大腸桿菌發(fā)酵低廉生物質(zhì)產(chǎn)乙醇酸及其分離純化研究

胡成杰,毛銀,李國(guó)輝*,鄧禹*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

乙醇酸(HOCH2COOH)又稱羥基乙酸,作為最簡(jiǎn)單的α-羥基酸,同時(shí)具有酸和醇的優(yōu)良性質(zhì)[1],使其在醫(yī)藥、化妝品、紡織、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。乙醇酸具有出色的水溶性、中強(qiáng)酸度等特性,使其很容易被皮膚吸收,從而達(dá)到去角質(zhì)、保濕、清潔、肌膚抗氧化的功效。在材料包裝領(lǐng)域,乙醇酸聚合生成的可降解聚合物聚乙醇酸(polyglycolic acid, PGA)[2]以及乙醇酸和乳酸聚合生成的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA][3]都具有良好生物降解性、緩釋性和生物相容性,被美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)用于多種治療用途,如:手術(shù)縫合,皮膚移植等。此外,乙醇酸還因?yàn)榫哂袠O強(qiáng)的水溶性,可以通過(guò)化學(xué)反應(yīng)清除設(shè)備中的鈣鹽、鎂鹽、鐵垢等以達(dá)到除垢的目的,且乙醇酸腐蝕性較小,所以常用70%的乙醇酸水溶液作為清洗劑,廣泛應(yīng)用于金屬設(shè)備及管道清洗去除污垢。

目前國(guó)內(nèi)主要采取化學(xué)法大規(guī)模合成乙醇酸,如氯乙酸法、甲醛氰化法、甲醛氫羧基化法、草酸酯加氫水解法等[4]。但上述方法多少存在反應(yīng)條件苛刻、催化劑成本高,產(chǎn)物分離精制要求高等缺點(diǎn),且化學(xué)法制備乙醇酸主要為70%水溶液,其濃縮生產(chǎn)晶體級(jí)乙醇酸時(shí),會(huì)有較大損耗,以至于醫(yī)藥行業(yè)的乙醇酸原料必須從強(qiáng)生等外國(guó)公司進(jìn)口。近年來(lái),通過(guò)改造工程菌株代謝生產(chǎn)生物基乙醇酸得到廣泛關(guān)注,DENG等[5]在大腸桿菌中過(guò)表達(dá)乙醇酸合成途徑關(guān)鍵酶(例如乙醛酸還原酶、檸檬酸合酶和異檸檬酸裂合酶)以及敲除競(jìng)爭(zhēng)途徑,使得乙醇酸產(chǎn)量可達(dá)到65.5 g/L。YU等[6]構(gòu)建NADPH和碳流量協(xié)同體系將乙醇酸產(chǎn)量提高至73.3 g/L。不過(guò)目前全生物法合成乙醇酸依舊存在發(fā)酵成本較高等問(wèn)題,限制了其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用,尤其缺乏對(duì)下游分離純化技術(shù)的相關(guān)報(bào)道。

本研究中,利用重組大腸桿菌Mgly71(MG1655 DE3,harboring PJUN-5 and PJUN-YA),在搖瓶水平上對(duì)乙醇酸發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)響應(yīng)面法獲得最優(yōu)營(yíng)養(yǎng)組合,重點(diǎn)考察玉米芯水解液(corncobs hydrolysate, CCH)等低廉生物質(zhì)成分,開(kāi)展5 L發(fā)酵罐水平初步放大驗(yàn)證,并進(jìn)行下游生物分離純化初步研究,以期為生物基乙醇酸的規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

大腸桿菌Mgly71(MG1655 DE3,ΔldhAΔglcBΔaceBΔaldAΔglcDEFΔicdΔglcC,harboring PJUN-5 and PJUN-YA),本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

M9發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO46.78,KH2PO43,NH4Cl 1,NaCl 0.5,MgSO40.24(單獨(dú)滅菌),CaCl20.01,蛋白胨8,酵母粉2,葡萄糖8。

