利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯GmBADH1基因改變大豆耐鹽性

石宇欣 劉欣玥 孫建強(qiáng) 李曉菲 郭瀟陽 周 雅 邱麗娟,*

1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150030; 2農(nóng)作物基因資源與遺傳改良國家重大科學(xué)工程 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

目前, 世界上約20%的可用耕地面積受土壤鹽漬化影響[1], 大豆耐鹽性的提升可有效利用鹽漬化土壤, 從而拓寬大豆種植面積, 增加大豆產(chǎn)能。非生物脅迫(如干旱、滲透壓、低溫、重金屬、臭氧、紫外線照射等)會(huì)導(dǎo)致植物代謝的改變, 包括光合作用受抑制、活性氧(ROS)生成、膜組織混亂以及營養(yǎng)缺乏等[2]。作為對滲透脅迫的響應(yīng), 甘氨酸甜菜堿通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中的滲透勢來調(diào)節(jié)細(xì)胞水位, 從而導(dǎo)致細(xì)胞耐受。甜菜堿是季銨化合物。具有很高的溶解度, 在生理pH范圍內(nèi)甜菜堿不帶靜電核, 是一個(gè)電中性分子[3]。甜菜堿脫氫酶是甘氨酸的衍生物, 是許多植物體內(nèi)對抗非生物脅迫重要的滲透調(diào)節(jié)劑, 具有穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的作用[4]。BADH(betaine aldehyde dehydrogenase)編碼甜菜堿脫氫酶, 在植物中, 甘氨酸甜菜堿是通過兩步氧化合成的, 先由膽堿加氧酶(CMO)將膽堿催化生成甜菜堿醛, 而后甜菜堿醛在甜菜堿脫氫酶(BADH)的催化作用下形成甜菜堿[5]。非生物脅迫下, 植物細(xì)胞質(zhì)中甜菜堿通過甜菜堿醛積累, 經(jīng)過甜菜堿在滲透途徑的作用, 液泡與細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞與環(huán)境的滲透勢差被平衡, 從而保護(hù)細(xì)胞免受傷害, 降低非生物脅迫帶來的有害影響[6]。因此甜菜堿作為滲透途徑中的應(yīng)激保護(hù)劑,是植物抵抗有害氧化分子的策略之一[7]。1990年Weretilnyk等[8]首次在菠菜中將BADH基因克隆出來, 后續(xù)實(shí)驗(yàn)也證明其在抗旱耐鹽等逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。目前在菠菜、大麥[9]、香蕉[10]、茶樹[11]等植物中均克隆出BADH基因。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將BADH基因轉(zhuǎn)入番茄[12]、玉米[13-14]、羽衣甘藍(lán)[15]中, 在不同程度上均提高了其對非生物脅迫的抵抗能力。2013年李秀英和王丕武[16]將BADH基因利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入到大豆中, 用于提高萌發(fā)期大豆抗旱、抗鹽堿的能力, 最終獲得了與未轉(zhuǎn)化受體相比耐鹽性顯著提高的轉(zhuǎn)基因株系。眾多的研究表明,BADH在增強(qiáng)植物對于非生物脅迫的抵抗能力具有重要作用, 但是BADH基因?qū)τ诖蠖乖邴}脅迫中的適應(yīng)性作用以及對于大豆不同時(shí)期的耐鹽調(diào)控機(jī)制尚未可知。

簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列-核酸蛋白酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR-Cas9)為靶向基因組編輯和基因功能的研究提供了一種有效的方法, 已經(jīng)成為最先進(jìn)的系統(tǒng)之一[17], 并為反向遺傳學(xué)研究提供了新思路。相較于傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)基因敲除不完整、外源基因隨機(jī)插入的缺點(diǎn), CRISPR/Cas9系統(tǒng)相對穩(wěn)健, 可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)性狀的精準(zhǔn)改良, 從而獲得具有特定優(yōu)異性狀的育種資源[18]。目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)廣泛用于多種作物, 如水稻、小麥、玉米等主要作物。Zhang等[19]利用基因編輯靶向突變OsALS基因的密碼子, 產(chǎn)生了對ALS抑制除草劑具有廣譜耐受性的水稻植株。Li等[20]利用CRISPR/ Cas9技術(shù)編輯TaNP1三個(gè)同源等位基因, 獲得小麥雄性不育突變體。Luo等[21]利用CRISPR系統(tǒng)敲除YIGE1, 玉米雌蕊花序分生組織大小、穗長均減小。Jacobs等[22]在2015年首次報(bào)道了利用CRISPR/ Cas9技術(shù)對大豆進(jìn)行定點(diǎn)誘變, 這為大豆基因組編輯奠定了良好基礎(chǔ)。此后CRISPR系統(tǒng)被廣泛用于大豆的基因功能驗(yàn)證和優(yōu)異品種改良。

本研究中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建敲除載體,發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行載體驗(yàn)證, 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將CRISPR/Cas9表達(dá)載體引入JACK品種中, 定點(diǎn)敲除GmBADH1基因, 通過分子檢測篩選純合等位突變, 并分析突變體對大豆出苗期和苗期耐鹽性狀的影響, 為探究GmBADH1基因在不同時(shí)期對于耐鹽性狀的調(diào)控提供理論基礎(chǔ), 對于進(jìn)一步解析GmBADH1基因功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與器材

大豆品種JACK為轉(zhuǎn)化受體, 2021年7月獲得CRISPR/Cas9編輯的T0轉(zhuǎn)基因植株, T1、T2在溫室種植, T3在順義試驗(yàn)站種植, 用于繁種以及表型鑒定。

1.2 RNA提取和qRT-PCR分析

選取飽滿的野生型種子分成2組進(jìn)行萌發(fā), 萌發(fā)長根后, 以150 mmol L–1鹽溶液和水溶液進(jìn)行處理。處理后分別在2 h、8 h、24 h取根、莖、葉3個(gè)組織的RNA樣品。利用天根生化科技(北京)有限公司RNA試劑盒提取植物組織RNA。北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyScript一步法gRNA去除及cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋20倍后作為模板用于熒光定量。利用Primer5設(shè)計(jì)熒光定量引物,Actin-18g290800(Glyma18g52780)為內(nèi)參基因[23-24]。北京全式金生物技術(shù)有限公司PerfectStart Green qPCR SuperMix (+Dye II)試劑盒進(jìn)行熒光定量。qRT-PCR的反應(yīng)體系為模板2 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 7.2 μL, PerfectStart Green qPCR SuperMix (+Dye II) 10 μL。程序參照說明書, 每個(gè)處理3個(gè)重復(fù), 并使用2–ΔΔCT方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。Excel表格進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及作圖。相關(guān)引物見表1。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體構(gòu)建

利用NCBI查找水稻BADH1基因CDS序列, 參考序列為大豆參考基因組GlycinemaxWm82.a2.v1。通過BLAST功能找到大豆BADH1基因的CDS序列,利用CRISPRv2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR)設(shè)計(jì)基因GmBADH1的sgRNA,位于基因的第一外顯子上,GmBADH1靶點(diǎn)序列為sgRNA-BADH1: AAGTCCCCGTCCTCAAGAATCGG,PAM序列為CGG, 通過NCBI進(jìn)行BLAST檢測靶點(diǎn)特異性, 在線網(wǎng)站(https://cctop.cos.uni-heidelberg/預(yù)測脫靶效應(yīng), 將所構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體, 利用橋式PCR將擬南芥U6啟動(dòng)子序列、sgRNA和zCas9依次連接后, 克隆到載體pBSE401質(zhì)粒,In-fusion構(gòu)建敲除載體pGmBADH1-g1, 利用熱激轉(zhuǎn)化將編輯載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌中, 發(fā)根農(nóng)桿菌K599進(jìn)行載體驗(yàn)證。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化

