燈盞花素調(diào)節(jié)lncRNA NEAT1/miR-9-5p/SLC26A2 軸抑制哮喘模型小鼠氣道炎癥

王香英 魏金鳳 田小輝 盛美玲 許如菊

哮喘是目前最常見的氣道炎癥性疾病之一，據(jù)中國肺健康研究報告（CPH）顯示，我國成年人哮喘的總體患病率為4.2%[1]。燈盞花素是從傳統(tǒng)中草藥燈盞花中提取的類黃酮物質(zhì)[2]，能有效抑制哮喘而且無顯著毒副作用[3]，在過往研究中燈盞花素也被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)多種疾病的炎性環(huán)境[4]。本研究旨在研究燈盞花素對哮喘小鼠氣道炎癥反應的影響，并探討相關(guān)分子機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8 周雄性C57BL/6J 小鼠15 只，體質(zhì)量（20±2）g，購買并飼養(yǎng)于杭州醫(yī)學院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2019-0011。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃，相對濕度45%～55%，12 h 明暗交替環(huán)境下，自由獲取食物和水。動物護理和實驗按照浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理委員會批準的協(xié)議進行操作（倫理批號：ZJCLA-IACUC-20040152）。

1.2 試 劑 燈盞花素購于昆明龍津藥業(yè)股份有限公司（批號HB20190601）。NEAT1 熒光探針及Fluorescent in situ Hybridization 試劑盒（批號C10910）購自廣州RiboRio 公司。MiniBEST 通用RNA 提取試劑盒（批號9767）、PrimeScript RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號RR036Q）、熒光定量PCR SYBR Premix Ex Taq（批號RR820B）購自日本Takara 公司。miRNA first-strand cDNA synthesis super-mix試劑盒（批號AT351-01）購自北京全式金公司。BCA蛋白檢測試劑盒（批號A53225）、兔抗SLC26A2 一抗（批號PA5-110385）及氫氧化鋁（批號21645-51-2）購自美國ThermoFisher Scientific 公司。上樣緩沖液（批號P0015L）購自上海Beyotime Biotechnology 公司。白介素（IL）-5（批號EK0408）、IL-13（批號EK0425）、IL-17（批號EK0431）和人干擾素-γ（INFγ）（批號EK0375）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒購自廣州BOSTER Technology 公司。Anti-Ovalbumin IgE（mouse）ELISA Kit（批號500840）購自美國Cayman Chemical 公司。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號G1120PI3K）及PBS 緩沖液（批號P1022）均購自北京索萊寶公司。OVA（批號138831-86-4）購自美國Sigma-Aldrich 公司。兔抗SLC26A2（批號ab308625）和GAPDH 一抗（批號ab9485）及異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的二抗IgG（批號ab6717）均購自英國abcam 公司。合成引物購自中國生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要儀器 酶標儀（型號：VarioskanTMLUX）購自上海Thermo Labsystems 公司。顯微鏡（型號：AX10 imager A2）購自德國Carl Zeiss MicroImaging公司。蛋白電泳及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（型號：Bio-Rad 1658033）購自美國伯樂公司。多重實時熒光定量PCR 儀（型號：Bio-Rad CFX384）、ECL 顯影儀（型號：ChemiDoc XRS+System）購自美國伯樂公司公司。

1.4 方 法

1.4.1 哮喘模型小鼠構(gòu)建及藥物處理 按照隨機數(shù)字表法，將小鼠隨機數(shù)字表法分為三組：PBS 組（對照組）、OVA 組（哮喘模型組）、燈盞花素藥物處理OVA 組（燈盞花素組），每組5 只。模型構(gòu)建[5]：哮喘模型組及燈盞花素組小鼠分別在0、7、14 d 腹腔注射20 μg OVA 并加0.5 mg 氫氧化鋁初步致敏。在第21 天開始鼻內(nèi)滴飼40 μg OVA 刺激哮喘，每周3 次，持續(xù)6 周。給藥方案：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1次，連續(xù)7 d；對照組及哮喘模型組小鼠則使用等體積0.9%生理鹽水進行灌胃處理。末次給藥24 h 后，脫頸處死小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）以及肺組織以備后續(xù)實驗。

1.4.2 肺組織HE 染色以及PAS 染色 在對各組動物模型處理48 h 后收集小鼠左側(cè)肺葉組織。用HE染色測定組織差異浸潤細胞數(shù)。炎性浸潤細胞根據(jù)浸潤程度分別用1、2、3、4 分進行評分[6]。用PAS 染色測定組織中杯狀細胞的分布和數(shù)量。根據(jù)氣道上皮中杯狀細胞的百分比，使用改良的五點評分系統(tǒng)對杯狀細胞增生程度進行量化：0 級（無杯狀細胞）、1級（＜25%）、2 級（25%～50%）、3 級（51%～75%）和4 級（＞75%）[7]。