優(yōu)化培養(yǎng)基(g/L):CaCl26.66×10-3,MgS04·7H2O 1.2×10-2,ZnCl20.13×10-3,MnCl2·4H2O 0.04×10-3,KH2PO44.5,玉米芯水解液13,NH3·H2O 0.78,酵母粉1.5,胰蛋白胨8.5,NaCl 0.5,Na2HPO425.45。

1.1.3 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司;1260 Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng),美國(guó)安捷倫有限公司;HYL-C3組合式搖床,太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;5424臺(tái)式高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf(艾本德)公司;G154DWS立式壓力蒸汽滅菌鍋,美國(guó)致微有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液的檢測(cè)

取1 mL發(fā)酵液,10 000 r/min離心2 min后取上清液過(guò)0.22 μm濾膜。利用高效液相色譜定量檢測(cè)葡萄糖、乙醇酸、乙醛酸、乳酸和乙酸。其中葡萄糖檢測(cè)器為示差檢測(cè)器,其余有機(jī)酸物質(zhì)的檢測(cè)用紫外檢測(cè)器(210 nm)。檢測(cè)參數(shù)為:柱溫35 ℃,流動(dòng)相5 mmol/L稀硫酸,流速0.6 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 熒光檢測(cè)

將培養(yǎng)的菌液取50 μL置于底透壁黑的96孔板,并用PBS稀釋3倍進(jìn)行單細(xì)胞熒光檢測(cè)。綠色熒光激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為528 nm,吸收波長(zhǎng)為600 nm。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌株篩選

將電轉(zhuǎn)得到的Mgly71菌株在37 ℃搖床孵育培養(yǎng)1 h后,涂布于含有鏈霉素、氨芐青霉素的瓊脂平板上。挑取較大的存活單菌落(菌落直徑>1 mm),在48孔板中培養(yǎng)發(fā)酵24 h后,細(xì)胞以4 000 r/min離心5 min。將上清液、對(duì)數(shù)期的MglyC-GP6細(xì)胞培養(yǎng)液以1∶10的比例轉(zhuǎn)移到96孔深孔板中,以誘導(dǎo)傳感器pGBS-PffS-sfgfp中sfGFP的表達(dá)。在30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,測(cè)量混合物的熒光。

1.3.2 種子培養(yǎng)

將保存于-80 ℃冰箱的菌種在固體LB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線,在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～16 h;挑取單菌落于裝有10 mL LB培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中,37 ℃培養(yǎng)12～13 h作為一級(jí)種子液;按2%接種量接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,培養(yǎng)9 h作為二級(jí)種子液。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將事先培養(yǎng)好的種子液以2%的接種量接種于裝有50 mL M9發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,并添加相應(yīng)的抗生素,37 ℃,250 r/min條件下培養(yǎng)。

1.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn)

以乙醇酸(glycolic acid,GA)產(chǎn)量為響應(yīng)值,依次對(duì)碳源種類、無(wú)機(jī)氮源種類、有機(jī)氮源比例、金屬離子種類等影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定乙醇酸發(fā)酵培養(yǎng)基的關(guān)鍵影響因素的添加量,采用Design Expert 11軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.4.3 中心組合設(shè)計(jì)(central composite design, CCD)和響應(yīng)面分析(response surface methodology, RSM)

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn),確定3個(gè)對(duì)乙醇酸產(chǎn)量顯著影響因素。借助Design Expert 11軟件進(jìn)行CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型建立,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

1.5 5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證

在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,選擇初始裝液量2.5 L,接種量為5%,轉(zhuǎn)速為380 r/min,發(fā)酵溫度37 ℃,加入一定氨芐青霉素和鏈霉素使其終質(zhì)量濃度分別為100、50 mg/L。發(fā)酵期間以氨水調(diào)控pH為7.0,調(diào)節(jié)通氣量和轉(zhuǎn)速控制溶氧為30%。

1.6 乙醇酸分離純化

1.6.1 發(fā)酵液預(yù)處理

發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液121 ℃滅菌20 min,10 000 r/min離心20 min,收集上清液,按照1.2.1節(jié)中方法測(cè)定乙醇酸濃度。

