棉花AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子GhTINY2負(fù)調(diào)控植株抗鹽性的功能分析

肖勝華 陸 妍 李安子 覃耀斌 廖銘靜 閉兆福 卓柑鋒朱永紅 朱龍付,*

1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西南寧 530000; 2華中農(nóng)業(yè)大學(xué) / 作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430000

棉花作為全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一, 是工業(yè)生產(chǎn)中天然紡織品的主要原料, 但長期以來, 高鹽、干旱、病蟲害等多種生物及非生物脅迫造成棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的大幅下降, 嚴(yán)重制約著棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[1-2]。新疆是我國著名的農(nóng)業(yè)大省, 由于其獨(dú)特的地理位置和優(yōu)越的氣候條件, 已成為我國最重要的棉花主產(chǎn)區(qū)。然而, 新疆鹽堿土面積高達(dá)2181.4萬公頃, 占全國鹽堿土總面積的22%[3], 土壤中高濃度的鹽離子削弱了棉花的根系活力及根系吸水能力, 嚴(yán)重威脅了棉花的生產(chǎn)安全[4-5]。近年來,隨著棉花基因組數(shù)據(jù)的公布, 越來越多的研究者通過分析及利用鹽脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組等多組學(xué)手段挖掘鹽脅迫響應(yīng)基因, 解析棉花響應(yīng)鹽脅迫的作用機(jī)制和分子調(diào)控機(jī)制, 并通過基因工程手段改良棉花抗性, 從而加快培育抗鹽耐鹽棉花新品種的進(jìn)程[2]。

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中一類可直接操控下游一系列基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子[6]。相較于抗鹽效應(yīng)相對有限的單個(gè)功能基因, 利用基因編輯手段操縱一個(gè)抗鹽轉(zhuǎn)錄因子則相當(dāng)于在植物中同時(shí)轉(zhuǎn)入多個(gè)抗鹽基因從而提高作物綜合耐鹽性。因此, 多項(xiàng)研究顯示來自不同基因家族的轉(zhuǎn)錄因子可通過調(diào)控不同代謝通路介導(dǎo)棉花抗鹽性, 包括MYB[7]、AP2/ERF[8]、NAC[9]、HD-ZIP[10]等。GhMYB73同時(shí)受鹽脅迫和脫落酸(abscisic acid, ABA)的誘導(dǎo), 可能通過與ABA受體GhPYL8互作并激活A(yù)BA信號進(jìn)而增強(qiáng)植株的鹽耐受性[7]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子GhERF4L和GhERF54L在棉花中被沉默后可削弱植株的抗鹽性[8]。在棉花中超量表達(dá)NAC轉(zhuǎn)錄因子GhATAF1可通過降低Na+含量和Na+/K+比例從而介導(dǎo)更強(qiáng)的植株抗鹽性[9]。HD-ZIP家族成員GhHB12在棉花中超量表達(dá)后削弱了對ABA的敏感性, 并抑制了多個(gè)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)從而負(fù)調(diào)控鹽脅迫抗性[10]。

AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子是植物中包含1至數(shù)個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域的一個(gè)超基因家族, 家族各成員的AP2結(jié)構(gòu)域通過特異識別并結(jié)合靶標(biāo)基因啟動(dòng)子中的GCC-box、ERF、DRE/CRT等順式作用元件調(diào)控其表達(dá)[11-13]。目前根據(jù)AP2/ERF超家族成員中的AP2結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及序列相似性, 將其分為5個(gè)亞家族,包括AP2、RAV、ERF、DREB以及單獨(dú)亞家族[14]。其中AP2亞家族成員含有2個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域, 參與植物器官的形成與發(fā)育[15]; RAV亞家族成員含1個(gè)AP2和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域, 可介導(dǎo)植物對油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR)及多種逆境的應(yīng)答[16]; ERF家族成員僅含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域, 主要通過與GCC-box元件結(jié)合進(jìn)而參與多種生物和非生物脅迫應(yīng)答[11];DREB亞家族成員也僅含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域, 主要通過綁定干旱響應(yīng)元件DRE/CRT調(diào)控脅迫響應(yīng)基因的表達(dá), 從而在干旱、高鹽、冷害等非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮功能[17]; 此外, 單獨(dú)亞家族成員數(shù)量較少,只含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域, 目前相關(guān)功能研究報(bào)道較少。

