南方番茄病毒在海南省的發(fā)生分布及全基因組序列分析

車海彥 林雅婷 羅大全 龍海波

關(guān)鍵詞：南方番茄病毒；小RNA深度測序；RT-PCR檢測；基因組

1984年，美國加利福尼亞因皮里爾河谷的番茄上出現(xiàn)葉片黃化、生長衰退和坐果少等癥狀[1]。2005年，墨西哥西南部和美國密西西比州東北部的番茄上也出現(xiàn)相似的癥狀，上述3地的病株體內(nèi)均分離到一種基因組為3.5kb的dsRNA病毒，SABANADZOVIC等[2]將其命名為南方番茄病毒（Southerntomatovirus，STV）。目前，STV在亞洲（中國、孟加拉國、韓國、越南、日本、土耳其、泰國、巴基斯坦和以色列）[3-8]、歐洲（法國、意大利、西班牙、英國、瑞士、德國和塞爾維亞）[8，9-19]、非洲（留尼汪島）[9]、北美洲（美國、墨西哥和加拿大）[1-2，8]、中美洲（多米尼加和巴拿馬）[9]和南美洲（哥倫比亞和巴西）[8，20]的很多國家均有報道發(fā)生。2011年，我國首次在新疆加工番茄上發(fā)現(xiàn)STV感染的植株[3]，隨后在山東[21-22]、浙江[23]、江西[23]、四川[24]、重慶[25]、北京[26]、廣東[27]、江蘇[28]、寧夏[29]和貴州[8]等地的番茄上也相繼檢測到STV。但目前我國僅公布2條STV基因組全長序列[4，30]，對STV的深入研究報道較少。

STV隸屬于混合病毒科（Amalgaviridae）混合病毒屬（Amalgavirus），尚未發(fā)現(xiàn)病毒粒子，其基因組由1條線性dsRNA組成，長約3.5kb，在正義鏈上有2個部分重疊的開放閱讀框（openreadingframe，ORF），結(jié)構(gòu)上與Totiviridae成員相似。ORF1長1134bp，編碼由377個氨基酸組成的p42蛋白，推測為外殼蛋白（coatprotein，CP），分子量約為42.4kDa。ORF2長2289nt，編碼由762個氨基酸組成的RNA依賴的RNA聚合酶（RNAdependentRNApolymerase，RdRp），RdRp可能通過程序性+1核糖體移碼（programmed+1ribosomalframeshifting，+1PRF）表達(dá)為與ORF1的融合蛋白（類似于逆轉(zhuǎn)錄病毒的gag-pol融合蛋白），分子量約為121.5kDa[2，31]。盡管STV在基因組結(jié)構(gòu)上與Totiviridae成員相似，但基于RdRp氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，STV與分體病毒科（Partitiviridae）成員的親緣關(guān)系更近[2，31]。目前，尚未觀察到STV的病毒粒子。STV除通過種子和花粉傳播外，尚未發(fā)現(xiàn)其他傳播途徑[2，30-31]。僅在番茄（Solanumlycopersicum）、辣椒（Capsicumannuum）、龍葵（Solanumnigrum）和燈籠果（Physalisperuviana）4種茄科植物上檢測到STV[8，10，20，32]。

番茄是海南冬季重要的北運(yùn)瓜菜品種之一，主要種植于陵水、昌江、定安等地，至2019年，海南省種植面積達(dá)7822hm2，產(chǎn)量為28.15萬t[33]。隨著種植面積的增加和種植年限的延長，生產(chǎn)中病蟲害發(fā)生為害日趨嚴(yán)重，其中病毒病是為害最嚴(yán)重的病害，部分田塊病株率高達(dá)100%。筆者在利用小RNA深度測序技術(shù)鑒定海南番茄病毒病病原時發(fā)現(xiàn)，STV在海南多個市（縣）的樣品中均存在，而且發(fā)現(xiàn)1株STV單獨(dú)侵染的樣品。為進(jìn)一步了解STV在海南的發(fā)生分布情況，利用RT-PCR技術(shù)檢測了2015—2021年采集自海南的番茄樣品，同時結(jié)合RACE和RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了海南番茄樣品上的STV全基因組序列，本研究結(jié)果有助于了解STV在海南的分布、發(fā)生趨勢及遺傳多樣性，為病害防控提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

小RNA深度測序的番茄葉片樣品（編號為T-DZ-2）于2019年采自海南儋州寶島新村，田間癥狀表現(xiàn)為葉脈壞死、葉脈間不均勻褪綠，長勢衰弱。STV檢測的樣品共987份，于2015—2021年采自海南陵水、定安、昌江、?？?、瓊海、三亞、儋州、文昌、臨高、樂東共10個市（縣）。

