿菌K12 MG1655為己二酸傳感器宿主菌株以及擴(kuò)增paaJ、paaH、paaF基因的菌株;大腸桿菌K12 MG1655 ΔatoBΔsucDΔpflBΔadhEΔarcAΔldhAΔpoxBΔpta為表達(dá)逆己二酸降解途徑的宿主菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10,胰蛋白胨10,酵母粉5;

TB培養(yǎng)基(g/L):K2HPO4·3H2O 16.34,KH2PO42.31,胰蛋白胨 12,酵母粉 24;

Modified TB培養(yǎng)基(g/L):K2HPO4·3H2O 8.17,KH2PO42.31,胰蛋白胨12,酵母粉 24,NH4Cl 10.70,CuSO4·5H2O 2.5×10-6。

1.1.3 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨,英國Oxoid公司;抗生素(卡那霉素以及鏈霉素),生工生物工程(上海)股份有限公司;其余所有試劑購自中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司或北京伊諾凱科技有限公司。

1.1.4 儀器與設(shè)備

ETC811 PCR儀,德國Eppendorf公司;SYNERGY H1多功能酶標(biāo)儀,美國Bio-Tek有限公司;ST 16R冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技(中國)有限公司;1260 Infinity II高效液相色譜,美國安捷倫有限公司;Waters Acquity UPLC超高效液相色譜、BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm, 1.7 μm)、MALDI SYNAPT Q-TOF MS質(zhì)譜,美國沃特世公司;HPX-87H色譜柱,美國伯樂公司;UV-1800紫外可見分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建

諾唯贊2×Rapid taq Master Mix以及2×Phanta Flash Mix (Dye Plus)被分別用于菌落PCR和基因/啟動(dòng)子擴(kuò)增。密碼子優(yōu)化后的acot8、cat1、ter、benM基因由蘇州金唯智科技有限公司合成。paaJ、paaH以及paaF基因由大腸桿菌K12 MG1655(實(shí)驗(yàn)室保藏)擴(kuò)增而來。組成型啟動(dòng)子PrpsU以及Pmdh源自ZHOU等[18]構(gòu)建的組成型啟動(dòng)子庫。組成型啟動(dòng)子PPL818、PPL3230、PPL2536、PPL106、PPL729、PPL1937、PPL3206以及PPL2787源自ZHAO等[19]等構(gòu)建的組成型啟動(dòng)子庫?？蛰d質(zhì)粒pCDFDuet-1以及pRSFDuet-1被作為載體表達(dá)逆己二酸降解途徑基因。

質(zhì)粒pCDF-PPL729-cat1-paaF-PPL3206-ter的構(gòu)建過程如下:首先,以pCDF- Pmdh-cat1-paaF-PrpsU-ter為模板,在需要更換啟動(dòng)子的位點(diǎn)(Pmdh)設(shè)計(jì)響應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收片段。其次,以組成型啟動(dòng)子PPL729片段為載體,回收片段為插入片段進(jìn)行同源重組構(gòu)建pCDF- PPL729-cat1-paaF-PrpsU-ter質(zhì)粒。隨后,以pCDF- PPL729-cat1-paaF-PrpsU-ter,在需要更換啟動(dòng)子的位點(diǎn)(PrpsU)設(shè)計(jì)響應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收片段,再以組成型啟動(dòng)子PPL3206片段為載體,回收片段為插入片段進(jìn)行同源重組構(gòu)建pCDF-PPL729-cat1-paaF-PPL3206-ter質(zhì)粒。其余質(zhì)粒均按以上方法進(jìn)行構(gòu)建。

1.2.2 搖瓶及孔板發(fā)酵方法

搖瓶發(fā)酵:將保存在-80 ℃的菌液或平板上的單菌落接種于含有10 mL LB培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中,37 ℃, 250 r/min培養(yǎng)12～16 h后,以2%接種量轉(zhuǎn)接至含有50 mL新鮮培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,開始發(fā)酵,培養(yǎng)條件為37 ℃, 200 r/min。

孔板發(fā)酵:將平板上的單菌落接種至48孔板中,37 ℃, 250 r/min培養(yǎng)12～16 h后,以2%接種量轉(zhuǎn)接至24孔板中進(jìn)行發(fā)酵,培養(yǎng)條件為37 ℃, 250 r/min。