本研究通過分析棉花在鹽脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 鑒定到一個(gè)來自AP2/ERF超家族DREB亞家族的成員GhTINY2, 并證實(shí)了該基因在棉花和擬南芥中具有負(fù)調(diào)控鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)的生物學(xué)功能。有相關(guān)研究報(bào)道GhTINY2在抵御黃萎病菌(Verticillium dahliae)和調(diào)控生長發(fā)育過程中均發(fā)揮著重要作用[18-19], 表明GhTINY2是一個(gè)可參與棉花多個(gè)生物學(xué)過程的關(guān)鍵因子。本研究對GhTINY2在鹽脅迫抗性中的功能解析將為深入理解GhTINY2在響應(yīng)生物和非生物脅迫以及調(diào)控生長發(fā)育中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ), 也為育種家如何將具備多重功能的調(diào)控因子應(yīng)用于未來的實(shí)際生產(chǎn)中提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

將哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Columbia-0,Arabidopsis)和轉(zhuǎn)GhTINY2基因超表達(dá)擬南芥純合體種子分別用50%的84消毒液消毒2次, 每次5～10 min,然后用無菌水沖洗5～6次, 每次2～3 min。用1 mL槍頭將種子分別點(diǎn)播至提前用水澆灌的蛭石表面,然后放置于光照培養(yǎng)箱(16 h/8 h光照/黑暗, 18～22℃,60%濕度), 4～7 d后將擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至提前用水澆灌的營養(yǎng)土中生長。

挑選狀態(tài)飽滿的棉花品種‘Jin 668’ (Gossypium hirsutumcv. ‘Jin 668’)種子, 在28℃培養(yǎng)箱保濕催芽2～3 d。選取萌發(fā)狀態(tài)良好的種子種于提前用營養(yǎng)液澆灌的蛭石中, 放置于溫度為25～28℃、光周期為16 h/8 h的培養(yǎng)箱中, 3～4 d后幼苗萌發(fā)破土, 待子葉還未完全平展、側(cè)根未長出時(shí)將其轉(zhuǎn)移至裝有營養(yǎng)液的廣口瓶中, 每個(gè)廣口瓶內(nèi)放置2～3棵幼苗, 并定期更換營養(yǎng)液保證幼苗生長狀態(tài)良好。

1.2 NaCl和ABA處理

選取生長至三葉一心時(shí)期的棉花幼苗進(jìn)行處理,將棉花根系分別放置于0.2 mol L–1NaCl和100 μmol L–1ABA溶液中, 幼苗葉片分別噴施相同濃度的NaCl和ABA, 同時(shí)用等體積的雙蒸水處理棉花幼苗作為對照。分別將處理0 h、1 h、4 h、8 h和12 h的試驗(yàn)組和對照組幼苗輕輕取出, 于清水中洗凈根系和葉片, 用吸水紙擦干水分后迅速放置在液氮中,隨后保存于–80℃冰箱待用。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取0.1 g棉花或擬南芥幼嫩葉片, 參照天根植物多糖多酚RNA試劑盒(Tiangen Biotech, DP441)說明書進(jìn)行總RNA提取。RT-qPCR參照2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix (TransGen, 中國)說明書進(jìn)行。RT-qPCR反應(yīng)程序如下: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃10 s, 60℃ 35 s, 40個(gè)循環(huán), 采用2–ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量。其中棉花內(nèi)參基因?yàn)镚hUB7、擬南芥內(nèi)參基因?yàn)锳tACTIN2, 引物序列見表1。

表1 本研究所使用的引物信息表Table 1 Primers used for vector construction and RT-qPCR

1.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫處理

將表面消毒的野生型和GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥種子置于4℃培養(yǎng)箱春化2 d, 隨后將種子分別點(diǎn)播于滅菌的1/2 MS和1/2 MS+0.12 mol L–1NaCl培養(yǎng)基上, 放置在人工氣候室培養(yǎng), 3 d后密切觀察并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。