采用電擊轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中, 選擇大豆品種JACK為遺傳轉(zhuǎn)化材料。轉(zhuǎn)化由天津吉諾沃生物科技有限公司完成。挑選外表飽滿、光滑的大豆種子于培養(yǎng)皿中, 75%的酒精清洗后擦干, 放入玻璃培養(yǎng)皿。通風(fēng)櫥內(nèi)滅菌后, 在超凈臺中放置30 min, 加無菌水浸泡9～16 h使種子萌發(fā)。農(nóng)桿菌充分活化至OD650為0.6～0.7, 用手術(shù)刀切去種子1/2下胚軸, 將胚軸縱向切開, 去掉頂芽及側(cè)芽,在生長點(diǎn)輕輕劃4～6道傷口, 將子葉節(jié)外植體放在重懸的農(nóng)桿菌菌液中, 放入25℃培養(yǎng)箱中侵染2 h。侵染完成后用無菌濾紙吸干多余的菌液, 將浸染后的外植體有傷口一側(cè)朝下平鋪于濾紙上, 26℃黑暗條件下共培養(yǎng)2～5 d, 光照條件下共培養(yǎng)1 d, 將長出的下胚軸切除, 放入組培室中26℃、16 h光照、培養(yǎng)5 d。當(dāng)伸長芽至3～4 cm時(shí), 從基部將伸長芽與叢生芽分開, 接種至生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)。待生根2周后, 煉苗3～5 d, 利用Bar試紙條篩選陽性植株。

1.5 轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選及突變類型分析

利用CTAB法[25]提取T0、T1、T2轉(zhuǎn)基因植株全基因組DNA作為模板, 結(jié)合靶點(diǎn)周圍設(shè)計(jì)的特異性檢測引物進(jìn)行擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程樓測序平臺進(jìn)行測序。通過峰圖判斷突變類型, 野生型與純合突變?yōu)閱畏? 雜合突變在靶點(diǎn)之后顯示亂峰, 將野生型與純合突變進(jìn)行比對, 可進(jìn)一步確定靶標(biāo)的變異。利用CAS9引物可進(jìn)一步篩選無轉(zhuǎn)基因成分的靶向突變體(檢測引物D-GmBADH1-F/R與CAS9引物zCAS9-F/R見表1) 。

1.6 耐鹽表型鑒定

分別對純合突變材料以及野生型材料進(jìn)行出苗期和苗期的耐鹽鑒定, 每種編輯類型選擇至少來自3個(gè)株系的種子, 種于裝有蛭石的8 cm × 8 cm × 6 cm的小花盆中, 每個(gè)株系種3個(gè)小花盆, 每個(gè)小花盆種10粒, 以野生型JACK為陰性對照, 以劉謝香等[26]鑒定出的耐鹽材料中黃39與鹽敏感材料NY27-38為陽性對照。出苗期參照劉謝香等[26]以150 mmol L–1NaCl處理, 并以RO水為對照處理組, 從第4天開始記錄成苗數(shù), 直至第15天評級; 苗期參照Guan等[27], 于真葉完全展開后(10 d), 每隔3～4 d進(jìn)行一次鹽處理, 共處理3次, 鹽濃度為200 mmol L–1, 第3次處理后(約20 d)進(jìn)行評級, 評定標(biāo)準(zhǔn)如表2。

表2 鹽脅迫后大豆出苗期和苗期的鹽害癥狀Table 2 Symptoms of soybean at emergence and seeding stages under salt stress

2 結(jié)果與分析

2.1 GmBADH1基因表達(dá)模式分析

2.1.1GmBADH1基因在不同組織中的表達(dá)模式分析 為了探究不同組織中GmBADH1基因的表達(dá)情況, 分別以JACK多個(gè)組織的cDNA為模板, 通過qRT-PCR確定基因表達(dá)量。結(jié)果顯示GmBADH1基因在各個(gè)組織中均有表達(dá), 根中的表達(dá)量更高(圖1-A)。