1.2.3 高通量篩選

初篩:從平板上挑選的單菌落在24孔板發(fā)酵48 h后,將發(fā)酵液于12 000 r/min離心10 min,取上清液500 μL以1∶1的配比加入培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600=0.6～0.8)的己二酸傳感器發(fā)酵液中,30 ℃, 250 r/min培養(yǎng)4 h后測定熒光。將熒光值高的菌種保藏于-80 ℃冰箱中。

復(fù)篩:將熒光值高的菌種接種于含有10 mL LB培養(yǎng)基的50 mL 三角瓶中,37 ℃, 250 r/min培養(yǎng)12～16 h后,以2%接種量轉(zhuǎn)接至含有50 mL新鮮培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37 ℃, 200 r/min培養(yǎng)72 h,將發(fā)酵液處理后利用高效液相色譜測定己二酸產(chǎn)量以進(jìn)一步篩選己二酸高產(chǎn)菌株。

1.3 分析方法

菌體OD600值由紫外可見分光光度計(jì)測定。

發(fā)酵樣品首先于12 000 r/min離心10 min,取500 μL上清液用10 mmol/L稀硫酸稀釋后,再于12 000 r/min離心10 min。隨后,用0.2 μm水系濾膜過濾。己二酸產(chǎn)量由高效液相色譜測定,檢測器為紫外檢測器(210 nm),流動(dòng)相為5 mmol/L稀硫酸,流速為0.6 mL/min,測定溫度為35 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。

為對己二酸進(jìn)行定性定量分析,本研究采用LC-MS進(jìn)行檢測。液相部分,檢測器為光二級體檢測器(210 nm),溫度為45 ℃,流速為0.3 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL。流動(dòng)相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸以及純乙腈。梯度洗脫程序:在0～7.3 min,流動(dòng)相配比為100% 0.1%甲酸;在7.3～8.2 min,流動(dòng)相配比為70% 0.1%甲酸以及30%純乙腈;在8.2～9.1 min,流動(dòng)相配比為20% 0.1%甲酸以及80%純乙腈;在9.1～10 min,流動(dòng)相配比為100% 0.1%甲酸。質(zhì)譜部分由Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS檢測器檢測[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 逆己二酸降解途徑的構(gòu)建、驗(yàn)證與優(yōu)化

以實(shí)驗(yàn)室保藏的八敲大腸桿菌K12 MG1655 (ΔatoBΔsucDΔpflBΔadhEΔarcAΔldhAΔpoxBΔpta)為底盤宿主,選擇源自大腸桿菌K12 MG1655的β-酮硫解酶、3-羥?；o酶A脫氫酶以及3-羥基己二酰輔酶A脫氫酶基因(paaJ、paaH、paaF)[21]、源自齒垢密螺旋體(Treponemadenticola)的5-羧基-2-戊烯酰輔酶A還原酶基因(ter)[22]以及源自小鼠(Musmusculus)的己二酰輔酶A合成酶基因(acot8)[23]構(gòu)建逆己二酸降解途徑。另外,選擇源自克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)的輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(cat1)[24]合成丁二酰輔酶A以提高途徑前體供應(yīng)量。通過吉布森組裝,首先構(gòu)建質(zhì)粒pRSF-Pmdh-paaJ-paaH以及pCDF-Pmdh-cat1-paaF,最后構(gòu)建質(zhì)粒pRSF-Pmdh-paaJ-paaH-PrpsU-acot8(pAD2)以及pCDF-Pmdh-cat1-paaF-PrpsU-ter(pAD4)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入八敲大腸桿菌中得到Δ8-pAD24并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵(圖1)。如圖1-b所示,72 h發(fā)酵樣品的LC-MS結(jié)果與己二酸標(biāo)樣一致,產(chǎn)量達(dá)到14.44 mg/L。

為調(diào)控途徑基因在底盤細(xì)胞中的表達(dá)水平,本研究首先將途徑基因模塊化,進(jìn)而更換各模塊啟動(dòng)子以優(yōu)化逆己二酸降解途徑,從而平衡途徑基因在宿主中的表達(dá)水平。首先,將逆己二酸降解途徑分為4個(gè)模塊(圖2-a);其次,從ZHAO等[19]構(gòu)建的組成型啟動(dòng)子庫選取8個(gè)組成型啟動(dòng)子,其中每個(gè)模塊分別用高低兩種表達(dá)水平的啟動(dòng)子啟動(dòng),以此構(gòu)建相應(yīng)質(zhì)粒(圖2-b)。構(gòu)建完成后采用全因子法[25]對質(zhì)粒進(jìn)行組合(圖2-a),因該啟動(dòng)子庫中啟動(dòng)子序列同源性較強(qiáng),在構(gòu)建過程中易發(fā)生同源重組導(dǎo)致構(gòu)建失敗[26],最終成功構(gòu)建除pRSF-PPL818-paaJ-paaH-PPL106-acot8以外的7種質(zhì)粒,得到12種組合以進(jìn)行下一步的研究。