植物總RNA提取試劑盒和普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，TRIzolReagent購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，2×RapidTaqMasterMix和2×PhantaFlashMasterMix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，pMD18-TVectorCloningKit、E.coliCompetentCellDH5α、Poly（A）Polymerase和SMARTerRACE5′/3′Kit均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2方法

1.2.1小RNA深度測序和分析使用TRIzolReagent提取番茄葉片樣品（編號為T-DZ-2）的總RNA。委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建小RNA文庫，使用Hiseq2000平臺進(jìn)行SE50測序，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控分析后，獲得cleansmallRNA序列，使用Velvet1.2.10軟件[34]對其進(jìn)行拼接組裝。將拼接結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn和Blastx比對，將得到的病毒序列進(jìn)行統(tǒng)計并注釋。

1.2.2RT-PCR驗證以1.2.1提取的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用STV特異性檢測引物STV-F/STV-R[23]對小RNA深度測序結(jié)果進(jìn)行驗證，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系（25μL）：12.5μL2×RapidTaqMasterMix、10μmol/L的上游引物和下游引物各1μL，1μLcDNA，9.5μL無菌ddH2O。PCR反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，52℃退火5s，72℃延伸5s，循環(huán)35次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收特異片段，回收產(chǎn)物直接測序。本研究所有的引物合成和測序均委托北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2.3田間番茄樣品的STV檢測使用植物總RNA提取試劑盒提取田間采集的987份樣品總RNA，cDNA合成和PCR檢測反應(yīng)參見1.2.2。

1.2.4STV全基因組序列擴(kuò)增根據(jù)田間樣品的檢測結(jié)果，選取海南儋州（T-DZ-2）、陵水（T-LS-52）、定安（T-DA-23）和昌江（T-CJ-15）共4個樣品進(jìn)行全基因組擴(kuò)增。STV全基因組擴(kuò)增策略如圖1所示。根據(jù)小RNA深度測序結(jié)果和GenBank已有序列，利用在線引物設(shè)計工具Primer3（https：//bioinfo.ut.ee/primer3/）設(shè)計基因組擴(kuò)增引物對STV-F1/STV-R1（表1），按照1.2.2方法對STV的基因組編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。5′和3′末端非編碼區(qū)擴(kuò)增：利用Poly（A）Polymerase將4個樣品的RNA3′端加上poly（A）尾，使用SMARTerRACE5′/3′Kit進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)基因組編碼區(qū)測序結(jié)果，設(shè)計特異性引物STV-GSP5和STV-GSP3（表1），分別對STV基因組的5′和3′末端序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的特異性片段產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，與pMD18-Tvector連接，轉(zhuǎn)化到E.coliCompetentCellDH5α中，利用PCR反應(yīng)篩選陽性克隆。

1.2.5STV基因組結(jié)構(gòu)分析使用VectorNTIAdvance11軟件對測序結(jié)果進(jìn)行校正、拼接。采用NCBI中BLAST程序進(jìn)行相似性查找[35]。使用在線工具ORFFinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行ORF預(yù)測。分別使用在線軟件MAFFT（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）和ClustalOmega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列一致性比對。

1.2.6STV基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育分析利用MEGAX軟件[36]的ClustalW法進(jìn)行多序列比對，基于STV的全長基因組核苷酸序列，采用最大似然法（maximumlikelihood，ML）構(gòu)建進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)置為1000。

1.2.7STV群體基因組序列相似性分析為進(jìn)一步明確系統(tǒng)進(jìn)化樹分組中STV分離物在基因組水平上的差異，從組Ⅰ和組Ⅱ中選取29個代表性分離物，連同本研究獲得的4個海南分離物，利用SDTv1.2軟件[37]和Simplot3.5軟件[38]進(jìn)行相似性比對分析。

1.2.8重組分析使用RDP5軟件[39]提供的7種重組檢測算法（RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq）對STV分離物的全基因組序列進(jìn)行潛在重組事件分析，參數(shù)為軟件默認(rèn)。為了保證分析結(jié)果的可靠性，每個重組事件至少需要被上述7種算法中的5種所支持。

2結(jié)果與分析

2.1小RNA深度測序結(jié)果及RT-PCR驗證

番茄樣品經(jīng)小RNA深度測序后獲得22875457條rawreads，質(zhì)控后得到9971315條cleanreads，將質(zhì)控后獲得的序列進(jìn)行拼接組裝，得到1509條contigs，將拼接結(jié)果與NCBI病毒庫比對，獲得3條源于病毒的contigs，均匹配到STV基因組，說明T-DZ-2樣品中可能含有STV。

