鱉甲煎丸調(diào)控miR-140 對(duì)肝癌干細(xì)胞致瘤性及干性的影響

譚欽文，徐 健，朱榮火，杜沅沁，吳穎升，彭嘉敏，梁向娟，農(nóng)耀斌，黃晶晶

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530023；3.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530023）

肝癌是全球面臨的重大健康挑戰(zhàn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2020 年，在全球癌癥死亡率占比中，肝癌死亡率為8.3%，是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。早期肝癌主要治療手段為手術(shù)切除、TACE、消融以及肝移植等，中晚期則是以放化療為主，結(jié)合手術(shù)及對(duì)癥支持治療[2]。隨著手術(shù)方式及化療藥物的不斷革新，肝癌患者的生存率及生活質(zhì)量得到一定的改善，但治療后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及藥物的耐藥性仍是需要迫切解決的問題。

microRNA（miRNA）是一種小型非編碼RNA，其表達(dá)與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等功能息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[3]，microRNA 140（miR-140）屬于抑癌基因，在肝癌組織中被發(fā)現(xiàn)是一種下調(diào)的miRNA。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新以及產(chǎn)生出具有有限分裂和分化能力的腫瘤細(xì)胞[4]。肝癌是由多種細(xì)胞組成，其中也包括肝癌干細(xì)胞。鱉甲煎丸出自東漢醫(yī)家張仲景所著《金匱要略》，即有活血化瘀、解毒散結(jié)、益氣養(yǎng)血之功，也具備寒熱并用、攻補(bǔ)兼施的特點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，鱉甲煎丸所具有的 “祛瘀”及“扶正”等功效，能通利脈道，改善肝臟微環(huán)境，為干細(xì)胞歸巢以及歸巢后提供良好環(huán)境?；诖?，項(xiàng)目組提出鱉甲煎丸可能通過上調(diào)miR-140 的表達(dá)，抑制肝癌干細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。進(jìn)一步探索中醫(yī)藥對(duì)肝癌的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率以及耐藥性的積極影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞珠（Huh7）購自iCell（中國上海）。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 項(xiàng)目組采用鱉甲煎丸中成藥（武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：202760），鱉甲煎丸：鱉甲、烏扇、黃芩、柴胡、鼠婦、干姜、大黃、芍藥、桂枝、葶藶子、石葦、厚樸 、牡丹皮、瞿麥、紫葳、半夏、人參、土鱉蟲、阿膠、蜂窠、赤硝、蜣螂、桃仁 。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 原有雄性BALB/c 裸鼠20 只，在種植皮下瘤體時(shí)死亡8只，現(xiàn)存活12只，體質(zhì)量（18±2）g，由Charles River Labs（北京，中國）提供。實(shí)驗(yàn)均按照《機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理與使用委員會(huì)（IACUC）指南》進(jìn)行，并經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（審查證書編號(hào)：DW20170528-39）。

1.4 主要試劑及儀器

1.4.1 主要試劑 流式FITC anti-human CD24 抗體（貨號(hào)：311103，Biolegend），流式APC anti-human CD133抗體（貨號(hào)：372805，Biolegend），BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：AS1086，ASPEN），磷酸化蛋白酶抑制劑（貨號(hào)：AS1008，ASPEN），RIPA 總蛋白裂解液（貨號(hào)：AS1004，ASPEN），CD133 抗體（貨號(hào)：66666-1-Ig，三鷹），CD24 抗體（貨號(hào)：18330-1-AP，三鷹），EpCAM 抗體（貨號(hào)：21050-1-AP，三鷹），AFP 抗體（貨號(hào)：14550-1-AP，三鷹），蛋白Marker（貨號(hào)：26616，Thermo），EntiLink? 1st Strand cDNA（貨號(hào)：EQ003，ELK Biotechnology），EnTurbo? SYBR Green PCR SuperMix（貨號(hào)：EQ001，ELK Biotechnology）。

1.4.2 主要儀器 包埋機(jī)（型號(hào)：JB-L5，武漢俊杰電子有限公司），脫水機(jī)（型號(hào)：JK-12J /JT-12P，武漢俊杰電子有限公司），病理切片機(jī)（型號(hào)：RM2016，上海徠卡儀器有限公司），臺(tái)式離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16c，上海安亭科學(xué)儀器廠），熒光定量PCR 儀（型號(hào)：QuantStudio 6 Flex System，Life Technologies），酶標(biāo)儀（型號(hào)：DR-200Bs，Diatek 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)及分選