野生型和GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗分別種植于同一個(gè)營養(yǎng)缽的兩側(cè), 對生長3周左右的擬南芥進(jìn)行鹽脅迫處理, 在營養(yǎng)缽中澆灌0.2 mol L–1NaCl溶液, 直至營養(yǎng)土吸水完全飽和。2 d后密切觀察擬南芥的生長表型, 并統(tǒng)計(jì)擬南芥幼苗的存活率。

1.5 VIGS和棉花植株的鹽脅迫處理

VIGS技術(shù)參照Gao等[20]的方法, 擴(kuò)增GhTINY2的C端cDNA片段, 將其構(gòu)建至TRV:00載體中, 獲得TRV:GhTINY2載體, 并通過電擊法將載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中, 載體構(gòu)建引物見表1。分別取注射TRV:00及TRV:GhTINY2菌液的幼苗葉片, 利用RT-qPCR檢測GhTINY2基因的沉默效果。隨后將TRV:00和TRV:GhTINY2幼苗各25株放置于ddH2O和0.4 mol L–1NaCl溶液中, 2 d后密切觀察幼苗的生長狀態(tài)。

1.6 擬南芥和棉花葉片生理指標(biāo)的測定

分別取對照組和0.2 mol L–1NaCl處理1周后的擬南芥葉片, 以及TRV:00和TRV:GhTINY2植株用0.2 mol L–1NaCl處理1周后的棉花葉片, 用于測定鹽脅迫處理后各標(biāo)志性生理指標(biāo), 包括丙二醛(MDA)、可溶性糖、脯氨酸和葉綠素含量。具體方法參照Heath等[21]、Bates等[22]、王學(xué)奎和黃見良[23]。

1.7 離體葉片失水率

在正常澆水組中選擇3片大小一致的擬南芥葉片, 用吸水紙將葉片表面水分和雜質(zhì)擦拭干凈, 天平稱量并記錄初始鮮重。葉片正面朝上放置在培養(yǎng)皿中, 在25℃、相對濕度40%～50%的實(shí)驗(yàn)室條件下風(fēng)干, 并在20、40和60 min后稱重, 記錄數(shù)據(jù)并計(jì)算。按照以下公式計(jì)算葉片失水率[24]。葉片失水率(%)=(初始重量–處理后葉片重量)/(初始重量)×100%。

1.8 轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)錄組測序

取培養(yǎng)基中生長10 d的擬南芥幼苗, 迅速放入液氮中, 將樣品送華大基因科技有限公司進(jìn)行建庫、測序和基本分析。差異基因的篩選條件設(shè)置為差異倍數(shù)≥2,P≤0.05。

1.9 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)及各生理指標(biāo)檢測均進(jìn)行3次獨(dú)立試驗(yàn), 并設(shè)置至少3個(gè)技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差, 采用Student’st檢驗(yàn)方法(*,P<0.05; **,P<0.01)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析; 使用軟件GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhTINY2受鹽脅迫誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)

為了解棉花在鹽脅迫處理下GhTINY2的表達(dá)模式, 首先利用并分析了棉花在線數(shù)據(jù)庫(http://grand.cricaas.com.cn/page/tools/expressionVisualization)中鹽脅迫處理后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)GhTINY2在鹽處理1 h、3 h和12 h后均受NaCl誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)(圖1-A)。隨后采用RT-qPCR分析棉花品種‘Jin 668’在鹽脅迫和ABA處理下GhTINY2的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn),GhTINY2的表達(dá)量在NaCl處理1 h、8 h和12 h后也呈顯著下調(diào)表達(dá)趨勢(圖1-B), 而ABA處理后GhTINY2的表達(dá)無明顯變化(圖1-C), 表明GhTINY2可參與調(diào)控棉花對鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng), 但這一調(diào)控過程可能不依賴于ABA信號路徑。

圖1 GhTINY2受NaCl和ABA誘導(dǎo)的表達(dá)模式Fig. 1 Relative expression pattern of GhTINY2 induced by NaCl and ABA

2.2 鹽脅迫下超表達(dá)GhTINY2抑制種子萌發(fā)