1.6.2 活性炭脫色發(fā)酵液條件優(yōu)化

發(fā)酵液中色素成分復(fù)雜,一般通過(guò)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,以其中最大吸收峰的位置對(duì)應(yīng)波長(zhǎng)的吸光值變化作為脫色效果的參考依據(jù);以液相檢測(cè)來(lái)確認(rèn)分離純化各個(gè)步驟溶液中乙醇酸的濃度[7]。脫色率和乙醇酸損失率的計(jì)算如公式(1)和公式(2)所示:

式中:D,脫色率,%;A0,脫色前吸光值;Ae,脫色后吸光值;R,乙醇酸損失率,%;C0,脫色前乙醇酸濃度,g/L;Ce,脫色后乙醇酸濃度,g/L;V0,脫色前發(fā)酵液體積,mL;Ve,脫色后發(fā)酵液體積,mL。

在預(yù)處理后的發(fā)酵上清液中,加入6 g/100 mL的活性炭,在40 ℃、1 000 r/min條件下反應(yīng)60 min,真空抽濾后測(cè)定濾液的吸光度和乙醇酸濃度,計(jì)算脫色率和乙醇酸損失率。在此基礎(chǔ)上,依次探究活性炭添加量(1、2、3、4、5、7、9、11 g/100 mL)、脫色溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)、脫色時(shí)間(0.5、1、2、3、4 h)對(duì)脫色率、乙醇酸損失率的影響。

1.6.3 脫色液的脫鹽和提純

取50 mL乙醇酸發(fā)酵液加入4 mL氨水,室溫?cái)嚢? h。加入1.97 g Ca(OH)2(30%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),40 ℃反應(yīng)6 h,取沉淀加入14 mL硫酸(1.84 mol/L)進(jìn)行酸化,55 ℃攪拌2 h,離心取50 mL酸化上清液加入濃氨水至上清液為中性,加入乙醇酸體積3倍的無(wú)水異丙醇,于室溫下攪拌0.5 h后進(jìn)行抽濾,將濾液進(jìn)行常壓脫醇,至料溫40～75 ℃后進(jìn)行高真空(2～8 kPa)回收醇,料溫在40～75 ℃時(shí)停止回收。

1.6.4 乙醇酸的結(jié)晶和檢測(cè)

將獲得的料液以1 ℃/min開(kāi)始降溫析晶,當(dāng)溫度降到0～20 ℃時(shí)停止降溫,在此溫度下恒溫保持1 h,隨后進(jìn)行恒溫抽濾,所得濾餅用少許冰水淋洗,即為乙醇酸濕品,進(jìn)而在低溫高真空條件下獲得高純度的固體乙醇酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌株的確定

本實(shí)驗(yàn)室前期成功在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建了乙醇酸生產(chǎn)途徑[5],本研究從已構(gòu)建的Mgly71菌株出發(fā),利用乙醇酸生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp[8],篩選1株生產(chǎn)乙醇酸性能較好的Mgly71菌株,作為本研究工程菌株。結(jié)果如圖1所示。生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp擬合性驗(yàn)證結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度與乙醇酸濃度呈正比趨勢(shì),相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.90,證明該方法能較為快速準(zhǔn)確檢測(cè)乙醇酸。驗(yàn)證成功后通過(guò)轉(zhuǎn)化Mgly7菌株進(jìn)行篩選,根據(jù)單細(xì)胞熒光值進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。最后,在復(fù)篩得到的25株菌株中存在3株乙醇酸產(chǎn)量大于1.3 g/L的Mgly71菌株,其中最高產(chǎn)量為1.33 g/L,故選擇該菌株為出發(fā)菌株。

a-生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp篩選下熒光和 乙醇酸濃度之間的相關(guān)性驗(yàn)證;b-Mgly71工程菌株篩選圖1 生物傳感器pGBS-PffS-sfgfp篩選下熒光和 乙醇酸濃度之間的相關(guān)性驗(yàn)證和Mgly71工程菌株篩選Fig.1 Validation of the fit of the biosensor pGBS-PffS-sfgfp and screening of the engineered strain Mgly7