2.1.1 肝癌干細(xì)胞的培養(yǎng) 將Huh7 細(xì)胞在37℃下添加10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM 培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)并分裝。

2.1.2 肝癌干細(xì)胞的分選 收集5×106個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到FACS BD 管中，每管2 mL。然后在每根試管中加入80 μL FACS 分選緩沖液進(jìn)行細(xì)胞懸浮，加入20 μL Fc R 塊緩沖液孵育10 min。細(xì)胞在4℃下與熒光抗體孵育30 min，然后在2 mL FACS 分選緩沖液中洗滌。加入2 mL FACS 分選緩沖液后，在流式細(xì)胞儀（BD，CA，USA）中進(jìn)行細(xì)胞分選。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 給藥前處理：將鱉甲煎丸中成藥研磨成粉，稱取44 g 鱉甲煎丸溶于400 mL 生理鹽水中，配置成0.11 g/mL，4℃保存?zhèn)溆?。BALB/c 裸鼠12 只分為4 組，A 組和B 組分別先予肝癌干細(xì)胞皮下成瘤，第3周時(shí)予鱉甲煎丸或生理鹽水灌胃，即A組：肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃，B 組：肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃（2.2 mg/kg/d，為成人劑量2 倍，每日1 次，共2 周）。C 組和D 組分別先予miR-140 過表達(dá)或干擾慢病毒干細(xì)胞，然后皮下成瘤，第3 周時(shí)予鱉甲煎丸或生理鹽水灌胃，即C 組：miR-140 過表達(dá)慢病毒肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃，D 組：miR-140 干擾慢病毒肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃（2.2 mg/kg/d，為成人劑量2 倍，每日1 次，共2 周）。灌藥時(shí)間及給藥劑量參考文獻(xiàn)[6-7]執(zhí)行。

2.3 裸鼠皮下成瘤 BALB/c小鼠皮膚用酒精消毒后，右側(cè)腋下皮下注射100 μL 的肝癌干細(xì)胞懸液，每天觀察小鼠的生存狀態(tài)，如精神，食欲等。到第5 周后，處死小鼠，取出瘤體組織，并測(cè)量其體積大小。腫瘤體積計(jì)算方法，腫瘤體積計(jì)算公式為：長徑×短徑的平方/2。

2.4 觀察瘤體組織病理學(xué)變化 將用組織4%多聚甲醛固定24 h，按程序經(jīng)酒精、二甲苯和石蠟之后，進(jìn)行脫水浸蠟。石蠟包埋組織連續(xù)切成厚度為2 ～3 μm的切片。用蘇木精和伊紅對(duì)切片進(jìn)行染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)。

2.5 檢測(cè)肝癌組織中miR-140 及CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 水平 按照試劑盒說明書的方法。RT-PCR 檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)，EpCAM：正義5-GTG TGTGAACACTGCTGGGGT-3，反義5-CTGAAGTGCA GTCCGCAAACT-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為151bp。AFP：正義5-AGGCTGTACTCATCATTAAACT -3，反義5-ATAT TGTCCTGGCA TTTCG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為294 bp。GAPDH：正義5-CATCATCCCTGCCTCTACTGG-3，反義5-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為259bp。CD133：正義5-GCACTCTATACCAAAGC GTCAAG-3，反義5-GCACGATGCCACTTTCTCAC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為227bp。CD24：正義5-ACCCACGCAGAT TTATTCCAG-3，反義5-CACGAAGAGACTGGCTGTT GAC-3，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為153 bp。miR-140：正義5-GG GTAGAACCACGGCTCAAC-3，反義5-CTCAACTGGT GTCGTGGAGTC-3。U6：正義5-CTCGCTTCGGCAGC ACAT-3， 反 義5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3。使用Trizol TRIpure 總RNA 提取試劑從組織中提取總RNA。EntiLink?應(yīng)用于第一鏈cDNA 合成試劑盒進(jìn) 行cDNA 逆 轉(zhuǎn) 錄。用EnTurbo?SYBR Green PCR SuperMix 試劑盒對(duì)合成的基因進(jìn)行擴(kuò)增。檢測(cè)CD24、CD133 和EpCAM、GAPDH、miR-140 的基因表達(dá)。GAPDH、U6 則作為內(nèi)部對(duì)照。用2-ΔΔCT法測(cè)定基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.6 檢測(cè)肝癌組織中miR-140 及CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白水平 使用RIPA 總蛋白裂解緩沖液從肝組織中提取蛋白質(zhì)裂解物。用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定。蛋白樣品用10%SDS-PAGE 分離，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。然后，將轉(zhuǎn)膜完成后的膜加入封閉液，在室溫下封閉1 h。除去封閉液，加入一抗稀釋液，將稀釋好的一抗4℃過夜。隨后回收已稀釋的一抗，并用TBST 洗，反復(fù)3 次，每次5 min。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0 軟件。數(shù)據(jù)表示形式：正態(tài)計(jì)量資料以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，非正態(tài)計(jì)資料“以中位數(shù)和四分位數(shù)（P25，P75）”表示計(jì)量資料，先行正態(tài)分布檢驗(yàn)，如各組數(shù)據(jù)全部服從正態(tài)分布，用單因素方差分析，否則用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。多組間均值比較采用單因素方差分析，先行Levene Statistic方差齊性檢驗(yàn)。方差齊性采用F 檢驗(yàn)進(jìn)行總均值比較，LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，方差不齊改用克魯斯卡爾-沃利斯單因素分析ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。

