轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米自交系LG11的獲得及抗性分析

岳潤清 李文蘭 孟昭東

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所 / 小麥玉米國家工程實驗室 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮海北部玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 山東濟(jì)南 250100

玉米是當(dāng)今世界三大作物之一, 用途廣泛, 包括食用、飼料、種用和工業(yè)用途等, 在我國糧食生產(chǎn)中占重要地位。我國玉米種植面積穩(wěn)定在4200萬公頃, 蟲害是影響其產(chǎn)量及品質(zhì)的重要問題之一[1-2]。其中, 亞洲玉米螟是我國各玉米產(chǎn)區(qū)最主要的害蟲之一, 常年發(fā)生面積在2000萬公頃以上[3-5]。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米新品種具有很好的田間抗螟性, 不僅能減少化學(xué)殺蟲劑的使用, 保護(hù)生態(tài)環(huán)境, 還能提高農(nóng)民收入[1-2]。田間雜草與作物競爭水、肥、光能及生長空間, 也是影響玉米產(chǎn)量與品質(zhì)的重要生物限制因子之一。有效控制田間雜草是促進(jìn)糧食增產(chǎn)的重要措施之一[6]。另外, 隨著我國農(nóng)村人口往城市遷移速度的加快, 傳統(tǒng)的人工除草方式變得不現(xiàn)實, 在玉米生長期噴施除草劑解決田間雜草是可行方法。因此, 培育抗蟲耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米新品種具有非常廣闊的應(yīng)用價值和市場潛力。

蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)是一種革蘭氏陽性土壤細(xì)菌, 在芽胞形成過程產(chǎn)生的殺蟲蛋白晶體(insecticidal crystal protein, ICP), 對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等多種害蟲具有特異的殺蟲作用[7]。自1981年第一個Bt殺蟲蛋白基因被克隆和測序以來, 已克隆和分類了993個Bt毒素編碼基因(801個Cry基因、40個Cyt基因和152個Vip基因),其中,Cry基因編碼的Cry蛋白因其強大的生物活性而被廣泛應(yīng)用[8]。目前, 全球應(yīng)用最廣的抗蟲玉米主要是表達(dá)Cry和Vip類殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米, 種植面積達(dá)550萬公頃[9]。大面積持續(xù)種植轉(zhuǎn)基因玉米,會引發(fā)靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性。例如, 草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda對巴西種植的表達(dá)Bt Cry1Ab或Bt Cry1F的玉米產(chǎn)生抗性[10-11], 歐洲玉米螟Ostrinianubilalis對加拿大種植的表達(dá)Bt Cry1F的玉米產(chǎn)生抗性[12]。為了阻止或延緩靶標(biāo)害蟲抗性種群的發(fā)生, 各國學(xué)者提出了抗性治理策略IRM (insect resistance management), 目前應(yīng)用最為廣泛的主要有“高劑量/庇護(hù)所” (high dose/refuge)策略和“多基因” (pyramid)策略[13]。其中, “多基因”策略是指在同一株植物中同時導(dǎo)入2個或多個沒有交互抗性的針對同一靶標(biāo)害蟲的抗蟲基因, 減小轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗性的風(fēng)險[12]。國內(nèi)現(xiàn)有的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米基本都是導(dǎo)入的單一抗蟲基因, 或者通過將含不同單一抗蟲基因的材料雜交, 篩選同時含有2個或以上抗蟲基因的材料, 只有瑞豐125是直接轉(zhuǎn)化的融合基因[14], 除此之外并沒有利用融合基因進(jìn)行抗蟲轉(zhuǎn)基因的報道。

bar基因最初來源于吸水鏈霉菌, 編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinothricinacetyhransferase,PAT), 作用底物是膦絲菌素(phosphinothricin, PPT),屬于除草劑草銨膦的活性成分[15]。草銨膦(glufosinate)是一種廣譜高效、低毒有機磷除草劑,能通過植物的葉片或其他綠色部分被快速吸收, 強烈抑制細(xì)菌和植物的氨基酸生物合成酶—谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的活性, 導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的含量迅速積累, 從而直接抑制光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II反應(yīng), 減少跨膜pH梯度, 使光合磷酸化解偶聯(lián), 隨之葉綠體結(jié)構(gòu)解體, 最后整個植物體死亡。PAT可以催化乙酰輔酶A使除草劑草銨膦的活性成分膦絲菌素PPT的自由氨基發(fā)生乙?；? 從而對PPT解毒, 使之不能抑制GS的活性[15]。目前, 轉(zhuǎn)bar基因的耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米已被廣泛種植, 種植面積達(dá)560萬公頃[9]。