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

在微生物發(fā)酵過(guò)程中,碳源為微生物生長(zhǎng)代謝提供了細(xì)胞的碳架以及細(xì)胞生命活動(dòng)所需的能量。本實(shí)驗(yàn)以相同碳摩爾濃度的果糖、半乳糖、木糖、玉米芯水解液、麥芽糖、乳糖替換M9發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖,搖瓶發(fā)酵24 h后測(cè)定菌體濃度與乙醇酸產(chǎn)量,不同碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和乙醇酸產(chǎn)量影響情況如圖2-a所示,葡萄糖作為常見(jiàn)的速效碳源,最適合菌體生長(zhǎng),但在乙醇酸產(chǎn)量方面,果糖、半乳糖、玉米芯水解液、木糖作為碳源的效果均明顯更好,產(chǎn)量分別可達(dá)2.14、1.94、1.8、1.75 g/L,這可能是因?yàn)槠咸烟堑母咝Тx速率超出乙醛酸還原酶的酶催化能力導(dǎo)致產(chǎn)生大量副產(chǎn)物乙酸,抑制了乙醇酸產(chǎn)物的形成。酶解玉米芯水解液中除主要碳源外還含有多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[9],有利于乙醇酸產(chǎn)量的提高。從成本考慮,半乳糖和果糖價(jià)格約為葡萄糖的25倍,木糖價(jià)格約為葡萄糖的10倍,而玉米芯水解液來(lái)源于農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯[10],價(jià)格低廉。因此選擇玉米芯水解液作為最終碳源,碳源濃度對(duì)乙醇酸產(chǎn)量的影響如圖2-b所示,隨著碳源濃度的增加,菌體的乙醇酸產(chǎn)量呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),當(dāng)玉米芯水解液添加量為10 g/L時(shí),乙醇酸產(chǎn)量最高,達(dá)到2.02 g/L。因此選擇10 g/L的玉米芯水解液作為碳源。

a-碳源種類;b-玉米芯水解液(CCH)添加量圖2 碳源對(duì)工程大腸桿菌發(fā)酵乙醇酸的影響Fig.2 Effect of carbon source on fermentation of glycolic acid by engineering Escherichia coli

2.2.1.2 培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

氮源是微生物生長(zhǎng)的必需物質(zhì),對(duì)于生長(zhǎng)偶聯(lián)型菌株的影響巨大[11]。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)混合氮源更有利于菌體生長(zhǎng)和乙醇酸產(chǎn)量的提高[12]。本研究在此基礎(chǔ)上分別探究無(wú)機(jī)氮源種類和有機(jī)氮源比例對(duì)菌株的影響。以相同摩爾質(zhì)量的磷酸二氫銨、磷酸氫二銨、硫酸銨、氨水替換M9發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化銨,搖瓶發(fā)酵24 h后測(cè)定菌體濃度與乙醇酸產(chǎn)量,結(jié)果如圖3-a所示,不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較小,因?yàn)闊o(wú)機(jī)氮源作為速效氮源,可以滿足微生物前期生長(zhǎng)需求,而有機(jī)氮源則滿足菌體中后期生長(zhǎng)需要[11]。以氨水作為無(wú)機(jī)氮源時(shí),乙醇酸產(chǎn)量最高,達(dá)到2.1 g/L,雖然添加氨水導(dǎo)致培養(yǎng)基初始pH提高,在前期明顯抑制了菌體的生長(zhǎng),但在后期菌體濃度差距不大,因此選擇0.66 g/L氨水作為無(wú)機(jī)氮源。

a-氮源種類;b-酵母粉濃度圖3 氮源對(duì)工程大腸桿菌發(fā)酵乙醇酸的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on fermentation of glycolic acid by engineering E. coli

以酵母粉和蛋白胨組成的混合有機(jī)氮源不僅能夠提供氮源,還含有豐富的礦物質(zhì)、維生素以及氨基酸等菌體生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。固定有機(jī)氮源的濃度為10 g/L,以不同酵母粉占總氮比例的混合氮源開(kāi)展研究。結(jié)果如圖3-b所示,酵母粉占總氮比例為15%時(shí),乙醇酸產(chǎn)量最高,可達(dá)1.47 g/L。因此選擇0.66 g/L氨水、8.5 g/L蛋白胨和1.5 g/L酵母粉作為最佳混合氮源。