圖1 GmBADH1基因表達(dá)模式分析Fig. 1 Relative expression pattern of GmBADH1 genes

圖2 GmBADH1的gRNA靶點(diǎn)和pBSE401-GmBADH1-g6表達(dá)載體重組示意圖Fig. 2 Target sites of the gRNA in the GmBADH1 gene and recombining diagram of the pBSE401-GmBADH1-g6 vector

2.1.2GmBADH1基因在不同鹽處理時(shí)間下的表達(dá)模式分析 為了了解GmBADH1基因在鹽脅迫處理下的基因表達(dá)量差異, 以鹽脅迫后各組織的cDNA為模板, 進(jìn)行qRT-PCR以確定其表達(dá)模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)根、葉組織在鹽處理后該基因表達(dá)量顯著高于水處理組, 說明該基因響應(yīng)鹽脅迫(圖1-B)。

2.2 CRISPR/Cas9載體構(gòu)建

為了研究大豆GmBADH1的基因功能, 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對GmBADH1基因進(jìn)行敲除, 基于大豆參考基因組(Glyma.Wm82.a2.v1)序列, 在該基因第一外顯子處設(shè)計(jì)sgRNA, 并將其連接到CRISPR/Cas9的載體, 通過發(fā)根農(nóng)桿菌K599檢測編輯載體活性。結(jié)合Bar試紙條檢測, 共獲得3個(gè)陽性株系。

2.3 GmBADH1功能缺失突變體的篩選與鑒定

利用CTAB法分別提取T1和T2幼嫩葉片DNA,PCR擴(kuò)增靶標(biāo)位點(diǎn), 測序分析突變類型。結(jié)果表明,T1共檢測127株轉(zhuǎn)基因植株中, 有8株發(fā)生了突變,突變率為6.3%; T2代共檢測108株轉(zhuǎn)基因植株, 有10株純合植株, 陽性率為9.3%。在3個(gè)不同株系, 共檢測到3種主要類型的突變。將獲得的不同類型的純合突變體分別命名為BADH1-L1、BADH1-L3、BADH1-L4。經(jīng)測序分析表明, 突變植株BADH1-L1在靶點(diǎn)處插入了1個(gè)堿基, 導(dǎo)致翻譯的氨基酸提前終止, 僅編碼32個(gè)氨基酸; 突變植株BADH1-L3在靶點(diǎn)附近插入9個(gè)堿基, 替換了2個(gè)堿基, 有7個(gè)氨基酸發(fā)生變化; 突變植株BADH1-L4在靶點(diǎn)附近缺失19個(gè)堿基, 導(dǎo)致氨基酸翻譯提前終止, 僅編碼29個(gè)氨基酸(圖3-A和表3)。利用PFAM網(wǎng)站預(yù)測, 該基因只有一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域Aldedh, 位于第18到485位氨基酸之間。突變體BADH1-L1、BADH1-L4短蛋白的產(chǎn)生導(dǎo)致了功能結(jié)構(gòu)域的缺失, 突變植株BADH1-L3的移碼突變導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域被破壞。綜合3代檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的GmBADH1的基因突變可以從T1穩(wěn)定的遺傳到T3, 并保持相同類型(圖3)。

圖3 T1和T2純合突變體篩選Fig. 3 Screening for homozygous mutation in T1 and T2 generation

表3 純合突變體編輯基因型Table 3 Editing genotypes of homozygous mutants

表4 CRISPR介導(dǎo)BADH1基因T1～T2靶向突變植株數(shù)Table 4 The number of CRISPR-mediated T1–T2 targeted mutant plants of BADH1 gene

