健脾化瘀解毒法對(duì)結(jié)腸癌裸鼠模型癌及癌旁組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 表達(dá)的影響研究

寧康文，簡小蘭， 曾普華，鄺婉婷，楊家翔，周婉雙，劉 偉，蘭東強(qiáng)

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 410006）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）作為一種全球性疾病，在我國是發(fā)病率很廣、死亡率極高的惡性腫瘤[1]。隨著新時(shí)期的到來，中國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率也逐年上升，在全國癌癥發(fā)病率和死亡率中分別排名第三及第四位[2]。而在大腸癌患者中，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其死亡的首要因素，據(jù)保守估計(jì)，對(duì)于早中期結(jié)直腸癌進(jìn)行了根治性切除，5%的I 期患者會(huì)復(fù)發(fā)，II 期患者的復(fù)發(fā)率為10%～20%，III 期患者的復(fù)發(fā)率為30%～45%[3]?，F(xiàn)下中醫(yī)藥抗腫瘤技術(shù)快速發(fā)展，中醫(yī)藥治療惡性腫瘤及抗復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移效果明顯。

“瘀”“毒”“虛”是名中醫(yī)蔣益蘭教授結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的腸癌基本病機(jī)，蔣教授認(rèn)為腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移主要責(zé)之于瘀毒未盡且正氣虧虛、脾土不足，并以健脾化瘀解毒法作為臨床辨治腸癌的主要治法[4]，其臨床療效及抗癌機(jī)制已在許多臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被驗(yàn)證。臨床研究發(fā)現(xiàn)健脾化瘀解毒法在防治結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了良好作用，它能拮抗腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，延長生存期，能穩(wěn)定瘤體，提高患者生活質(zhì)量[5-6]，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其還可以降低VEGF 表達(dá)，抑制腫瘤血管生成[7]。AKT/mTOR 是調(diào)節(jié)腫瘤生長、增殖的重要信號(hào)途徑，其異常激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)健脾化瘀解毒法能通過對(duì)mTOR 信號(hào)途徑的抑制而起到抗腫瘤的作用[9]，但其抗腫瘤機(jī)制研究仍有待進(jìn)一步深入探索，以及進(jìn)一步研究抗結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移不同治法中藥如何發(fā)揮作用。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了結(jié)腸癌裸鼠模型，拆分健脾化瘀解毒各治法干預(yù)，觀察各組對(duì)結(jié)腸癌裸鼠模型AKT、 mTOR、p-4EBP1 表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探索健脾化瘀解毒治法抗腸癌的可能作用機(jī)制，為其進(jìn)一步推廣提供論證。

1 材料

1.1 細(xì)胞系、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫的人類結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 細(xì)胞（TCHU99）。SPF 級(jí)裸鼠60 只，BALB/C-nu/nu，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，購于湖南長沙斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)：43004700026556）。本研究在SPF 環(huán)境下進(jìn)行，并經(jīng)過湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.2 主要試劑與儀器 培養(yǎng)基DMEM 購于Hyclone 公司。10%胎牛血清購于Biological Industries 公司（批號(hào)：1616316）。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自Thermo 公司（型號(hào)：HERAcell2401）。AKT（Y89， 批 號(hào) 為ab32505），mTOR（Y391，批號(hào)為ab32028），p-4EBP1（phospho T37，批號(hào)為ab75767，均從美國Abcam 公司購得。5-氟尿嘧啶（5-Fu）（規(guī)格10 mL：0.25 g，批號(hào)：6927924804023）購買于旭東海普，雷帕霉素購買于Calbiochem 公司。

