基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討巴元明治療慢性腎功能衰竭核心藥物的作用機(jī)制*

劉施,李成銀,高越,陳樹和,巴元明,徐玉婷

湖北省中醫(yī)院,湖北中醫(yī)院大學(xué)附屬醫(yī)院,湖北 武漢 430061

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure,CRF)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,涉及腎小球病變、腎小管間質(zhì)纖維化、脂質(zhì)代謝異常等多個(gè)方面[1]。西醫(yī)治療CRF存在一定的局限性,如治療成本高、替代治療方案普及程度不足等。相比之下,中醫(yī)藥治療CRF具有較好的療效和優(yōu)勢(shì)[2-5]。課題組前期基于中醫(yī)傳承輔助平臺(tái)構(gòu)建巴元明治療CRF的醫(yī)案數(shù)據(jù)庫(kù),采用關(guān)聯(lián)規(guī)則Apriori算法和熵聚類分析方法篩選核心藥物,包括黃芪、黨參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、白茅根、茜草、金櫻子、芡實(shí)、黃柏、穿山甲。這些核心藥物是在清代醫(yī)家沈金鰲所撰《沈氏尊生書》中的參芪地黃湯基礎(chǔ)上加減化裁而來(lái)[6],這一方劑具有較好的臨床療效。鑒于中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特性,這些核心藥物治療CRF的作用機(jī)制尚未完全闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性等特征,能夠有效闡釋中藥的作用機(jī)制[7],并為研究復(fù)雜的中藥系統(tǒng)提供新思路[8-9]。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討巴元明治療CRF核心藥物的作用機(jī)制,以期為后續(xù)的臨床和基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 核心藥物活性成分及作用靶點(diǎn)篩選在中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)(integrative pharmacology-based research platform of traditional Chinese medicine,TCMIP)V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)[10](http：//www.tcmip.cn/)的“中藥材數(shù)據(jù)庫(kù)”中建立任務(wù)列表,檢索黃芪、黨參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、白茅根、茜草、金櫻子、芡實(shí)、黃柏、穿山甲的化學(xué)成分。根據(jù)結(jié)構(gòu)相似的生物分子化合物具有類似理化性質(zhì)和生物活性的原理,在TCMIP V2.0檢索化合物的二維結(jié)構(gòu),并將其與美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局上市藥物進(jìn)行比對(duì),以Tanimoto系數(shù)定義的相似度計(jì)量方法對(duì)相似性打分,選擇相似性≥0.8的藥物所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)作為核心藥物的作用靶點(diǎn)。

1.2 CRF相關(guān)疾病靶點(diǎn)以“chronic renal failure”“renal failure”作為關(guān)鍵詞,在TCMIP V2.0“疾病靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)”中進(jìn)行檢索,構(gòu)建CRF的疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將核心藥物作用靶點(diǎn)與CRF疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配,所得靶點(diǎn)即為核心靶點(diǎn)。通過TCMIP V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建核心藥物作用靶點(diǎn)與CRF疾病靶點(diǎn)之間的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 “核心藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建通過TCMIP V2.0的“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊,針對(duì)核心藥物作用靶點(diǎn)與CRF疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)計(jì)算拓?fù)涮卣髦?選取大于“介度(Betweenness)”“緊密度(Closeness)”中位數(shù)的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn),并構(gòu)建“核心藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”的多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.5 基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析采用David v6.7數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp) 對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路分析,結(jié)果按照P值從低到高的順序進(jìn)行排序。

2 結(jié)果

2.1 核心藥物化學(xué)成分及作用靶點(diǎn)基于TCMIP V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)獲取12個(gè)核心藥物的化學(xué)成分,其中山茱萸56個(gè)、茜草52個(gè)、金櫻子14個(gè)、黃芪27個(gè)、黃柏24個(gè)、茯苓33個(gè)、黨參64個(gè)、芡實(shí)1個(gè)、白茅根20個(gè)、穿山甲8個(gè)、山藥45個(gè)、地黃12個(gè)。

設(shè)定相似性≥0.8獲取化學(xué)成分的作用靶點(diǎn),其中山茱萸784個(gè)、茜草210個(gè)、金櫻子92個(gè)、黃芪399個(gè)、黃柏87個(gè)、茯苓232個(gè)、黨參540個(gè)、芡實(shí)21個(gè)、白茅根309個(gè)、穿山甲91個(gè)、山藥898個(gè)、生地黃656個(gè)。