2.4 潛在脫靶位點(diǎn)分析

為了確定CRISPR/Cas9表達(dá)載體是否存在潛在非靶點(diǎn)處變異對表型影響的可能性, 利用CCTOP[28](https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043/)對潛在的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測, 以sgRNA-BADH1為目標(biāo)預(yù)測, 共預(yù)測到19個(gè)與目標(biāo)靶點(diǎn)相似的潛在靶點(diǎn), 其中4個(gè)位于基因編碼區(qū)(表5)。根據(jù)這4個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物, 以T3純合突變體基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 經(jīng)PCR測序分析發(fā)現(xiàn), 并未檢測到潛在脫靶位點(diǎn)的變異, 說明sgRNA僅對靶標(biāo)進(jìn)行了特異性編輯。

表5 BADH1-Target的潛在的脫靶位點(diǎn)預(yù)測Table 5 Potential miss site prediction of BADH1-Target

2.5 無轉(zhuǎn)基因植株篩選

為了獲得具有純合突變并不含T-DNA元件的轉(zhuǎn)基因植株, 排除Bar和Cas9的潛在干擾, 首先利用PAT/Bar試紙條鑒定選擇性標(biāo)記基因Bar, 獲得14個(gè)陽性植株(圖4-A), 并使用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測T-DNA上的CAS9。結(jié)果如圖4-B所示, 14個(gè)陽性植株共獲得11個(gè)無Cas9序列的突變體(表6)。

圖4 陽性鑒定與轉(zhuǎn)基因成分鑒定Fig. 4 Positive identification and identification of transgenic components

表6 無轉(zhuǎn)基因檢測Table 6 Transgene-clenn homozygous mutants

2.6 突變體耐鹽表型分析

為探究GmBADH1基因正向調(diào)控鹽脅迫, 對突變體以及野生型植株進(jìn)行了出苗期和苗期的耐鹽鑒定。出苗期耐鹽鑒定顯示, 突變植株BADH1-L1、BADH1-L3、BADH1-L4較野生型相比耐鹽性均下降;苗期耐鹽鑒定結(jié)果顯示, 3種突變體耐鹽性與野生型相比無差異, 說明GmBADH1的變異僅對出苗期耐鹽性進(jìn)行調(diào)控, 而與苗期耐鹽性無關(guān)(表7和圖5)。

圖5 出苗期突變體耐鹽表型鑒定Fig. 5 Identification of salt tolerance phenotype of mutant at seedling stage

表7 GmBADH1純合植株耐鹽鑒定Table 7 Salt tolerance of GmBADH1 homozygous plants

3 討論

近年來隨著基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展, CRISPR/Cas9系統(tǒng)已被廣泛用于包括大豆在內(nèi)的各種作物基因功能研究。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)外源基因在植物染色體中的隨機(jī)整合可能會(huì)導(dǎo)致植物內(nèi)源基因的破壞、基因沉默或其他不良現(xiàn)象, 因此傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)常常受限。Jacobs等[22]首次報(bào)道了利用CRISPR/Cas9技術(shù)對大豆進(jìn)行定點(diǎn)誘變, 為大豆基因組編輯奠定了良好基礎(chǔ); Han等[29]利用CRISPR/Cas9敲除開花基因E1, 獲得早花純合突變體, 為培育適合高緯度地區(qū)的早熟轉(zhuǎn)基因受體提供了物質(zhì)支持; Cheng等[30]利用CRISPR/Cas9介導(dǎo)GmLHY基因定點(diǎn)突變降低了大豆株高、并縮短了節(jié)間長度, 為解析大豆株高調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的潛在機(jī)制提供了基礎(chǔ);GmIPK1基因[31]編輯獲得純合突變體, 降低了大豆種子中植酸含量;GIGANTEA同源基因編輯產(chǎn)生功能缺失等位變異能夠同時(shí)提高大豆對鹽的耐性和促進(jìn)大豆早花早熟[32]。目前并沒有研究報(bào)道將CRISPR/Cas9技術(shù)用于GmBADH1基因以探究其與大豆耐鹽性之間的聯(lián)系, 本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行定點(diǎn)編輯,并獲得3種穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料。