1.3 中藥制備 健脾益氣組：人參10 g，薏苡仁30 g；化瘀解毒組：半枝蓮30 g，重樓10 g，莪術(shù)10 g，郁金15 g；健脾化瘀解毒組：人參15 g，薏苡仁30 g，半枝蓮30 g，重樓10 g，莪術(shù)10 g，郁金15 g。上述中藥飲片均于湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院門診中藥房購得，均屬于一級(jí)藥材，符合《中華人民共和國藥典》（2020 年版）規(guī)定。配制中藥煎劑，按照以上劑量配比，按處方用量，用10 倍的清水浸泡30 min，煎煮60 min，分離藥渣，儲(chǔ)存藥液。再加8 倍的清水浸泡30 min，煎煮60 min，分離藥渣，儲(chǔ)存藥液。將2次藥液混合均勻，濃縮至1.5 g/mL，過濾、除菌后，封于4 ℃冰箱冷藏。

2 方法

2.1 制備瘤源 以胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基為原料，體外培養(yǎng)HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞。HCT116 結(jié)腸癌細(xì)胞長至培養(yǎng)皿底80%～90%時(shí)，加入適量胰蛋白酶，2 ～3天換液1 次，3 ～4 d 傳代1 次。取處于對(duì)數(shù)生長期且離心后的HCT116 細(xì)胞懸液，按照2×107/mL 的濃度，每只BALB/C-nu/nu 裸鼠右腋下注射0.1 mL（接種細(xì)胞數(shù)即2×106個(gè)），共注射10 只，觀察裸鼠腋下種植瘤生長，將長出直徑1cm 左右的實(shí)體瘤，斷頸處死小鼠后解剖提取其中的腫瘤組織，取腫瘤中心處生長良好的組織，作為原位移植瘤的瘤源，按照1 mm3大小剪碎組織備用。

2.2 建立裸鼠結(jié)腸癌模型 SPF 裸鼠在無菌環(huán)境（實(shí)室提前紫外線消毒滅菌2 h）下用10%的水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠。2 ～3 min 后在裸鼠腹部左下側(cè)2.5 cm 處切開腹腔， 尋找并暴露盲腸，用l mL 小針頭輕輕將盲結(jié)腸交界處漿膜刮破，稍有滲出血液，將1 mm3大小腫瘤碎塊種植于盲結(jié)腸交界處漿膜層，使用OB 膠黏貼。植入完成后，用3%碘酊消毒裸鼠腹腔，將盲腸送入腹腔，縫合。2 周后，裸鼠腹部均可用手觸及明顯腫塊，提示造模成功。

2.3 裸鼠分組與給藥 將造模成功的30 只裸鼠，隨機(jī)分為模型組、健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組和5-Fu 組，每組5 只。另取5 只未予任何處理的小鼠為空白對(duì)照組。模型組與空白組予每只0.2 mL 生理鹽水灌胃，1 天1 次，每周給藥5 天，持續(xù)4 周。中藥各組予15 g/kg （約每只0.2 mL）中藥液灌胃給藥，給藥結(jié)束后均予0.2 mL/只生理鹽水灌胃，頻次同模型組。雷帕霉素組行1 mg/kg（約0.02 mg）腹腔注射，5-Fu 組按人腹腔給藥550 mg/m2折算為每周3.7 mg（約0.15 mL），均為每周2 次，均予生理鹽水灌胃，次數(shù)與劑量同模型組。

2.4 取材 在最后一次給藥注射后，斷頸處死小鼠，無菌環(huán)境下解剖開腹，將瘤體完全剝除，并取適量的瘤旁組織?？瞻捉M取相應(yīng)部位結(jié)腸組織。