在前期研究中已創(chuàng)制了2個(gè)GhTINY2超表達(dá)擬南芥株系[18]。為研究GhTINY2在鹽脅迫響應(yīng)中的作用, 本研究選擇了T3代轉(zhuǎn)基因純系(GhTINY2#17、GhTINY2#23)進(jìn)行鹽脅迫處理試驗(yàn)。種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果顯示, 在正常生長條件下,GhTINY2超表達(dá)擬南芥與野生型(WT)的種子萌發(fā)率無統(tǒng)計(jì)差異(圖2-A, B);在含NaCl的培養(yǎng)基中, WT的種子萌發(fā)率則顯著高于GhTINY2株系, 在含NaCl培養(yǎng)基中萌發(fā)14 d后,WT萌發(fā)率約為60%, 而GhTINY2超表達(dá)擬南芥的種子萌發(fā)率僅為18%～20% (圖2-A, C), 表明GhTINY2的超量表達(dá)抑制了擬南芥種子萌發(fā), 可能負(fù)調(diào)控植株的鹽脅迫抗性。

圖2 GhTINY2抑制鹽脅迫下的擬南芥種子萌發(fā)Fig. 2 Overexpression of GhTINY2 inhibited seed germination in Arabidopsis under salt stress

2.3 超表達(dá)GhTINY2削弱擬南芥鹽脅迫抗性

將野生型和GhTINY2超表達(dá)擬南芥種植于營養(yǎng)土中, 在正常生長條件下, 野生型與GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥均可正常生長存活; 在營養(yǎng)土中澆灌0.2 mol L-1NaCl溶液1周后,GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥出現(xiàn)嚴(yán)重的葉片萎蔫發(fā)黃直至死亡的表型, 而大多數(shù)WT植株仍可正常存活(圖3-A)。存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 隨著鹽脅迫處理時(shí)間的延長,GhTINY2植株存活率大幅下降并顯著低于WT (圖3-B)。此外, 植株離體葉片的失水率結(jié)果顯示, 隨著葉片離體時(shí)間的延長, WT和GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片失水率均明顯增加, 但GhTINY2植株中失水率顯著高于WT(圖3-C)。說明超表達(dá)GhTINY2可明顯削弱植株的鹽脅迫抗性。

圖3 GhTINY2負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的鹽脅迫抗性Fig. 3 Overexpression of GhTINY2 decreased resistance to NaCl in Arabidopsis

2.4 鹽脅迫下超表達(dá)GhTINY2對MDA、可溶性糖、脯氨酸和葉綠素含量的影響

為驗(yàn)證GhTINY2在負(fù)調(diào)控植株鹽脅迫抗性中的功能, 分別測定了GhTINY2超表達(dá)擬南芥中的各生理指標(biāo), 包括丙二醛(MDA)、可溶性糖、脯氨酸和葉綠素含量。MDA是常用的膜脂過氧化指標(biāo), 可反映植物細(xì)胞的受損程度[21]。MDA含量測定結(jié)果表明,在正常生長條件下, WT和GhTINY2超表達(dá)擬南芥中的MDA含量無明顯差異, 但在鹽脅迫下,GhTINY2植株中MDA含量極顯著高于WT (圖4-A)。在高鹽等非生物脅迫下, 植物細(xì)胞通過積累可溶性糖、脯氨酸等化合物以提高植株抗逆性[25]。含量測定結(jié)果顯示, 正常生長條件下, WT和GhTINY2超表達(dá)擬南芥葉片中可溶性糖和脯氨酸含量維持在較低水平且無明顯差異; NaCl處理后, 這些物質(zhì)在WT中的積累水平則顯著高于GhTINY2植株(圖4-B, C)。此外葉綠素含量測定結(jié)果也表明鹽脅迫條件下,GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥中葉綠素分解水平顯著高于WT (圖4-D)。因此, 這些結(jié)果說明GhTINY2可通過抑制可溶性糖和脯氨酸等物質(zhì)的積累、加速葉綠素的分解來削弱植株的抗鹽能力。

圖4 鹽脅迫下GhTINY2超表達(dá)擬南芥的各生理指標(biāo)含量的測定Fig. 4 Determination of physiological indexes in GhTINY2-overexpression plants under salt stress