1.4.3 ELISA 實驗 各組小鼠動物模型處理48 h 后收集BALF。使用商品化試劑盒測定BALF 中IL-5、IL-13、IL-17 和IFN-γ 的水平。血清OVA 特異性IgE 使用Anti-Ovalbumin IgE（mouse）ELISA kit 進行檢測。使用酶標儀在450 nm 處檢測吸光度。

1.4.4 BALF 細胞學檢測 使用Wright-Giemsa 染液對細胞進行染色并在顯微鏡下對細胞進行計數(shù)。針對于總細胞數(shù)、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，在計數(shù)時從顯微鏡下選擇5 個視野進行計數(shù)。

1.4.5 熒光原位雜交實驗 針對于NEAT1 在肺組織中的熒光原位雜交實驗，cy3-標記的NEAT1 探針被合成后。根據(jù)Fluorescent in situ Hybridization Kit的說明書進行RNA 熒光原位雜交實驗。使用AX10 imager A2 顯微鏡進行可視化。

1.4.6 實時熒光定量PCR 實驗（qRT-PCR） 我們使用MiniBEST 通用RNA 提取試劑盒提取總RNA。使用PrimeScript RT MasterMxi 試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。進一步地，miRNA 的反轉(zhuǎn)錄cDNA 使用miRNA first-strand cDNA synthesis super-mix 試劑盒。使用SYBR Premix Ex Taq 試劑進行qRT-PCR 實驗。使用Applied Biosystems 7900 real-time PCR system進行檢測。SLC26A2 和NEAT1 的表達水平以GAPDH 作為內(nèi)參。miR-9-5p 的表達水平以U6 作為內(nèi)參。SLC26A2 引物序列：F：5'-TTCCTGTCTTTGCTCCTCCGTAAG-3'；R：5'-GTTCACTTCCAATCACTGCTGCTC-3'。NEAT1 引物序列：F：5'-AAGCAGATGGCACCAGGAGATATG -3'；R：5' -TTCACTGTGTAGGCGTCAACCG-3'。MiR-9-5p 引物序列：F：5'-GAGCGCGTCTTTGGTTATCTAGC -3'；R：5' -ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3'。GAPDH 引物序列：F：5'-GGCAAATTCAACGGCACAGTCAAG-3'；R：5'-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATGG-3'。U6 的引物為：F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA -3'；R：5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。使用2-ΔΔCt方法計算相對表達量結(jié)果。

1.4.7 免疫印跡分析（Western blot） 實驗 對于Western blot 實驗，使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)的濃度。將一定量的蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸15 min 在SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用一抗檢測印跡。一抗包括SLC26A2 和GAPDH。4 ℃過夜孵育一抗，二抗孵育90 min。通過化學發(fā)光法（ECL）檢測蛋白表達，以GAPDH 為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用Graphpad Prism 8.0（GraphPad Software，美國）軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，每組實驗重復3 次，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組或多組間比較采用獨立樣本t 檢驗或單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠BALF 中炎性細胞的數(shù)量 與對照組小鼠比較，哮喘模型組BALF 中炎性總細胞數(shù)、中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)量均顯著升高（P＜0.01）。而飼喂燈盞花素則會抑制哮喘模型小鼠上述炎性細胞數(shù)量（P＜0.05 或P＜0.01），見表1。

表1 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠BALF 中炎性細胞的數(shù)量（×104/mL，±s）

表1 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠BALF 中炎性細胞的數(shù)量（×104/mL，±s）

注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水；BALF 為支氣管肺泡灌洗液；與對照組比較，aP＜0.01；與哮喘模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別對照組哮喘模型組燈盞花素組鼠數(shù)555炎性總細胞17.71±3.14 68.32±7.25a 52.10±7.59b中性粒細胞0.72±0.15 5.50±0.58a 4.21±0.54b巨噬細胞2.70±0.61 13.02±1.04a 3.61±0.28c淋巴細胞4.13±0.53 23.07±2.90a 9.52±1.23c嗜酸性粒細胞1.63±0.22 22.13±2.21a 8.87±1.33c

2.2 燈盞花素調(diào)節(jié)哮喘模型小鼠肺組織形態(tài) HE結(jié)果顯示，與對照組比較，哮喘模型組小鼠組織的上皮細胞明顯脫落、平滑肌增生、氣道壁增厚而炎性細胞浸潤程度顯著升高（P＜0.01）。與哮喘模型組比較，燈盞花素組小鼠的組織平滑肌增生及炎性細胞浸潤程度均得到改善（P＜0.01）。PAS 結(jié)果顯示，與對照組比較，哮喘模型組小鼠組織中氣道黏液分泌增多，杯狀細胞增生，PAS 評分升高（P＜0.01）。相對于哮喘模型組，燈盞花素組小鼠組織氣道黏液減少，杯狀細胞減少，PAS 評分降低（P＜0.01）。見圖1，表2。