2.2 CRF疾病靶點(diǎn)基于TCMIP V2.0疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲取13個(gè)CRF相關(guān)疾病靶點(diǎn),包括前列腺素E受體 4(prostaglandin E receptor 4 gene,PTGER4)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)等。

表1 CRF疾病靶點(diǎn)信息

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)將核心藥物作用靶點(diǎn)與CRF疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配,得到136個(gè)核心靶點(diǎn),構(gòu)建“核心藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)”的PPI網(wǎng)絡(luò),見圖1。篩選大于"Betweenness""Closeness"中位數(shù)的靶點(diǎn),得到62個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),根據(jù)Degree值進(jìn)行排序后,排名前20位的關(guān)鍵靶點(diǎn),見表2。

注：圓形代表核心藥物作用靶點(diǎn),方形代表CRF疾病靶點(diǎn)。圖1 “核心藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)”PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表2 巴元明治療CRF核心藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)(前20位)

2.4 “核心藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò)利用TCMIP V2.0平臺(tái)“中醫(yī)藥關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)挖掘”模塊,建立巴元明治療CRF的“核心藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”多維關(guān)系網(wǎng)絡(luò),結(jié)果顯示核心藥物的68個(gè)活性成分直接或間接作用于62個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),見圖2。

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析針對(duì)136個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,GO分析以P<0.01為篩選條件,共獲得170個(gè)功能富集,其中生物過程(biological process,BP)涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過程負(fù)調(diào)控、血管收縮、腺苷酸環(huán)化酶活性的激活等;細(xì)胞成分(cellular component,CC)涉及質(zhì)膜、突觸、線粒體等;分子功能(molecular function,MF)涉及細(xì)胞色素C氧化酶活性、磷酸吡哆醛結(jié)合、受體活性、藥物結(jié)合、蛋白結(jié)合等,排名前9位的GO分析結(jié)果見表3。KEGG通路分析以P<0.05為篩選條件,共獲得105個(gè)通路富集結(jié)果,主要涉及神經(jīng)活性配體-受體相互作用、環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號(hào)通路、代謝通路、Ras信號(hào)通路、近端小管對(duì)鈉離子的重吸收等,排名前10位的KEGG結(jié)果見圖3。

圖3 KEGG富集通路圖(前10位)

表3 GO功能富集分析(前9位)

3 討論

慢性腎功能衰竭是多種腎臟疾病晚期的最終結(jié)局,其發(fā)病機(jī)制涉及腎小球病變、腎小管間質(zhì)纖維化等多個(gè)方面[11]。本研究基于TCMIP V2.0數(shù)據(jù)庫(kù)探索巴元明治療CRF核心藥物的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,結(jié)果表明12味中藥含有356個(gè)活性成分,主要包括黃酮類化合物、甾體皂苷類及生物堿等,排名前20位的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、新陳代謝等功能相關(guān),主要分為以下幾類：(1)腺苷類(ADCY1、ADCY2、ADCY5、ADORA3、ADORA1、ADRA2A、ADRA2B)：腺苷受體廣泛分布于腎臟細(xì)胞,不同腺苷受體在腎纖維化中起著特異性作用,慢性腎病患者腎組織間隙腺苷濃度與纖維化程度具有相關(guān)性[12-13]。(2)多巴胺類(DRD2、DRD3)：多巴胺D2受體可與抑制型G蛋白耦聯(lián),發(fā)揮抑制腺苷酸環(huán)化酶、調(diào)節(jié)鈣離子和鉀通道活性的作用[14-16]。(3)熱休克蛋白αA1：熱休克蛋白90是一種重要的蛋白伴侶,能激活內(nèi)皮細(xì)胞磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路,在維護(hù)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)功能中發(fā)揮重要作用[17]。(4)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)受體(HTR1A、HTR1B、HTR1D、HTR2C)：5-HT及其受體是治療糖尿病腎病的抗氧化靶點(diǎn),5-HT受體拮抗劑可通過降低腎小球血小板活性、增加血清脂肪細(xì)胞因子水平從而改善腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能,進(jìn)而減輕糖尿病腎病早期出現(xiàn)的蛋白尿[18-20]。(5)核因子κB(NFKB1、NFKB2)：NF-κB通路與炎癥相關(guān),處于激活狀態(tài)時(shí)在腎小球肥大、腎臟纖維化等代謝性疾病中發(fā)揮重要作用[21]。(6)其他(TP53、AKT1)：研究發(fā)現(xiàn)AKT異常表達(dá)或激活參與糖尿病腎病纖維化的病理過程[22-23],沉默TP53基因可抑制AKT信號(hào)通路從而干擾腎透明細(xì)胞癌的局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]。