2.5 超表達(dá)GhTINY2擬南芥中RNA-seq數(shù)據(jù)分析

在對GhTINY2超表達(dá)擬南芥進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測序分析中, 鑒定到了1298個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs) (圖5-A)。對這1298個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn), DEGs可富集到“苯丙烷合成(Phenylpropanoid biosynthesis)”、“MAPK信號路徑(MAPK signaling pathway)”、“卟啉和葉綠素代謝(Porphyrin and chlorophyll metabolism)”、“苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)”、“角質(zhì)和蠟質(zhì)合成(Cutin, suberine and wax biosynthesis)”、“光合作用碳固定(Carbon fixation in photosynthetic organisms)”、“激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)”等多個(gè)代謝路徑中(圖5-B), 推測GhTINY2可能通過調(diào)控上述代謝路徑參與到鹽脅迫響應(yīng)中。對DEGs進(jìn)行GO分類也顯示,GhTINY2超表達(dá)擬南芥中大量DEGs參與到“刺激響應(yīng)”等生物過程中(圖5-C)。對KEGG富集獲得的多個(gè)代謝路徑中的DEGs進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 625個(gè)基因在GhTINY2植株中均呈明顯的下調(diào)表達(dá)趨勢, 包括苯丙烷路徑參與木質(zhì)素合成的過氧化物酶基因PRX52(AT5G05340)、參與角質(zhì)和蠟質(zhì)合成的P450基因CYP86A4(AT1G01600)、參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的SAUR4(AT4G34800)、SPL5(AT3G15270)、SPL13(AT5G50570)等(圖6)。

圖5 GhTINY2超表達(dá)擬南芥的RNA-seq分析Fig. 5 Analysis of RNA-seq in GhTINY2-overexpression Arabidopsis

2.6 GhTINY2超表達(dá)擬南芥中鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析

采用RT-qPCR檢測了擬南芥中多個(gè)鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá), 結(jié)果顯示在鹽脅迫條件下,GhTINY2植株中鹽脅迫標(biāo)志基因AtRD20、AtRD22和AtRD26以及脯氨酸合成基因AtP5CS1和AtP5CS2的表達(dá)量均顯著低于WT, 而脯氨酸降解基因AtPRODH2的表達(dá)水平則顯著高于WT (圖7-A, B); 且在正常條件下,GhTINY2超表達(dá)擬南芥中AtRD20、AtRD26、AtP5CS1和AtP5CS2的表達(dá)水平也均顯著低于WT(圖7-A, B)。表明GhTINY2可通過調(diào)控上述基因的表達(dá)削弱植物的鹽脅迫抗性。

圖7 GhTINY2超表達(dá)擬南芥中鹽脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)分析Fig. 7 Relative expression analysis of gene involved in salt stress response in GhTINY2-overexpression Arabidopsis

2.7 沉默GhTINY2表達(dá)增強(qiáng)棉花的鹽脅迫抗性

為分析GhTINY2在棉花中的生物學(xué)功能, 本研究采用VIGS技術(shù)沉默棉花中GhTINY2的表達(dá)水平,RT-qPCR試驗(yàn)結(jié)果顯示,TRV:GhTINY2植株中GhTINY2的表達(dá)水平顯著低于TRV:00(圖8-A)。對TRV:GhTINY2和TRV:00植株進(jìn)行鹽脅迫處理發(fā)現(xiàn),在ddH2O中, 二者生長狀態(tài)無明顯差異; 在高濃度鹽溶液中處理3 d后,TRV:00植株所有葉片已明顯萎蔫枯黃, 而TRV:GhTINY2植株葉片大部分仍保持舒展?fàn)顟B(tài)(圖8-B)。此外, 本研究測定了TRV:00和TRV:GhTINY2植株在鹽脅迫下的生理指標(biāo), 結(jié)果顯示,TRV:GhTINY2植株葉片中的葉綠素和脯氨酸含量均顯著高于TRV:00(圖8-C, D)。表明GhTINY2在棉花中同樣負(fù)調(diào)控鹽脅迫抗性。

(圖8)