圖1 各組小鼠肺組織形態(tài)觀察及炎性細胞浸潤評估（HE 染色，PAS 染色，×400）

表2 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠組織學評分（分±s）

表2 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠組織學評分（分±s）

注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水；PAS 為過碘酸雪夫染色；與對照組比較，aP＜0.01；與哮喘模型組比較，bP＜0.01

組別對照組哮喘模型組燈盞花素組鼠數(shù)555炎性細胞浸潤程度評分0.26±0.04 2.49±0.25a 1.46±0.15b PAS 評分0.26±0.08 2.24±0.16a 0.58±0.07b

2.3 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠血清IgE 水平并調(diào)節(jié)BALF 炎癥因子水平 與對照組比較，哮喘模型組小鼠的血清IgE 及BALF 中IL-5、IL-13、IL-17 水平均顯著提高（P＜0.05 或P＜0.01），而IFN-γ 水平顯著下降（P＜0.01）。燈盞花素則會顯著抑制血清IgE 及BALF 中IL-5、IL-13、IL-17 水平而促進IFN-γ 水平（P＜0.05 或P＜0.01），見表3。

表3 燈盞花素對哮喘模型小鼠血清IgE 和BALF 中炎癥因子水平的影響（±s）

表3 燈盞花素對哮喘模型小鼠血清IgE 和BALF 中炎癥因子水平的影響（±s）

注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水；IL-5 為白細胞介素5；IL-13 為白細胞介素13；IL-17 為白細胞介素17；INF-γ 為干擾素γ；與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與哮喘模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別對照組哮喘模型組燈盞花素組鼠數(shù)555血清IgE（IU/mL）1.02±0.08 3.52±0.32b 1.83±0.14d IL-5（pg/mL）54.56±3.35 154.48±9.27b 78.25±4.44d IL-13（pg/mL）79.18±3.34 96.86±6.45a 59.34±5.32d IL-17（pg/mL）73.32±4.15 185.24±7.24b 125.60±5.88d INF-γ（pg/mL）84.76±2.91 48.46±3.81b 65.48±4.49c

2.4 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠肺組織中l(wèi)ncRNANEAT1 的表達 使用qRT-PCR 和熒光原位雜交實驗檢測了各組小鼠肺組織中NEAT1 的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組小鼠肺組織中NEAT1 的表達顯著上調(diào)（P＜0.01），而燈盞花素則顯著抑制哮喘模型小鼠肺組織中NEAT1 的表達（P＜0.01）。見表4，圖2。

圖2 燈盞花素抑制哮喘模型小鼠肺組織中l(wèi)ncRNA-NEAT1 的表達（熒光原位雜交，×200）

表4 燈盞花素對哮喘模型小鼠肺組織lncRNA-NEAT1表達的影響（±s）

表4 燈盞花素對哮喘模型小鼠肺組織lncRNA-NEAT1表達的影響（±s）

注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水；與對照組比較，aP＜0.01；與哮喘模型組比較，bP＜0.01

組別對照組哮喘模型組燈盞花素組鼠數(shù)555 NEAT1 相對表達量1.00±0.15 3.96±0.32a 1.82±0.28b

2.5 燈盞花素促進哮喘模型小鼠肺組織miR-9-5p表達并抑制SLC26A2 表達 通過表達量檢測發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組小鼠肺組織中miR-9-5p 的表達相對于對照組顯著下調(diào)（P＜0.01），而燈盞花素則會促進哮喘肺組織中miR-9-5p 的表達（P＜0.01）。SLC26A2 的表達趨勢則與miR-9-5p 相反，其在哮喘模型組小鼠中高表達而在燈盞花素組小鼠肺組織中顯著低表達（P＜0.05 或P＜0.01）。見表5-6、圖3。

圖3 燈盞花素對哮喘小鼠肺組織SLC26A2 蛋白表達的影響注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水

表5 燈盞花素對哮喘模型小鼠肺組織中miR-9-5p和SLC26A2 mRNA 表達的影響（±s）

表5 燈盞花素對哮喘模型小鼠肺組織中miR-9-5p和SLC26A2 mRNA 表達的影響（±s）

注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水；與對照組比較，aP＜0.01；與哮喘模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別對照組哮喘模型組燈盞花素組鼠數(shù)555 miR-9-5p 相對表達量1.00±0.09 0.48±0.07a 0.67±0.06b SLC26A2 mRNA 相對表達量1.00±0.08 3.91±0.32a 2.00±0.23c