本研究挖掘核心藥物治療CRF的KEGG通路,主要包括4種：(1)cAMP信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)-蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase,PKG)信號(hào)通路：cAMP、cGMP常作為腎陰虛模型的指標(biāo),參與調(diào)節(jié)多種物質(zhì)代謝和生理功能;研究表明近端小管鈉重吸收與cGMP-PKG通路、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)通路激活導(dǎo)致哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制有關(guān)[25];此外,cAMP/PKA信號(hào)通路的激活與腎纖維化有關(guān)[26]。(2)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路：PI3K/AKT信號(hào)通路在腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚等病理過程中發(fā)揮作用;當(dāng)腎臟受損時(shí),腎上皮細(xì)胞中mTOR通路激活,引起細(xì)胞增生及纖維化,最終導(dǎo)致腎臟囊腫[27-28]。(3)PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路：通過影響腎小球系膜細(xì)胞增殖導(dǎo)致間質(zhì)纖維化;抑制PI3K/AKT信號(hào)傳遞,阻斷NF-κB信號(hào)通路激活,可改善腎小球纖維化病變。(4)胰島素抵抗通路：胰島素抵抗是慢性腎臟病進(jìn)展的機(jī)制之一,研究表明胰島素可通過調(diào)節(jié)足細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腎臟的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)節(jié)腎小球?yàn)V過功能[29]。綜上所述,巴元明治療CRF作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng)、干擾腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷、調(diào)節(jié)近端小管重吸收、抗腎纖維化、調(diào)節(jié)胰島素受體結(jié)合、減少蛋白尿等有關(guān)。

腎小管間質(zhì)纖維化是腎臟纖維化的標(biāo)志,也是慢性腎臟疾病進(jìn)展的重要因素[30]。本研究發(fā)現(xiàn)多條通路參與腎纖維化過程,如cAMP/PKA信號(hào)通路、PI3K/AKT/mTOR通路、PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路、胰島素抵抗通路等,他們可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)和腎小球系膜細(xì)胞增殖,改善腎小球纖維化病變。其中,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在抑制足細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[31-32],足細(xì)胞是腎小球內(nèi)阻止蛋白濾出的重要屏障,足細(xì)胞數(shù)量減少可造成濾過屏障結(jié)構(gòu)損傷,從而導(dǎo)致蛋白尿[33]。此外,高尿酸可激活NF-κB信號(hào)通路[34],觸發(fā)NF-κB下游大量炎癥因子合成,導(dǎo)致腎臟炎癥反應(yīng)。因此,巴元明教授治療CRF的作用機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)足細(xì)胞的生成與凋亡、減少蛋白尿有關(guān)。巴元明教授治療CRF常用黃芪與穿山甲,研究表明黃芪甲苷可干擾PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活,抑制腎臟纖維化并通過MAPK途徑減弱補(bǔ)體膜攻擊復(fù)合物誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[35];穿山甲可抑制黃嘌呤氧化酶和腎小管上多種尿酸鹽相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性從而治療高尿酸血癥,同時(shí)抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄和炎癥因子合成,從而抑制因高尿酸刺激誘發(fā)的腎臟炎癥損傷[36]。

綜上所述,巴元明治療CRF的核心藥物具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑等特點(diǎn),其可作用于腺苷酸環(huán)化酶1、多巴胺D2受體、熱休克蛋白αA1等靶點(diǎn),調(diào)控近端小管對(duì)鈉離子的重吸收、代謝通路、Ras信號(hào)通路等通路。本研究初步挖掘出巴元明治療CRF核心藥物的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,為中醫(yī)藥治療CRF提供了新思路,但研究結(jié)果尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。