為了驗證小RNA深度測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，利用STV特異性檢測引物STV-F和STV-R對樣品T-DZ-2進(jìn)行RT-PCR檢測（圖2），擴(kuò)增到582bp的目標(biāo)條帶，將PCR產(chǎn)物直接測序。Blastn比對分析發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)條帶序列與已公布的STV基因組序列相似一致性為98.45%～99.83%，說明樣品T-DZ-2中存在STV。

2.2STV在海南的發(fā)生與分布

利用STV特異性引物STV-F和STV-R對2015—2021年采集的987份番茄葉片樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：在9個市（縣）的142份樣品中檢測到STV（圖3、表2）。2015年，僅在陵水和昌江樣品中檢測到STV。此后STV在海南的發(fā)生分布范圍逐漸擴(kuò)大，檢出率逐年增加，到2021年，在陵水、文昌、昌江、三亞、臨高、定安、樂東、儋州、瓊海共9個市（縣）檢測到STV，檢出率由2015年的8.82%上升到2021年的22.45%。上述結(jié)果說明，至少從2015年開始，海南番茄就已經(jīng)被STV感染，而且STV在田間的發(fā)病率總體呈逐年上升趨勢。

2.3STV全基因組序列分析

使用引物對STV-F1/STV-R1、STV-GSP5/UPM、STV-GSP3/UPM分別對海南儋州（T-DZ-2）、陵水（T-LS-52）、定安（T-DA-23）和昌江（T-CJ-15）的4個STV分離物基因組編碼區(qū)、5′末端和3′末端非編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增（圖4），將測序獲得的STV基因組編碼區(qū)序列與5′和3′末端序列拼接，4個分離物的全基因組序列長度均為3446nt，不含3′-端poly（A）尾，GenBank登錄號分別為OP484998、OP484999、OP485000、OP485001。STV基因組包含2個部分重疊的ORFs，ORF1位于基因組147～1280nt，編碼377aa。ORF2位于基因組1048～3336nt，編碼762aa。編碼區(qū)A+T的含量為50.72%～50.75%。在993～999nt之間存在可能有助于核糖體移碼的滑動序列GGGAAGA；5′UTR的長度為146nt，比已公布的STV分離物至少長8nt，A+T的含量為57.59%～58.12%。3′UTR的長度為110nt，A+T的含量為68.18%～69.09%?；蚪M非編碼區(qū)比編碼區(qū)富含更多的A+T。

本研究中的4個STV海南分離物間基因組核苷酸一致性為99.86%～100.00%，CP、RdRp的核苷酸一致性分別為99.82%～100.00%和99.91%～100.00%，氨基酸一致性分別為99.73%～100.00%和99.87%～100.00%；與我國已報道的2個STV分離物（KY228384，KT438549）的基因組核苷酸一致性分別為99.53%～99.65%和99.07%～99.19%，CP、RdRp的核苷酸一致性分別為99.47%～99.65%和99.26%～99.74%，氨基酸一致性分別為98.67%～99.73%和99.34%～99.61%；與GenBank中所有已公布的76個STV分離物（截至2022年9月28日）基因組核苷酸一致性為98.45%～99.94%，CP、RdRp的核苷酸序列一致性分別為98.68%～100.00%和98.38%～100.00%，氨基酸序列一致性分別為98.41%～100.00%和98.95%～100.00%。與所有已知的STV分離物全基因組核苷酸序列一致性為98.28%～100.00%，CP、RdRp的核苷酸一致性分別為98.41%～100.00%和97.99%～100.00%，氨基酸一致性分別為97.61%～100.00%和98.29%～100.00%。

2.4STV的系統(tǒng)發(fā)育和重組分析

基于80個STV分離物的全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，STV分離物明顯分為2個組，組Ⅰ包括亞洲、美洲、歐洲和非洲分離物；組Ⅱ中除1個亞洲分離物外，其他均為歐洲分離物；歐洲的斯洛文尼亞分離物在組Ⅰ和組Ⅱ均有分布。我國的6個STV分離物中，4個海南分離物在同一個小的進(jìn)化分支上，與新疆分離物（KY228384）一起分在組Ⅰ，山東分離物（KT438549）分在組Ⅱ；泰國辣椒分離物（LC487710）和法國龍葵分離物（MN216388）分在組Ⅰ，與其他番茄分離物在小的進(jìn)化支上，未單獨(dú)分支（圖5）。