表6 燈盞花素對哮喘模型小鼠肺組織中SLC26A2 蛋白表達的影響（±s）

表6 燈盞花素對哮喘模型小鼠肺組織中SLC26A2 蛋白表達的影響（±s）

注：燈盞花素組小鼠在哮喘模型構(gòu)建完成后使用10 mg/kg 燈盞花進行灌胃處理，每天1 次，連續(xù)7 d；對照組和哮喘模型組小鼠灌胃等量生理鹽水；與對照組比較，aP＜0.01；與哮喘模型組比較，bP＜0.01

組別對照組哮喘模型組燈盞花素組鼠數(shù)555 SLC26A2 蛋白相對表達量0.87±0.09 1.50±0.10a 1.08±0.12b

3 討 論

目前多種衍生藥物被證實對于治療哮喘小鼠氣道炎癥反應具有良好的作用。例如傳統(tǒng)中藥劍花提取物被發(fā)現(xiàn)可以抑制過敏性哮喘小鼠模型的氣道炎癥反應[8]；人參皂苷Rg3 也被發(fā)現(xiàn)對于改善哮喘小鼠氣道炎癥及氧化應激反應具有很好的效果[9]。作為從燈盞花提取物的關(guān)鍵成分，燈盞花素已被證實對于呼吸性相關(guān)疾病的治療有一定效果[10]。在一項燈盞花素治療支氣管哮喘的臨床研究中，研究者也發(fā)現(xiàn)使用燈盞花素針粉劑對患者進行治療不僅有明顯的療效而且沒有明顯的副作用[11]。本研究從氣道炎癥反應出發(fā)明確燈盞花素對哮喘模型小鼠氣道炎癥的抑制作用及其分子機制。

在哮喘發(fā)展的過程中炎癥因子及炎癥細胞的變化是反映疾病進展的重要指標之一。為了深入研究燈盞花素對哮喘發(fā)展過程的影響，本研究首先建立了OVA 誘導的哮喘模型小鼠，隨后從多個指標角度進探索。研究結(jié)果證明，燈盞花素處理后小鼠BALF中的炎性細胞總數(shù)、中性粒細胞數(shù)、巨噬細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)均顯著下降；肺組織中炎性細胞浸潤水平和PAS 評分均顯著下降；血清IgE以及BALF 中炎性因子的表達均顯著降低。這些結(jié)果表明燈盞花素對哮喘發(fā)作過程中小鼠氣道炎癥反應具有一定的抑制作用。燈盞花素的主要成分黃芪素被證明可以抑制肺纖維化發(fā)生中核因子κB（NFκB）/NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）介導的炎癥反應[12]。在肝損傷及心肌損傷發(fā)生過程中，燈盞花素也會抑制其炎癥反應的產(chǎn)生并促進炎性細胞的凋亡[4，13]。而本研究的結(jié)果進一步在哮喘模型上證明了燈盞花素對于氣道炎癥反應的抑制作用。

在本團隊既往的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1/miR-9-5p/SLC26A2 軸在體外細胞模型中會調(diào)節(jié)哮喘發(fā)生中炎癥相關(guān)因子的表達[14]。在這一信號軸中NEAT1 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)節(jié)多種miRNA 進而促進氣道平滑肌細胞這一哮喘模式細胞的炎癥反應及炎性因子的水平[15-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，燈盞花素在其他疾病中會抑制NEAT1 的表達[17]。為了探究燈盞花素在調(diào)節(jié)哮喘氣道炎癥過程中是否會改變這一信號軸的表達，我們研究也在小鼠肺組織中進行了表達檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，燈盞花素會顯著抑制小鼠肺組織NEAT1和SLC26A2 的表達，而miR-9-5p 則會顯著上調(diào)。該結(jié)果從分子機制角度闡釋了燈盞花素可能通過調(diào)節(jié)lncRNA NEAT1/miR-9-5p/SLC26A2 信號軸抑制哮喘氣道炎癥。綜上所述，本研究基于OVA誘導的哮喘小鼠模型明確了燈盞花素給藥后對小鼠氣道炎癥的影響及潛在的分子調(diào)控信號軸。研究結(jié)果表明，燈盞花素能抑制炎性因子的水平及炎癥反應的發(fā)展。在分子機制方面，燈盞花素能顯著調(diào)節(jié)與炎癥因子相關(guān)的 lncRNA NEAT1/miR -9 -5p/SLC26A2 信號軸基因的表達。與此同時，本研究也存在一定的不足。首先，關(guān)于燈盞花素調(diào)節(jié)哮喘這些炎性癥狀其他的分子機制還需要通過多種手段進行深入研究。其次，關(guān)于燈盞花素與lnc RNA NEAT1/miR-9-5p/SLC26A2 信號軸在哮喘小鼠體內(nèi)具體的分子互作機制也需要在未來的研究中進行更多的指標檢測及實驗探索。