2.2.1.3 培養(yǎng)基金屬離子的優(yōu)化

在M9發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.43 mg/L CuCl2·2H2O、0.1 mg/L MnCl2·4H2O、0.14 g/L FeCl2·4H2O、1.64 mg/L ZnCl2來(lái)探究金屬離子對(duì)菌體的影響,搖瓶發(fā)酵24 h后測(cè)定菌體濃度與乙醇酸產(chǎn)量。結(jié)果如圖4-a所示,從菌體的整體生長(zhǎng)情況而言,除了CuCl2·2H2O以外其他金屬離子的加入都明顯的有利于菌體的生長(zhǎng),有研究表明,細(xì)胞內(nèi)游離的銅離子可通過(guò)破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。在乙醇酸產(chǎn)量上,MnCl2·4H2O的添加對(duì)乙醇酸的產(chǎn)量稍有提高,達(dá)到1.4 g/L。因M9發(fā)酵培養(yǎng)基中本身含有MgSO4·7H2O、CaCl2,且研究表明[14-18],金屬離子如Mg2+、Mn2+、Zn2+是常見(jiàn)酶的輔因子,Mg2+是細(xì)胞壁形成的重要金屬離子;Ca2+是菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶所必需的物質(zhì);Mn2+在一定濃度下可以促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng),故對(duì)ZnCl2、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnCl2·4H2O 4種金屬離子進(jìn)行濃度優(yōu)化,結(jié)果如圖4-b～圖4-e所示,ZnCl2、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnCl2·4H2O 4種金屬離子分別在0.16、12.3、5.5、0.05 mg/L下對(duì)乙醇酸的產(chǎn)量提高最明顯,分別達(dá)到1.4、1.39、1.47、1.43 g/L,且金屬離子濃度大于上述濃度時(shí),乙醇酸產(chǎn)量有明顯下降,所以確定上述濃度為各金屬離子最佳濃度。

a-金屬離子種類;b-CaCl2質(zhì)量濃度;c-MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度;d-MnCl2·4H2O質(zhì)量濃度;e-ZnCl2質(zhì)量濃度圖4 金屬離子對(duì)工程大腸桿菌發(fā)酵乙醇酸的影響Fig.4 Effect of metal ions on fermentation of glycolic acid by engineering E. coli

2.2.2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

PB實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表1所示,方差分析結(jié)果如表2所示,模型達(dá)到顯著水平(P<0.05),篩選出實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)乙醇酸產(chǎn)量影響顯著的因素依次為X1(Na2HPO4),X2(玉米芯水解液)。

表1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 PB experimental results

表2 PB實(shí)驗(yàn)方差分析Table 2 PB analysis of variance

2.2.3 Central Composite Design實(shí)驗(yàn)

CCD實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果、方差分析如表3和表4所示,P模型<0.01,P失擬項(xiàng)>0.05,說(shuō)明該模型有較高擬合度。對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析可得二次多項(xiàng)式方程:GA=3.73+0.23A+0.87B-0.01C-(3.00E-03)AB+0.02AC+0.04BC-0.03A2-0.03B2+0.04C2。該方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.958 1,說(shuō)明此模型選擇正確。

表3 CCD實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 CCD experimental results

根據(jù)回歸方程,交互影響的等高線圖和三維響應(yīng)面圖分析結(jié)果,得到3種成分最佳配比為:玉米芯水解液13 g/L,NH3·H2O 0.78 g/L,Na2HPO425.45 g/L,乙醇酸產(chǎn)量預(yù)測(cè)值為4.85 g/L。結(jié)合預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn),結(jié)果如圖5-a所示,乙醇酸產(chǎn)量可達(dá)(4.77±0.12) g/L,接近預(yù)測(cè)值,說(shuō)明模型與實(shí)際情況擬合較好。

表4 CCD實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 CCD experimental variance analysis