圖8 在棉花中沉默GhTINY2可增強(qiáng)鹽脅迫抗性Fig. 8 Down-regulation of GhTINY2 increased salt tolerance in cotton

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子是真核生物轉(zhuǎn)錄起始過程所必需的蛋白因子, 這一類調(diào)控因子通過與啟動(dòng)子內(nèi)特異的順式作用元件相結(jié)合, 進(jìn)而對靶標(biāo)基因起激活或者抑制轉(zhuǎn)錄的作用[26]。近年來, 越來越多的研究聚焦于各基因家族的轉(zhuǎn)錄因子在植物脅迫響應(yīng)中的作用,其中AP2/ERF基因作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 廣泛參與到植物初生代謝、次生代謝、激素信號傳導(dǎo)、生長發(fā)育調(diào)控及各種逆境脅迫應(yīng)答等生理過程中[14]。本研究通過分析棉花在高鹽脅迫下的表達(dá)譜數(shù)據(jù), 鑒定到受鹽誘導(dǎo)顯著下調(diào)表達(dá)的GhTINY2基因(圖1), 隨后發(fā)現(xiàn)GhTINY2異源表達(dá)的擬南芥植株對鹽脅迫表現(xiàn)為更加敏感(圖2和圖3),利用VIGS技術(shù)將GhTINY2基因沉默后的棉花植株則表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗鹽性(圖8), 說明GhTINY2是一個(gè)響應(yīng)高鹽脅迫的負(fù)調(diào)控因子。有相關(guān)研究報(bào)道,GhTINY2是一個(gè)同步參與生長發(fā)育調(diào)控和生物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子, GhTINY2既激活WRKY51的表達(dá)促進(jìn)水楊酸合成進(jìn)而增強(qiáng)植株對黃萎病菌的抗性, 又與BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子BZR1互作,通過削弱BR信號從而抑制棉花和擬南芥的正常生長[27]。對于GhTINY2在擬南芥中超量表達(dá)后既阻礙植株生長又負(fù)調(diào)控鹽脅迫抗性的表型, 類似的研究在JcDREB2異源超表達(dá)的水稻中也有報(bào)道,JcDREB2一方面通過抑制赤霉素(gibberellin, GA)合成基因表達(dá)導(dǎo)致水稻生長受阻, 另一方面也下調(diào)抗鹽基因削弱植株的抗鹽性[28], 這表明AP2/ERF基因可同時(shí)參與植物的多個(gè)生理過程的調(diào)控。

目前, 已有多個(gè)AP2/ERF基因被證明是響應(yīng)高鹽、干旱、高溫等非生物逆境脅迫的正調(diào)控因子[29-31]。例如, 在大豆根系中鑒定到一個(gè)高量表達(dá)的AP2/ERF基因GsERF7, GsERF7蛋白被GsSnRK1磷酸化后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中, 二者協(xié)同提高大豆的鹽脅迫和堿脅迫耐受性[32]; 在水稻根部鑒定到一個(gè)受鹽和過氧化氫特異性誘導(dǎo)的AP2/ERF基因SERF1,SERF1被MAPK5磷酸化后增強(qiáng)了對靶基因的轉(zhuǎn)錄活性, 進(jìn)而提高水稻的耐鹽性[33]。但也有少數(shù)AP2/ERF基因成員負(fù)調(diào)控鹽脅迫抗性的研究報(bào)道,例如長毛怪柳中的乙烯響應(yīng)因子ThERF1可通過特異結(jié)合多個(gè)靶基因啟動(dòng)子上的GCC-box和DRE元件抑制POD和SOD基因的表達(dá), 導(dǎo)致活性氧清除能力下降進(jìn)而削弱植株的抗鹽能力[34]; 水稻中的鹽脅迫迅速應(yīng)答基因OsERF922通過增加細(xì)胞中的Na+/K+比例進(jìn)而導(dǎo)致幼苗抗鹽性下降[35]。本研究發(fā)現(xiàn)GhTINY2受鹽誘導(dǎo)明顯下調(diào), 表明棉花在高鹽脅迫條件下可能通過某種方式抑制負(fù)調(diào)控因子GhTINY2的表達(dá)從而保證植株鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)的有效激活。