近年來單一性狀轉(zhuǎn)基因作物種植面積比例逐年降低, 復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物種植面積比例逐年攀升,2015年更是達(dá)到了33%的高度, 2018年全球種植聚合抗蟲/耐除草劑玉米達(dá)4780萬公頃[9], 這說明復(fù)合性狀逐漸成為轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)的重要特性。分子聚合方法(構(gòu)建多基因聚合載體)因其較低的篩選工作量以及單位點的插入將是未來開發(fā)復(fù)合性狀的主要策略[16]。本課題使用的抗蟲蛋白是利用人工合成方法將Cry1Ab和Vip3Aa蛋白的主要結(jié)構(gòu)域組合形成的融合蛋白M2cryAb-vip3A, 這2種殺蟲蛋白在進(jìn)化上沒有同源性且殺蟲機理存在差別, 能有效降低靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性的幾率。本研究擬通過轉(zhuǎn)基因方法將m2cryAb-vip3Aa和bar基因串聯(lián)導(dǎo)入受體材料,并以骨干自交系昌7-2為回交親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育,獲得抗蟲耐除草劑且擁有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的轉(zhuǎn)基因玉米新材料, 并對抗蟲性和耐除草劑抗性進(jìn)行分析。研究結(jié)果將豐富現(xiàn)有的抗蟲耐除草劑玉米種質(zhì)資源, 并為玉米田間害蟲防治和雜草治理提供新的解決方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

轉(zhuǎn)基因所用的受體材料為HiIIB, 回交轉(zhuǎn)育親本為昌7-2。qRT-PCR分析利用的組織包括苗期的葉片、根、莖, 吐絲期的根、葉, 成熟期的根、葉、籽粒等, 取樣時每3株為1個重復(fù), 共3次重復(fù), 樣品置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 轉(zhuǎn)化體LG11的獲得

m2cryAb-vip3Aa融合蛋白的分子量和等電點使用“pI/Mw”工具進(jìn)行預(yù)測, 結(jié)構(gòu)域使用SMART和PFAM軟件進(jìn)行預(yù)測。將m2cryAb-vip3Aa連接入載體pCAMBIA3300的XbaI和SacI位點, 構(gòu)建成植物轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA3300+m2cryAb-vip3Aa。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米幼胚轉(zhuǎn)化方法將該表達(dá)載體導(dǎo)入受體材料HiIIB中, 經(jīng)抗性篩選獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株, 再以昌7-2為回交親本進(jìn)行5代回交轉(zhuǎn)育, 篩選獲得優(yōu)異轉(zhuǎn)化體LG11。

1.3 PCR檢測

選取BC4F2、BC5F2代LG11和對照昌7-2的植株幼嫩葉片進(jìn)行基因組DNA提取, 通過普通PCR方法檢測目的基因在基因組中的整合情況。m2cryAbvip3Aa基因引物序列為J1-F: 5'-ATCTCGTCCAGCG TCAGGT-3'和J1-A: 5'-TCAACATCGGCATCAAC AA-3',bar基因引物序列為J2-F: 5'-CTGAAGTCC AGCTGCCAGAA-3'和J2-A: 5'-ATGAGCCCAGAA CGACGC-3'。

1.4 Southern雜交

以轉(zhuǎn)化體LG11和對照昌7-2植株的幼嫩葉片為材料提取基因組DNA, 利用BamH I和Hind III兩種限制性內(nèi)切酶對BC4F2～BC5F2代LG11和昌7-2的基因組DNA進(jìn)行酶切并純化; 根據(jù)目的基因的特異序列設(shè)計引物(m2cryAb-vip3Aa基因引物序列為s1-F:5'-ATCTCGTCCAGCGTCAGGT-3'和s1-A: 5'-TCAA CATCGGCATCAACAA-3',bar基因引物序列為s2-F:5'-CTGAAGTCCAGCTGCCAGAA-3'和s2-A: 5'-AT GAGCCCAGAACGACGC-3'), 通過PCR方法合成探針; 將酶切后純化的基因組DNA進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)膜;將膜放于雜交管中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交(加入適量探針), 再經(jīng)過洗膜和顯影, 利用用蛋白成像掃描儀掃描尼龍膜, 即可觀察Southern雜交結(jié)果。