2.3 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵驗(yàn)證

篩選的Mgly71工程菌株在M9發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化培養(yǎng)基中的發(fā)酵結(jié)果如圖5-b和圖5-c所示,乙醇酸產(chǎn)量和菌體濃度基本呈生長(zhǎng)偶聯(lián)趨勢(shì)。培養(yǎng)基優(yōu)化前后乙醇酸的最高產(chǎn)量分別為30、42 g/L,乙醇酸產(chǎn)量提高了40%;菌體濃度(OD600)最高分別為15.8、22,得到了大幅提升。其主要原因可能在于根據(jù)蛋白胨中總氮含量更高但氨態(tài)氮含量稍低的特點(diǎn),找到了合適的氮源比例能,讓兩者在乙醇酸生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)揮更好的作用,顯著提高了菌體濃度。同時(shí),優(yōu)化后培養(yǎng)基中額外添加的的玉米芯水解液、金屬離子在菌體細(xì)胞生長(zhǎng)、酶合成等方面提供了必要元素[15-18],最終乙醇酸產(chǎn)量得到明顯的提高。

2.4 乙醇酸的分離純化

2.4.1 活性炭純化乙醇酸

發(fā)酵結(jié)束后,采用高溫滅菌和離心對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理,玉米芯水解液,酵母粉和蛋白胨本身的顏色在經(jīng)過(guò)高溫滅菌后有所加深,故需要進(jìn)行脫色處理便于后續(xù)乙醇酸的分離純化?；钚蕴烤哂泻芎玫奈锢砗突瘜W(xué)吸附作用,常作為發(fā)酵液脫色劑,可以對(duì)乙醇酸發(fā)酵液進(jìn)行脫色、脫蛋白。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19],粉末狀活性炭脫色效果明顯優(yōu)于顆粒狀活性炭,故本研究采用粉末狀活性炭對(duì)預(yù)處理后的發(fā)酵液進(jìn)行研究,同時(shí)探究不同活性炭添加量、脫色溫度、脫色時(shí)間對(duì)脫色率和乙醇酸損失率的影響,結(jié)果如圖6所示。

a-活性炭添加量;b-脫色溫度;c-脫色時(shí)間圖6 不同脫色條件對(duì)脫色率、乙醇酸損失率的影響Fig.6 Effect of different conditions on decolorization rate and glycolic acid loss ratio

如圖6-a所示,隨著活性炭添加量的增加,脫色率和乙醇酸損失率均呈上升趨勢(shì)。當(dāng)活性炭添加量為9 g/100 mL時(shí),脫色率達(dá)最高96.7%;活性炭添加量至11 g/100 mL時(shí),脫色率不再增加(96.2%),反而乙醇酸損失率提高至10.8%;當(dāng)活性炭添加量為5 g/100 mL時(shí),乙醇酸損失率(6.7%)較低,而脫色率可達(dá)到78.3%。這是因?yàn)閱挝惑w積與色素分子碰撞的活性炭增多使色素被吸附的可能性增大,即“范德瓦爾斯力”效應(yīng)[20]?？紤]到活性炭對(duì)乙醇酸有一定吸附作用與工業(yè)應(yīng)用成本,確認(rèn)最佳活性炭添加量為5 g/100 mL。

如圖6-b所示,隨著溫度的升高,脫色率基本呈先升后降的趨勢(shì),當(dāng)脫色溫度為50 ℃時(shí),脫色率最高達(dá)88.5%,當(dāng)溫度繼續(xù)升高,脫色率反而呈下降趨勢(shì),這主要因?yàn)樵诘蜏胤秶鷥?nèi),隨著溫度升高,發(fā)酵液的流動(dòng)性增大,色素分子的熱運(yùn)動(dòng)加快,與活性炭接觸碰撞的幾率增大,且此時(shí)活性炭吸附作用大于解析作用,有利于吸附脫色;當(dāng)溫度繼續(xù)增大時(shí),分子熱運(yùn)動(dòng)繼續(xù)加快,被活性炭吸附上的色素又被解析下來(lái),解析作用占優(yōu)勢(shì)地位,造成脫色率下降[21]。此外在整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度范圍內(nèi),乙醇酸損失率變化極小,穩(wěn)定在7%以下,綜合考慮,確認(rèn)50 ℃為最佳脫色溫度。