2.5 免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織AKT、mTOR、p-4EBP1的表達(dá) 應(yīng)用SP 二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，用已知的結(jié)腸癌腫瘤組織陽性片作為陽性對(duì)照，以PBS 取代一抗作為陰性對(duì)照，使用DAB 顯色，封片。每組隨機(jī)抽取5例標(biāo)本，每例標(biāo)本隨機(jī)選取6個(gè)視野（×400），在病理分析系統(tǒng)中選擇圖像最清晰的區(qū)域，進(jìn)行尺度調(diào)整和光密度校正。在每個(gè)圖像中，隨機(jī)選擇一個(gè)被測(cè)量的對(duì)象區(qū)域，利用體視學(xué)的基本原理，實(shí)現(xiàn)單點(diǎn)彩色分割，得到各組平均光密度（MOD），進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 27.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用 LSD 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腫瘤組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達(dá) AKT陽性物質(zhì)表現(xiàn)為褐色及黃色的微粒（圖1 ～圖2），其主要存在于細(xì)胞漿中，少數(shù)位于細(xì)胞膜上，而陰性對(duì)照組呈淡黃色。mTOR 陽性物質(zhì)呈深褐色或深黃色顆粒（圖3 ～圖4），其分布在細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞核中，少數(shù)位于細(xì)胞膜中，陰性則表現(xiàn)為淺黃色。p-4EBP1的陽性物質(zhì)表現(xiàn)為褐色或深黃色的微粒（圖5 ～圖6），其分布在細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上，陰性表現(xiàn)為無色或淡黃色。

圖1 ～圖2 AKT（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖3 ～圖4 mTOR（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖5 ～圖6 p-4EBP1（免疫組織化學(xué)染色，×400）

3.2 模型組AKT、mTOR、p-4EBP1 蛋白的表達(dá)與空白組比較 與空白組相比，模型組癌組織與癌旁組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達(dá)均升高（P＜0.05），且AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達(dá)水平均為癌組織＞癌旁組織＞正常腸黏膜組織。見表1。

表1 模型組與空白組各蛋白表達(dá)（± s，n = 5）

表1 模型組與空白組各蛋白表達(dá)（± s，n = 5）

注：與空白組比較，# P ＜0.05

組別 組織類型 AKT mTOR p-4EBP1空白組 —— 0.22±0.13 0.31±0.10 0.26±0.13模型組 癌組織 0.46±0.15# 0.59±0.11# 0.62±0.16#癌旁組織 0.39±0.06# 0.48±0.08# 0.57±0.19#

3.3 各組裸鼠AKT蛋白的表達(dá)與模型組的比較 與模型組比較，健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織中，AKT蛋白的表達(dá)均呈下降水平（P＜0.05），其中以健脾益氣組與健脾化瘀解毒組降低最為明顯（P＜0.05）。對(duì)于AKT 蛋白降低水平，健脾益氣組＜健脾化瘀解毒組，健脾益氣組與健脾化瘀解毒組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與雷帕霉素組及5-Fu 組比較，健脾化瘀解毒組對(duì)AKT 蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組癌及癌旁組織AKT 表達(dá)的比較（± s，n = 5）

表2 各組癌及癌旁組織AKT 表達(dá)的比較（± s，n = 5）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；與健脾益氣組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與化瘀解毒組比較，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01；與雷帕霉素組比較，□P ＜0.05；與5-Fu 組比較，■P ＜0.05

組別 癌組織 癌旁組織模型組 0.46±0.14 0.39±0.05健脾益氣組 0.28±0.05##□ 0.24±0.13#▲▲化瘀解毒組 0.31±0.13#□ 0.34±0.08#□健脾化瘀解毒組 0.16±0.10##△△▲□■ 0.22±0.07##▲▲□■雷帕霉素組 0.30±0.15##△ 0.25±0.17#5-Fu 組 0.27±0.16# 0.29±0.15#△

3.4 各組裸鼠mTOR 蛋白的表達(dá)與模型組的比較 與模型組比較，健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織中，mTOR蛋白表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），5 組中以健脾化瘀解毒組和雷帕霉素組mTOR 的下降最低，以健脾化瘀解毒組下降最明顯（P＜0.05）。化瘀解毒組mTOR 表達(dá)水平較健脾益氣組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織低（P＜0.05）。健脾益氣組癌組織及癌旁組織中mTOR 表達(dá)與化瘀解毒組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