甜菜堿脫氫酶在抵御非生物脅迫上的重要作用,已在多種作物中有所報(bào)道。將BADH基因轉(zhuǎn)化到鹽敏感的番茄材料中提高番茄對鹽的耐受性[33]。OsBADH1轉(zhuǎn)化到煙草中提高了煙草耐鹽性[34]。RNAi[35]沉默OsBADH1基因獲得的突變體與野生型相比耐鹽性下降。由此可見,BADH1基因可能正向調(diào)控植物對鹽脅迫的耐受性。本研究對獲得的純合突變體進(jìn)行耐鹽鑒定, 得到了相似的結(jié)論。He等[36]、Fitzgerald等[37]的研究表明OsBADH1基因只調(diào)控水稻發(fā)芽和幼苗階段耐鹽性, 說明不同發(fā)育時(shí)期存在著不同的耐鹽調(diào)控機(jī)制。本研究中對3個(gè)純合突變體分別在出苗期和苗期做耐鹽鑒定, 結(jié)果表明在出苗期均降低了耐鹽性, 而在苗期無影響,這表明GmBADH1主要對大豆出苗期耐鹽性起正向調(diào)控作用。

鹽害脅迫會(huì)造成細(xì)胞滲透勢減小, 因此土壤中的水分很難被植物根部吸收, 導(dǎo)致植物根部缺水,出現(xiàn)生理性脅迫, 產(chǎn)生植株萎蔫葉片枯黃的現(xiàn)象, 說明植株受到脅迫可能與根組織的發(fā)育情況有關(guān)[38]。在本研究中基因表達(dá)分析表明,GmBADH1基因在根、莖、葉中均有表達(dá), 鹽脅迫下,GmBADH1基因在根中表達(dá)量顯著高于水處理組, 說明GmBADH1基因主要響應(yīng)在植株地下部。當(dāng)植株受到土壤給予的鹽害脅迫時(shí), 土壤中大量Na+和Cl–會(huì)從根部向地上部運(yùn)輸, 導(dǎo)致植株受到損傷, 甜菜堿大量合成, 甜菜堿可以阻斷Na+和Cl-向上運(yùn)輸?shù)乃俣群蛿?shù)量, 促進(jìn)K+的運(yùn)輸, 從而減弱鹽害帶給植株的不利影響[39]。

由于基因編輯存在脫靶效應(yīng), 這種效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致染色體重排, 在不完全匹配的基因組處造成損傷,還可能導(dǎo)致功能活性的喪失, 從而導(dǎo)致各種生理信號異常[40]。因此為了減輕這種脫靶效應(yīng)帶來的危害,本研究還利用CCTOP網(wǎng)站對靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測, 在靶點(diǎn)處預(yù)測到4個(gè)發(fā)生在編碼區(qū)的潛在脫靶位點(diǎn), 并對純合敲除株系的全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序發(fā)現(xiàn), 未檢測到潛在的脫靶位點(diǎn), 說明sgRNA僅對靶標(biāo)進(jìn)行了特異性編輯, 這大大減小了脫靶效應(yīng)帶來負(fù)面影響。得到的純合突變體后續(xù)也可以通過育種過程表型篩選來消除脫靶突變或自發(fā)突變[40]。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯GmBADH1基因, 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將載體轉(zhuǎn)入受體JACK中, 經(jīng)轉(zhuǎn)基因檢測共獲得3種可穩(wěn)定遺傳并不含T-DNA插入的功能缺失突變體, 耐鹽鑒定結(jié)果表明大豆缺失GmBADH1基因后在出苗期耐鹽性顯著下降, 而在苗期無影響, 說明該基因主要對大豆出苗期耐鹽性起正向調(diào)控作用, 這為我們深入挖掘大豆不同時(shí)期的耐鹽調(diào)控基因, 提供了依據(jù)。