1.5 RNA提取和實時定量PCR分析

利用天根生化科技(北京)有限公司的多糖多酚總RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化。樣品處理后采用qRT-PCR方法進(jìn)行定量檢測, 檢測完成后根據(jù)儀器生成的內(nèi)參基因和目標(biāo)基因的平均Ct(擴增循環(huán)數(shù))值, 根據(jù)公式RQ=2–?Ct, 計算對應(yīng)樣本相對于內(nèi)參基因表達(dá)量的倍數(shù)。將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析, 結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示, 根據(jù)結(jié)果分析目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的時空表達(dá)模式。以zSSIIb作為內(nèi)參基因。內(nèi)參基因zSSIIb引物序列為zSS IIb-F: 5'-C GGTGGATGCTAAGGCTG-3'和zSS IIb-A: 5'-AAAG GGCCAGGTTCATTATCCTC-3',m2cryAb-vip3Aa引物序列為Q1-F: 5'-GTTTCCTTTACCGGGGACGA-3'和Q1-A: 5'-ACCACCCCCTTCAACTTCAG-3',bar引物序列為Q2-F: 5'-CAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3'和Q2-A: 5'-GTCAACTTCCGTACCGAGCC-3'。

1.6 對靶標(biāo)害蟲的抗蟲性分析

室內(nèi)試驗用人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)多代的未接觸任何化學(xué)農(nóng)藥制劑或抗蟲蛋白的亞洲玉米螟和草地貪夜蛾的室內(nèi)敏感品系作為試蟲, 使用離體玉米葉片和花絲喂食初孵幼蟲, 評價材料對亞洲玉米螟和草地貪夜蛾的抗性。剪取玉米第2新葉或第3新葉2～4 cm長的葉片(或玉米2～4 cm長的花絲), 放入培養(yǎng)皿中, 皿底鋪上用無菌水潤濕的濾紙保持高濕狀態(tài),每皿接入10頭試蟲的初孵幼蟲(孵化2～12 h), 每材料設(shè)4個重復(fù)。在溫度(25±1)℃、濕度50%、L∶D=14∶10條件下培養(yǎng), 6 d后檢查試蟲的存活情況。死亡率和校正死亡率按下列公式計算, 并按照表1劃定抗蟲性水平。

表1 室內(nèi)生物測定抗蟲性評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for evaluation of insect resistance in laboratory bioassay

1.7 除草劑草銨膦耐受性分析

在轉(zhuǎn)基因玉米和對照材料長至三葉一心至五葉一心時噴施保試達(dá)(Basta), 其有效成分草銨膦的含量為18%, 換算成草銨膦有效成分為674.66 g hm–2進(jìn)行噴施。試驗設(shè)計參照《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測抗除草劑玉米第1部分: 除草劑耐受性》(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部953號公告-11.1-2007)執(zhí)行。除草劑噴施劑量分別為噴施清水(0×)及田間推薦劑量中量的1倍(1×, 674.66 g hm–2)、2倍(2×, 1349.33 g hm–2)和4倍(4×, 2698.65 g hm–2)。在用藥1、2和4周后分別調(diào)查記錄成苗率、植株高度(選取最高的5株)和藥害癥狀(全區(qū)調(diào)查)。藥害癥狀分級按GB/T 19780.42執(zhí)行, 除草劑受害率按公式(3)計算。

式中,X為受害率, 單位為百分率(%);N為同級受害株數(shù);S為級別數(shù);T為總株數(shù);M為最高級別。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米LG11的獲得