大量研究證明多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)植物的抗旱性或抗鹽性是依賴于ABA信號路徑的, 例如水稻bZIP23[36]、大豆GmNF-YC14、GmNF-YA16和GmNF-YB2[37]、擬南芥ABI4[38]等, 而在探究GhTINY2的抗鹽機(jī)制過程中, 本研究發(fā)現(xiàn)GhTINY2不受ABA的誘導(dǎo), 推測GhTINY2負(fù)調(diào)控棉花抗鹽性可能不依賴于ABA信號通路(圖1)。隨后分析了GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 發(fā)現(xiàn)DEGs參與到了“刺激響應(yīng)”等生物過程中(圖5), 這一結(jié)果證實(shí)了GhTINY2在生物和非生物脅迫響應(yīng)過程中的功能。KEGG富集分析也發(fā)現(xiàn)多個(gè)DEGs富集到“卟啉和葉綠素代謝” “光合作用碳固定”等多個(gè)信號路徑中(圖5), 且這些DEGs在GhTINY2轉(zhuǎn)基因擬南芥中多呈下調(diào)表達(dá)(圖6), 在高鹽脅迫下GhTINY2植株中的葉綠素積累量也顯著減少(圖4), 這暗示著GhTINY2可能是通過削弱葉綠素合成代謝來負(fù)調(diào)控植株的抗鹽性的。此外, 鹽處理后GhTINY2植株中脯氨酸的積累水平顯著減少(圖4)、脯氨酸合成基因P5CS1和P5CS2的表達(dá)量顯著下降(圖7), 因此也推測GhTINY2負(fù)調(diào)控抗鹽性可能與脯氨酸合成路徑有關(guān)。

近年來有多項(xiàng)研究表明, 苯丙烷代謝路徑和MAPK信號路徑的激活均可提高植物的抗鹽性[39-40]。例如, 綠藻的DsMAPKKK1/2/3/9/10/17-DsMEK1-X2-DsMAPK1信號級聯(lián)在鹽脅迫下通過調(diào)節(jié)DsGPDH表達(dá)促進(jìn)甘油的合成, 從而提高植株抗鹽性[41]; 苔蘚DREB基因BaDBL1通過激活苯丙烷路徑多個(gè)基因的表達(dá)促進(jìn)木質(zhì)素積累, 進(jìn)而介導(dǎo)抗鹽性[42]。本研究的轉(zhuǎn)錄組分析顯示GhTINY2超表達(dá)擬南芥中這2個(gè)代謝路徑的多個(gè)DEGs呈下調(diào)表達(dá)趨勢(圖5和圖6), 這均證實(shí)了GhTINY2在鹽脅迫響應(yīng)中的功能。但GhTINY2負(fù)調(diào)控抗鹽性依賴的代謝通路以及GhTINY2在植物高鹽應(yīng)答過程中直接調(diào)控的靶標(biāo)基因還有待進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。

此外, GhTINY2作為一個(gè)重要的抗病調(diào)節(jié)因子,研究表明GhTINY2的超量表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥的抗病性[27], 但苯丙烷路徑中多個(gè)木質(zhì)素合成相關(guān)基因以及參與角質(zhì)和蠟質(zhì)合成的P450基因在GhTINY2擬南芥中卻呈下調(diào)表達(dá)趨勢(圖6)。這一表型與GhMYB4超表達(dá)棉花、GhLac1干涉棉花以及HCT苜蓿突變體等材料中的表型存在相似性[43-45], 即木質(zhì)素合成基因表達(dá)水平和含量下降卻導(dǎo)致抗病性增強(qiáng), 且上述研究均是以木質(zhì)素含量下降導(dǎo)致細(xì)胞壁完整性變化進(jìn)而觸發(fā)免疫反應(yīng)來加以解釋的, 但GhTINY2是否有相似功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

棉花AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因GhTINY2負(fù)調(diào)控棉花和擬南芥的鹽脅迫抗性,GhTINY2通過下調(diào)多個(gè)抗逆基因表達(dá), 抑制可溶性糖、脯氨酸和葉綠素等物質(zhì)的合成從而削弱植株的抗鹽能力。