3 結(jié)果

3.1 流式分選肝癌干細(xì)胞 Huh7 細(xì)胞培養(yǎng)8 天后形成大球體（見圖1）。經(jīng)流式細(xì)胞分選術(shù)分選出球形細(xì)胞和Huh7 細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133 和CD24，并測(cè)得其在球形細(xì)胞中表達(dá)率為40.3%（見圖2A）以及Huh7細(xì)胞中小于5%（見圖2B，圖2C）。

圖1 肝癌干細(xì)胞成球（×100）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

3.2 鱉甲煎丸及miR-140 不同表達(dá)對(duì)裸鼠瘤體體積的影響 根據(jù)測(cè)量及計(jì)算結(jié)果，A 組的平均瘤體體積大于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。C 組平均瘤體體積小于A 組（P＜0.05），D 組平均瘤體體積大于B 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組間數(shù)值對(duì)比見表1。實(shí)驗(yàn)中的裸鼠腫瘤圖片見圖3。

表1 裸鼠瘤體平均體積記錄（± s）

表1 裸鼠瘤體平均體積記錄（± s）

注：A 為干細(xì)胞成瘤+生理鹽水灌胃組，B 為干細(xì)胞成瘤+鱉甲煎丸灌胃，C 為miR-140 過表達(dá)慢病毒干細(xì)胞+生理鹽水灌胃組，D 為miR-140 干擾慢病毒干細(xì)胞+鱉甲煎丸灌胃組。與A 組比較，# P ＜0.05；與B 組比較，△P ＜0.05

組別 體積/cm3 A 0.99±0.20 B 0.47±0.49#0.40±0.11#D 0.89±0.18△C

圖3 實(shí)驗(yàn)室中裸鼠瘤體圖片（×1）

3.3 蘇木精-伊紅（HE）染色結(jié)果 將取皮下的瘤組織作常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行肝組織病理學(xué)觀察。項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)為各組均可見彌漫成片的腫瘤細(xì)胞，間質(zhì)較少，腫瘤細(xì)胞多呈圓形，核大，染色質(zhì)粗，深染，核漿比高，可見核分裂。表明肝癌干細(xì)胞皮下成瘤形成，腫瘤細(xì)胞呈惡性。見圖4。

圖4 蘇木精-伊紅（HE）染色（×200）

3.4 鱉甲煎丸對(duì)瘤體中CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 表達(dá)及miR-140 表達(dá)的影響 對(duì)瘤體組織進(jìn)行PCR 檢測(cè)，在CD133、CD24、EpCAM、AFP的mRNA 表達(dá)上，A 組顯著高于B 組（P＜0.01），A 組 顯 著 高 于C 組（P＜0.01）。B 組 的CD24、EpCAM、AFP的mRNA的表達(dá)均低于D組（P＜0.05）。在miR-140 的mRNA 表達(dá)上，B 組miR-140 的基因表達(dá)顯著高于A 組。見表2。