2.2 結(jié)合己二酸生物傳感器篩選最優(yōu)組合

為避免因基因異質(zhì)性導(dǎo)致己二酸產(chǎn)量降低從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,使用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的高通量方法對每種組合開展驗(yàn)證。該高通量篩選方法分為3步:轉(zhuǎn)化、初篩和復(fù)篩。首先,從平板上挑出轉(zhuǎn)化子,菌落PCR驗(yàn)證正確后進(jìn)行24孔板發(fā)酵,以己二酸生物傳感器篩選熒光值較高的菌株,再轉(zhuǎn)入搖瓶中發(fā)酵以進(jìn)行復(fù)篩,以高效液相色譜驗(yàn)證己二酸產(chǎn)量。初篩過程中使用生物傳感器為轉(zhuǎn)錄因子型傳感器(抑制型),以BenM (TISNO-120)[27]為轉(zhuǎn)錄因子,由PPL1986啟動(dòng)子控制。其工作原理與乳糖操縱子類似,當(dāng)BenM未與己二酸結(jié)合時(shí),其與BenO的結(jié)合方式會(huì)組織對RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄,而當(dāng)BenM與己二酸結(jié)合時(shí),該轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變,RNA聚合酶從而能夠結(jié)合在BenO上,以激活下游綠色熒光蛋白表達(dá)。

將每種組合的轉(zhuǎn)化子各挑24個(gè)在孔板中進(jìn)行發(fā)酵后測定熒光,結(jié)果如圖3-a所示,熒光值最高的為高表達(dá)模塊1(paaJ,paaH)和模塊2 (acot8)與低表達(dá)模塊3 (cat1,paaF)和模塊4(ter)的組合。搖瓶復(fù)篩驗(yàn)證各組合的結(jié)果如圖3-b所示,各組合復(fù)篩的產(chǎn)量與初篩得到的結(jié)果能夠相互印證,高表達(dá)模塊1和2,低表達(dá)模塊3和模塊4的組合己二酸產(chǎn)量最高,達(dá)到120.60 mg/L,產(chǎn)量相較于Δ8-pAD24提高8.35倍。其次,可以發(fā)現(xiàn)過表達(dá)模塊1的組合己二酸產(chǎn)量較高,由此可以確定逆己二酸降解途徑的關(guān)鍵酶為β-酮硫解酶以及3-羥基酰輔酶A脫氫酶。最后,高表達(dá)4種基因的組合己二酸產(chǎn)量最低,僅達(dá)到52.39 mg/L,從該結(jié)果可以看出,在構(gòu)建代謝途徑過程中,全部高表達(dá)途徑基因不是最優(yōu)選擇,平衡各途徑基因的表達(dá)水平能顯著提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量。以最優(yōu)組合為基礎(chǔ),本研究繼續(xù)開展發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

都

2.3 發(fā)酵優(yōu)化提高己二酸產(chǎn)量

2.3.1 接種量

接種量不同會(huì)在不同程度影響菌體的生長條件和產(chǎn)物合成水平[28],同時(shí)己二酸生物合成為生長偶聯(lián)型,需要菌體達(dá)到較好生長狀況才能更有效的合成己二酸,因此本研究以2%接種量為對照,選擇4種不同接種量作為實(shí)驗(yàn)組,優(yōu)化接種量以提高己二酸產(chǎn)量。結(jié)果如圖4所示,從圖4-b可以看出,在接種量為4%時(shí),己二酸產(chǎn)量最高,達(dá)到而在該接種量下,菌體的生長情況在各組中也為最優(yōu)。同時(shí),當(dāng)接種量大于4%后,己二酸產(chǎn)量是隨著接種量增加而減少的,由此可見過高的接種量對于產(chǎn)物合成有負(fù)面影響。綜上,選擇4%接種量進(jìn)行下一步的研究。