全基因組重組分析結(jié)果表明，80個STV分離物基因組間未發(fā)現(xiàn)重組事件。

2.5STV群體基因組序列相似性分析

為明確系統(tǒng)進(jìn)化樹分組中STV分離物在基因組水平上的差異，從組Ⅰ和組Ⅱ中選取29個代表性分離物，與本研究獲得的4個海南分離物，進(jìn)一步利用SDT軟件（圖6）和Simplot軟件（圖7）進(jìn)行相似性分析，發(fā)現(xiàn)4個STV海南分離物的核苷酸序列與組Ⅰ中用于分析的其他STV分離物間的相似性為99.65%～100.00%，基因組序列變異度比較高的區(qū)域位于881～1061nt和1521～1721nt；4個STV海南分離物的核苷酸序列與組Ⅱ中的分離物相似性為98.72%～99.07%，基因組序列變異度比較高的區(qū)域位于2041～2241nt和2761～2921nt。

3討論

南方番茄病毒經(jīng)常與其他病毒復(fù)合侵染番茄，如在我國北京房山，STV與番茄黃化曲葉病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）、番茄褪綠病毒（Tomatochlorosisvirus，ToCV）復(fù)合侵染番茄[26]；在意大利，STV與鳳果花葉病毒（Pepinomosaicvirus，PepMV）和馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）復(fù)合侵染番茄[11]，故STV單獨(dú)侵染引起的寄主癥狀尚不明確。但本研究通過小RNA深度測序發(fā)現(xiàn)1株單獨(dú)侵染番茄的STV分離物，田間癥狀表現(xiàn)為葉脈壞死、葉脈間不均勻褪綠，這些癥狀與HARJU等[16]在英國南部發(fā)現(xiàn)的STV單獨(dú)侵染番茄的表現(xiàn)癥狀極為相似，與美國加利福尼亞的因皮里爾河谷[1]、密西西比州東北部和墨西哥西南部[2]發(fā)現(xiàn)的STV引起的番茄感病癥狀存在明顯不同。STV有時也會在健康植株上檢測到[17，40]，研究人員甚至發(fā)現(xiàn)感染STV的番茄植株不僅會結(jié)出更多的果實，而且結(jié)出的種子發(fā)芽率也高于無STV感染的植株[8]。根據(jù)上述研究結(jié)果推測：STV可能不僅存在致病性分化，而且同一毒株對同一寄主植物不同品種的致病性也有很大差異。

所有已知的STV分離物全基因組核苷酸序列一致性為98.28%～100.00%，說明不同地理來源的STV基因組序列變異率低，具有高度保守性。全基因組重組分析也未發(fā)現(xiàn)重組現(xiàn)象，與ELVIRAGONZáLEZ等[14]的分析結(jié)果一致。

GenBank數(shù)據(jù)庫（截至2022年9月28日）中共有119條STV序列，其中76條為全基因組序列[9]。STV的自然寄主均為茄科植物，除3個分離物的寄主為辣椒（LC487710）、龍葵（MN216388）和燈籠果（MN417999）外，其他分離物的寄主均為番茄[8]。基于全基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，所有的STV分離物被明顯分為2個組。除中國分離物（5個被分在組Ⅰ，1個被分在組Ⅱ）、塞爾維亞（4個被分在組Ⅰ，1個被分在組Ⅱ）和斯洛文尼亞分離物（6個被分在組Ⅰ，16個被分在組Ⅱ）外，同一國家的分離物均在同一組內(nèi)，如5個法國分離物、15個土耳其分離物、2個英國分離物、3個美國分離物和4個越南分離物均被分在組Ⅰ，2個德國分離物和2個瑞士分離物均被分在組Ⅱ。泰國辣椒分離物（LC487710）和法國龍葵分離物（MN216388）被分在組Ⅰ（STV燈籠果分離物的序列片段不完整，未參與進(jìn)化樹構(gòu)建），與其他番茄分離物在小的進(jìn)化支上，未單獨(dú)分支。說明STV分離物的分組與地域存在一定相關(guān)性，而與寄主植物之間不存在相關(guān)性。由于STV分離物主要來自番茄，而來自其他寄主植物的報道還較少，上述推論還需要更多的試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證。

2011年，我國首次在新疆番茄上發(fā)現(xiàn)STV，目前該病毒至少已在10個?。▍^(qū)）的番茄植株上檢測到[3，8，21-29]，XU等[41]研究認(rèn)為STV已經(jīng)成為我國番茄上第四大流行病毒。本研究結(jié)果表明，早在2015年，海南陵水和昌江的田間番茄上就已存在STV。到2021年，STV已在陵水、文昌、昌江、三亞、臨高、定安、樂東、儋州、瓊海共9個市（縣）檢測到，STV在海南的發(fā)生分布范圍逐漸擴(kuò)大，發(fā)病率逐年上升。因為STV是嚴(yán)格的種傳病毒，有必要開展制種田中番茄的抽樣檢測工作，對番茄種子實行嚴(yán)格檢疫，同時加強(qiáng)STV的田間監(jiān)測，及時清理早期感病植株，對STV的綜合防控具有重要意義。