表2 CD133、CD24、EpCAM、AFP、EpCAM、miR-140 的基因表達(dá)（± s）

表2 CD133、CD24、EpCAM、AFP、EpCAM、miR-140 的基因表達(dá)（± s）

注：組別詳情同表1，與A 組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與B 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 CD133 CD24 EpCAM AFP miR-140 A 1.07±0.07 1.02±0.07 1.21±0.22 1.02±0.07 1.10±0.35 B 0.50±0.06## 0.50±0.05## 0.61±0.06## 0.50±0.05## 6.05±0.80##0.16±0.55## 0.21±0.04## 0.33±0.03## 0.21±0.04## 14.48±1.15##D 0.65±0.95 0.66±0.05△ 0.84±0.06△ 0.66±0.05△ 2.82±0.40△C

3.5 鱉甲煎丸對(duì)瘤體中CD133、CD24、EpCAM、AFP的蛋白表達(dá)相對(duì)含量的影響 對(duì)瘤體組織進(jìn)行Western Bolt 檢測(cè)，在CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達(dá)上，A組高于B組（P＜0.05），A組高于C組（P＜0.05）。而B 組CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達(dá)均低于D 組（P＜0.05）。見表3 及圖5。

表3 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達(dá)相對(duì)含量（± s）

表3 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達(dá)相對(duì)含量（± s）

注：組別詳情同表2，與A 組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與B 組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 CD133 CD24 EpCAM AFP A 0.377±0.11 0.756±0.09 0.850±0.03 0.606±0.03 B 0.105±0.05# 0.233±0.02## 0.345±0.04## 0.133±0.02##C 0.066±0.02# 0.083±0.01## 0.147±0.05## 0.050±0.02##D 0.197±0.06 0.494±0.05△△0.513±0.05△ 0.285±0.03△△

圖5 CD133、CD24、EpCAM、AFP 的蛋白表達(dá)相對(duì)含量

4 討論

肝癌病機(jī)為寒熱錯(cuò)雜，虛實(shí)夾雜，早期以邪實(shí)為主，后期以正虛為主，兼有邪實(shí)。多項(xiàng)研究[8-9]表明，中醫(yī)藥對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、自噬、凋亡等均具有積極的作用，從而對(duì)肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。鱉甲煎丸出自《金匱要略》，全方共由23 味中藥組成，具有寒熱并用，攻補(bǔ)兼施，益氣養(yǎng)血、活血化瘀、解毒散結(jié)的功效。在古代常用于治療癥瘕、瘧母等疾病。研究[10-11]表明，鱉甲煎丸具有改善肝癌局部微環(huán)境，降低血管通透性，調(diào)節(jié)血管生成以及逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等多項(xiàng)作用，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤干細(xì)胞假說提出，腫瘤的形成與生長是由腫瘤中少量的腫瘤干細(xì)胞推動(dòng)的，這些干細(xì)胞具有自我更新、全能或多能分化、致瘤能力等特性。這些未分化的細(xì)胞使腫瘤組織具有較強(qiáng)的再生能力及耐藥性。肝臟是一個(gè)具有強(qiáng)大再生能力的器官，這種能力與肝臟干細(xì)胞密切相關(guān)。當(dāng)肝臟受到損害時(shí)，肝干細(xì)胞不對(duì)稱分裂失控而過度增生或產(chǎn)生基因突變，形成肝癌干細(xì)胞[12]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有藥物能精準(zhǔn)消除LCSCs，大部分治療只對(duì)分化的癌細(xì)胞起作用，而中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多途徑、多系統(tǒng)的特點(diǎn)，在預(yù)防肝癌復(fù)發(fā)方面有著積極的作用。因此，項(xiàng)目組積極探索中醫(yī)藥對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用，尋求靶向LCSCs 的治療方案。