2.3.2 銨鹽

無機(jī)氮源是大腸桿菌偏好吸收的氮源[29],為優(yōu)化培養(yǎng)基成分改善菌體生長狀況,進(jìn)一步提高己二酸產(chǎn)量,在TB培養(yǎng)基有機(jī)氮源(酵母粉以及胰蛋白胨)的基礎(chǔ)上,選擇不同濃度的NH4Cl作為無機(jī)氮源,對產(chǎn)己二酸培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化。從圖5-b可以看出,隨著NH4+濃度的增加,己二酸產(chǎn)量明顯減少,但添加了20 mmol/L NH4Cl后己二酸產(chǎn)量(157.74 mg/L)較對照組(120.59 mg/L)有明顯提升,因此選擇20 mmol/L NH4Cl作為無機(jī)氮源進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

a-逆己二酸降解途徑的模塊化與不同質(zhì)粒的組合方法; b-各模塊對應(yīng)的組成型啟動(dòng)子強(qiáng)度圖2 逆己二酸降解途徑模塊化優(yōu)化Fig.2 The modularization optimization of the reverse adipate degradation pathway 注:熒光強(qiáng)度由sfGFP/OD600值表征(下同)。

a-初篩結(jié)果;b-復(fù)篩結(jié)果圖3 不同組合的高通量篩選結(jié)果Fig.3 The screening results of the high-throughput screening method of different combinations

a-菌體生長情況;b-己二酸產(chǎn)量圖4 接種量對己二酸合成的影響Fig.4 Effects of inoculation on the biosynthesis of adipic acid

a-菌體生長情況;b-己二酸產(chǎn)量圖5 銨鹽對己二酸合成的影響Fig.5 Effects of ammonium on the biosynthesis of adipic acid

2.3.3 磷酸氫鹽

磷酸氫鹽是一類緩沖物質(zhì),有助于在發(fā)酵過程中維持發(fā)酵環(huán)境的pH值,促進(jìn)菌體的基礎(chǔ)代謝。因此,優(yōu)化了TB培養(yǎng)基中磷酸氫鹽的用量,以7 mmol/L磷酸氫鹽為對照組,選擇不同濃度的磷酸氫鹽添加進(jìn)培養(yǎng)基。結(jié)果如圖6所示,隨著磷酸氫鹽濃度的逐漸添加,己二酸的產(chǎn)量逐漸下降,當(dāng)磷酸氫鹽濃度為3.5 mmol/L時(shí),己二酸產(chǎn)量達(dá)到178.09 mg/L,因此選擇該濃度繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

a-菌體生長情況;b-己二酸產(chǎn)量圖6 磷酸氫鹽對己二酸合成的影響Fig.6 Effects of hydrogen phosphate on the biosynthesis of adipic acid

2.3.4 金屬離子

金屬離子如Mn2+、Zn2+、Ca2+等是酶常見的輔因子,在培養(yǎng)基中添加金屬離子有助于增加代謝途徑酶的酶活性,提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量[30]。同時(shí),添加金屬離子也可以在一定程度上維持發(fā)酵環(huán)境的pH穩(wěn)定。因此,選取Mn2+、Ca2+、Zn2+、Fe2+、Cu2+分別添加進(jìn)優(yōu)化后的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示,金屬離子的添加有效提高了己二酸的產(chǎn)量,其中添加了Cu2+的培養(yǎng)基己二酸產(chǎn)量最高,達(dá)到240.49 mg/L。

3 結(jié)論與討論

本研究首先將逆己二酸降解途徑模塊化,通過更換不同啟動(dòng)子協(xié)調(diào)逆己二酸降解途徑各基因表達(dá)強(qiáng)度,最后通過高通量篩選方法對組合進(jìn)行驗(yàn)證,確定了途徑關(guān)鍵酶PaaJ以及PaaH,對逆己二酸降解途徑基因在底盤細(xì)胞中的表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)了成功調(diào)控,使己二酸產(chǎn)量達(dá)到120.66 mg/L,產(chǎn)量有了明顯提高,為后續(xù)優(yōu)化代謝途徑的研究提供了借鑒。同時(shí),在最優(yōu)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化,己二酸產(chǎn)量提高了16.65倍,達(dá)到240.49 mg/L。在后續(xù)研究中,可以從挖掘途徑同工酶、基因元件選擇以及發(fā)酵過程參數(shù)等方面通過合成生物學(xué)以及代謝工程策略進(jìn)行進(jìn)一步探究,提高己二酸生物合成的水平。