與健脾益氣組、化瘀解毒組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織比較，健脾化瘀解毒組對(duì)mTOR 表達(dá)的下降差異有顯著性差異（P＜0.05）。雷帕霉素組與健脾化瘀解毒組癌組織與癌旁組織比較，對(duì)mTOR 表達(dá)的下降無顯著性差異（P＞0.05）。雷帕霉素組與健脾益氣組、化瘀解毒組癌組織及癌旁組織比較，對(duì)mTOR 表達(dá)的下降結(jié)果有顯著性差異（P＜0.05）。見表3。

表3 各組癌及癌旁組織mTOR 表達(dá)的比較（± s，n = 5）

表3 各組癌及癌旁組織mTOR 表達(dá)的比較（± s，n = 5）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；與健脾益氣組比較，△P ＜0.05；與化瘀解毒組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與5-Fu組比較，■P ＜0.05

組別 癌組織 癌旁組織模型組 0.59±0.15 0.51±0.06健脾益氣組 0.42±0.07# 0.48±0.12#▲化瘀解毒組 0.39±0.13# 0.29±0.04##健脾化瘀解毒組 0.25±0.09##△▲■ 0.22±0.03#△▲▲■雷帕霉素組 0.27±0.07#△▲ 0.24±0.08#△▲5-Fu 組 0.45±0.16#▲ 0.36±0.09#▲

3.5 各組裸鼠p-4EBP1 蛋白的表達(dá)與模型組的比較 與模型組比較，健脾益氣組、化瘀解毒組、健脾化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組癌組織與癌旁組織中p-4EBP1 的表達(dá)均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以健脾化瘀解毒組和雷帕霉素組p-4EBP1 的表達(dá)水平最低，而健脾化瘀解毒組下降幅度最為明顯（P＜0.05）。在健脾益氣組及化瘀解毒組中，p-4EBP1表達(dá)水平較5-Fu 組癌組織中低（P＜0.05）。健脾益氣組與化瘀解毒組癌組織與癌旁組織中p-4EBP1 表達(dá)相比差異無顯著性意義（P＞0.05）。健脾益氣組、化瘀解毒組、雷帕霉素組、5-Fu 組與健脾化瘀解毒組癌組織及癌旁組織比較，p-4EBP1 的下調(diào)差異均有顯著性差異（P＜0.05）。見表4。

表4 各組癌及癌旁組織p-4EBP1 表達(dá)的比較（± s，n = 5）

表4 各組癌及癌旁組織p-4EBP1 表達(dá)的比較（± s，n = 5）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；與健脾益氣組比較，△P ＜0.05；與化瘀解毒組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；與雷帕霉素組比較，□P ＜0.05；與5-Fu 組比較，■P ＜0.05

組別 癌組織 癌旁組織模型組 0.62±0.14 0.57±0.12健脾益氣組 0.26±0.04## 0.41±0.11#□化瘀解毒組 0.27±0.05##□ 0.45±0.13#健脾化瘀解毒組 0.18±0.04#△▲▲□■ 0.23±0.10##△▲□■雷帕霉素組 0.21±0.03# 0.36±0.07#5-Fu 組 0.42±0.13#△▲ 0.38±0.05#△