miRNA 被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中處于表達(dá)下調(diào)的狀態(tài)，其異常表達(dá)與許多癌癥的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，其中也包括肝癌。研究發(fā)現(xiàn)，miR140-5P 是肝癌中的一個(gè)抑癌基因，也是肝癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物[13]。瘤體體積是實(shí)驗(yàn)中直觀反映腫瘤生長情況的一個(gè)指標(biāo)。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，通過比較裸鼠皮下瘤體大小，項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸灌胃組裸鼠瘤體平均體積明顯小于生理鹽水灌胃組。miR-140 過表達(dá)慢病毒肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃組裸鼠的平均瘤體體積小于肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+生理鹽水灌胃組。而miR-140 干擾慢病毒肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃組小鼠的平均瘤體體積小于肝癌干細(xì)胞皮下成瘤+鱉甲煎丸灌胃組。說明鱉甲煎丸灌胃以及上調(diào)miR-140 的表達(dá)均能抑制裸鼠皮下瘤體生長，而當(dāng)miR-140 的表達(dá)被抑制時(shí)，即使予鱉甲煎丸灌胃，但其瘤體體積依然大于單純予鱉甲煎丸灌胃。因此，進(jìn)一步推斷鱉甲煎丸對(duì)裸鼠皮下瘤體的生長具有抑制作用，其作用可能與miR-140 的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

目前，肝癌干細(xì)胞尚未找到特異性表面標(biāo)志物，但最常用的表面標(biāo)志物有CD133、CD44、CD24 以及EpCAM 等。這些表面標(biāo)志物表達(dá)的高低通常與肝癌干細(xì)胞干性的強(qiáng)弱相關(guān)。CD133 作為LCSC 標(biāo)記物的作用已在多種癌癥組織中得到證實(shí)。從Huh7、SMMC-7721、HepG2、Huh78 等肝癌細(xì)胞株中分離得到的CD133+細(xì)胞比CD133-細(xì)胞具有更強(qiáng)的集落形成能力、增殖活性以及致瘤性[14]。CD24 在肝癌干細(xì)胞中具有較強(qiáng)的表達(dá)，且其表達(dá)高低與肝癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的自我更新強(qiáng)弱呈正相關(guān)[15]。EpCAM 是LCSCs 最具代表性的標(biāo)志物，EpCAM 高表達(dá)的細(xì)胞表現(xiàn)出干細(xì)胞樣特征，包括自我更新和分化、高侵襲性以及致瘤性[16]。AFP 是胎兒肝臟中合成的一種胚胎蛋白質(zhì)，隨著胎兒的年齡增大，肝臟也逐漸發(fā)育成熟，AFP 逐漸接近成人水平。當(dāng)肝細(xì)胞癌變、增生或受損時(shí)，AFP 分泌增加，部分肝細(xì)胞恢復(fù)產(chǎn)生AFP的功能，使血清AFP水平升高，AFP 可作為診斷肝癌的重要指標(biāo)[17]。因此，在本研究中，根據(jù)肝癌干細(xì)胞常用的表面標(biāo)志物分選出表型表達(dá)較強(qiáng)的細(xì)胞，種植于裸鼠皮下2 周后，便可見瘤體生長，進(jìn)一步驗(yàn)證CD133、CD44、CD24 以及EpCAM 這些表面標(biāo)志物在肝癌干細(xì)胞鑒定中的重要作用。為了進(jìn)一步測(cè)定鱉甲煎丸對(duì)肝癌組織中的LCSCs干性的影響，對(duì)各組瘤體組織中CD133、CD24、EpCAM、AFP 的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)，對(duì) miR-140 的基因表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定，并進(jìn)行多組間比較。在對(duì)肝癌組織CD133、CD24、EpCAM、AFP 的mRNA 及蛋白表達(dá)的測(cè)定中，項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸灌胃組明顯小于生理鹽水灌胃組，說明鱉甲煎丸對(duì)LCSCs干性有一定的抑制作用。因此，進(jìn)一步推斷鱉甲煎丸能抑制LCSCs 的增殖與侵襲能力。在隨后對(duì)miR-140 的基因表達(dá)測(cè)定中，項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸灌胃組miR-140 的表達(dá)明顯大于生理鹽水灌胃組，進(jìn)一步驗(yàn)證了鱉甲煎丸抑制肝癌干細(xì)胞干性的表達(dá)可能與促進(jìn)miR-140 的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究初步探索了鱉甲煎丸對(duì)LCSCs致瘤性具有抑制作用。同時(shí)，鱉甲煎丸降低LCSCs 表面標(biāo)志物及AFP 的表達(dá)，抑制了LCSCs 的增殖、侵襲活動(dòng)，從而間接推斷鱉甲煎丸對(duì)肝癌的生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移可能具有干預(yù)效果，其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-140 的表達(dá)有關(guān)。