如圖6-c所示,隨著脫色時(shí)間的增長(zhǎng),脫色率逐漸升高。當(dāng)脫色時(shí)間為2 h時(shí),脫色率為94%,且2 h之后脫色率趨于平穩(wěn)。這是由于隨著脫色時(shí)間的增長(zhǎng),當(dāng)體系中固定量的活性炭吸附逐漸達(dá)到飽和狀態(tài)后,吸附和解析過(guò)程處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),脫色率也趨于穩(wěn)定[22]。同時(shí)在脫色時(shí)間大于2 h之后,乙醇酸損失率逐漸從6.7%提高至8.6%。故綜合考慮,確認(rèn)2 h為最佳脫色時(shí)間。

2.4.2 沉淀法純化乙醇酸

在活性炭添加量為5 g/100 mL,脫色溫度為50 ℃,脫色時(shí)間為2 h的條件下對(duì)預(yù)處理過(guò)的發(fā)酵上清液進(jìn)行初步純化分離,得到脫色液。采用沉淀酸化法和減壓蒸發(fā)對(duì)脫色液純化、濃縮得到酸化溶液、脫鹽溶液、濃縮料液,經(jīng)過(guò)不同處理后的乙醇酸含量和得率見(jiàn)表5。

由表5可知,經(jīng)過(guò)活性炭預(yù)處理純化后,乙醇酸得率為95.32%;經(jīng)過(guò)硫酸酸化后的酸化溶液中乙醇酸得率為89.5%;最終真空濃縮得到乙醇酸濃縮液的得率為72.15%。將得到的濃縮乙醇酸料液進(jìn)行結(jié)晶,經(jīng)HPLC測(cè)定結(jié)果如圖7所示,所得乙醇酸樣品純度為99.3%。本研究初步探索發(fā)酵液中提取乙醇酸的條件,在后續(xù)研究中仍需要進(jìn)一步優(yōu)化。

表5 不同處理后乙醇酸含量和得率Table 5 Contents and yield of glycolate after different treatments

a-乙醇酸標(biāo)樣;b-乙醇酸晶體圖7 乙醇酸標(biāo)樣和Mgly71菌株發(fā)酵液純化 乙醇酸晶體的HPLC譜圖Fig.7 HPLC spectrum of glycolate and glycolate purified from fermentation liquid of recombinant E.coli Mgly71

3 結(jié)論

隨著發(fā)酵工業(yè)的不斷發(fā)展,降低發(fā)酵成本、提高生產(chǎn)效率成為了現(xiàn)代發(fā)酵領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法,首先對(duì)碳源、氮源、金屬離子等單因素進(jìn)行優(yōu)化,再通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)獲得了最佳培養(yǎng)基組成。實(shí)驗(yàn)表明采用最佳培養(yǎng)基:6.66 mg/L CaCl2,12 mg/L MgSO4·7H2O,0.13 mg/L ZnCl2,0.04 mg/L MnCl2·4H2O,4.5 g/L KH2PO4,13 g/L 玉米芯水解液,0.78 g/L NH3·H2O,1.5 g/L 酵母粉,8.5 g/L 胰蛋白胨,0.5 g/L NaCl,25.45 g/L Na2HPO4,搖瓶乙醇酸的產(chǎn)量提高至優(yōu)化前的3.58倍,5 L罐產(chǎn)量達(dá)到42 g/L。此外本研究以活性炭為脫色劑對(duì)乙醇酸發(fā)酵液進(jìn)行脫色,最適處理?xiàng)l件為活性炭添加量5 g/100 mL,脫色溫度50 ℃,脫色時(shí)間2 h,此時(shí)的脫色率為97.6%。經(jīng)沉淀法和減壓回收進(jìn)一步純化后,最終乙醇酸晶體純度達(dá)到99.3%,本研究為后續(xù)生物基乙醇酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。