4 討論

Akt/mTOR 是一種廣泛存在于細(xì)胞中的信號(hào)途徑，參與多種惡性腫瘤[10-11]發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。Akt 可與PIP2 和PIP3 反應(yīng)，激活 Akt 從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞膜，進(jìn)而激活其下游的靶標(biāo)，促進(jìn)細(xì)胞生長，抑制細(xì)胞凋亡[12]。AKT 在組織內(nèi)分布廣泛，它對(duì)腫瘤細(xì)胞的異常活化有促進(jìn)作用?，F(xiàn)有研究證明，AKT 在大腸癌[13]的發(fā)展過程中，激活了細(xì)胞的存活信號(hào)，并通過磷酸化的方式激活A(yù)KT，抑制了其下游的多種活性物質(zhì)，從而抑制癌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長、增殖和分化。mTOR 是PI3K/Akt 途徑的下游分子，在正常情況下，通過Akt 介導(dǎo)后，mTOR 被激活，進(jìn)而磷酸化4EBP1來調(diào)控細(xì)胞的生長與增殖[14]。p-4EBP1 是mTOR 的下游分子，曹李等發(fā)現(xiàn)p-mTOR 與p-4EBP1 在大腸癌中的表達(dá)存在顯著的正相關(guān)關(guān)性（P＜0.0.5），而p-mTOR、p-4EBP1 在大腸癌中的高表達(dá)水平可能是導(dǎo)致結(jié)直腸腺癌發(fā)病的主要機(jī)制之一[15]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健脾化瘀解毒組對(duì)大腸癌HCT116 裸鼠模型癌組織與癌旁組織中的AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達(dá)均有一定的抑制作用。健脾益氣組和化瘀解毒組對(duì)癌組織與癌旁組織中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達(dá)均有一定的下調(diào)作用，但其下降幅度低于健脾化瘀解毒組。

結(jié)直腸癌中醫(yī)學(xué)里稱為“腸覃、臟毒、腸癖”等，根據(jù)多年行醫(yī)經(jīng)驗(yàn)，蔣老師認(rèn)為大腸癌病因主要分為內(nèi)因及外因[16]，內(nèi)因責(zé)之于人體正氣虧虛，又以脾氣虛為主，外因包括外感六淫之邪、飲食失節(jié)等。當(dāng)人體長期處于正氣虧虛的狀態(tài)，以致于不能有效抵御外邪，從而導(dǎo)致有形之邪如食滯、氣阻、血瘀、痰凝、濕聚等瘀滯體內(nèi)， 久而不散， 日久搏結(jié)，積聚以化毒，發(fā)展成為癌塊。概括以脾氣虧虛、癌毒內(nèi)結(jié)，即病機(jī)以瘀、毒、虛為本，臨床治療當(dāng)以健脾益氣，化瘀解毒為治法?；诖酥畏ㄎ覀償M方健脾消癌方，核心藥物由人參 10 g，薏苡仁 30 g，半枝蓮 30 g，重樓 10 g，莪術(shù) 10 g，郁金 15 g 組成，方中人參、薏苡仁健脾益氣，重樓、半枝蓮清熱解毒，莪術(shù)、郁金活血化瘀消癥，全方合用，既能健脾益氣扶正，又可化瘀解毒攻邪，攻補(bǔ)兼施。

結(jié)果表明健脾化瘀解毒組可能通過抑制Akt/mTOR通路的激活，下調(diào)AKT、mTOR、p-4EBP1 蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抗癌、抑癌、阻癌的目的，且健脾化瘀解毒法優(yōu)于單純的健脾益氣法及化瘀解毒法。脾胃為氣血生化之源、后天之本?；鼋舛舅幬锒嗪疀?、辛散，久用則有易傷脾胃、耗散氣血、損傷正氣之弊端。健脾化瘀解毒治法合健脾益氣、化瘀解毒，一方面可以固護(hù)脾胃，保養(yǎng)后天之氣血，彌補(bǔ)化瘀解毒藥物易傷人體正氣的缺陷，從而抑瘤而無后顧之憂；另一方面又可正面奮起抗邪，攻毒抑瘤、消癰散結(jié)，發(fā)揮抗癌作用；故整體配伍、協(xié)同增效、療效最佳。

綜上，健脾化瘀解毒法的抗腫瘤機(jī)制可能系下調(diào)Akt/mTOR 通路的關(guān)鍵蛋白AKT、mTOR、p-4EBP1 的表達(dá)，健脾益氣法與化瘀解毒法協(xié)同增效，以獲得最佳療效。但中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)作用，常常通過多種途徑發(fā)揮抗腸癌效應(yīng)，其作用機(jī)理還需深入探討。