Cry1Ab來自蘇云金桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt), 編碼一種具有高度特異殺蟲活性的晶體蛋白(insecticidal crystal protein, ICP),Vip3編碼的蛋白是Bt在營養(yǎng)期分泌的完全不同于ICP的一種殺蟲蛋白,這2種殺蟲蛋白在進(jìn)化上沒有同源性并且殺蟲機理存在差別。為了有效降低害蟲產(chǎn)生抗性的幾率, 我們利用人工合成的方法將Cry1Ab和Vip3Aa蛋白的主要結(jié)構(gòu)域組合形成融合蛋白M2cryAb-vip3Aa。目的基因m2cryAb-vip3Aa的核苷酸序列長度為4287 bp,編碼的蛋白包含1428個氨基酸, 預(yù)測的分子量大小為159.2 kD, 等電點為5.26, 包含Vip3Aa-N、Endotoxin-C、Endotoxin-M、Endotoxin-N和CBM-4-9等結(jié)構(gòu)域(圖1); 目的基因m2cryAb-vip3Aa的啟動子來自于花椰菜花葉病毒的CaMV 35S啟動子, 大小為346 bp; 終止子來源于Ti質(zhì)粒的NOS終止子, 大小為253 bp。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將包含m2cryAb-vip3Aa表達(dá)盒和bar表達(dá)盒的載體pCAMBIA3300+m2cryAb-vip3Aa導(dǎo)入HiIIB受體, 獲得T0代轉(zhuǎn)基因植株, 將昌7-2 (具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的骨干自交系)作為輪回親本進(jìn)行5代連續(xù)回交轉(zhuǎn)育, 篩選到抗蟲耐除草劑的優(yōu)異轉(zhuǎn)基因玉米株系LG11。

圖1 M2cryAb-vip3Aa蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig. 1 Domain prediction of M2cryAb-vip3Aa protein

2.2 m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11中的分子檢測

為了分析外源插入目的基因在LG11轉(zhuǎn)化體中的整合情況, 我們通過PCR方法對BC4F2和BC5F2代LG11植株中的外源插入目的基因m2cryAbvip3Aa和bar進(jìn)行了檢測(圖2)。外源插入片段在不同世代中均能擴增出目的條帶, 表明LG11的外源插入序列已穩(wěn)定整合進(jìn)玉米基因組內(nèi)。

圖2 轉(zhuǎn)化體LG11目的基因的PCR檢測Fig. 2 Detection of target genes of LG11 by PCR

此外, 我們還通過Southern雜交方法進(jìn)一步確認(rèn)LG11轉(zhuǎn)化體中目的基因整合進(jìn)基因組的情況,并檢測其插入拷貝數(shù)。選取BamH I和Hind III兩種限制性內(nèi)切酶對BC4F2～BC5F2代LG11的基因組DNA進(jìn)行酶切, 并以目的基因m2cryAb-vip3Aa和bar的特異區(qū)段序列為模板合成探針進(jìn)行Southern雜交, 結(jié)果如圖3所示。雜交結(jié)果顯示BC4F2代轉(zhuǎn)化體LG11、BC5F1代轉(zhuǎn)化體LG11和BC5F2代轉(zhuǎn)化體LG11均出現(xiàn)了特異性條帶, 這表明m2cryAb-vip3Aa和bar基因均成功整合進(jìn)轉(zhuǎn)化體LG11的基因組中,均為單個拷貝且穩(wěn)定遺傳。

圖3 目的基因m2cryAb-vip3Aa和bar的Southern雜交結(jié)果Fig. 3 Southern hybridization of target genes m2cryAb-vip3Aa and bar

2.3 m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)分析

為了更好的了解m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)模式, 我們利用qRT-PCR方法檢測了m2cryAb-vip3Aa和bar基因在BC5F2代LG11轉(zhuǎn)化體主要組織器官中的表達(dá)情況(表2)。m2cryAbvip3Aa基因在BC5F2代LG11轉(zhuǎn)化體的組織器官中均有表達(dá), 在苗期葉片中表達(dá)量最高, 在成熟期葉片中表達(dá)量最低。bar基因在BC5F2代LG11轉(zhuǎn)化體組織器官中也均有表達(dá), 在苗期根中表達(dá)量最高, 在吐絲期根中表達(dá)量最低。實驗結(jié)果說明外源基因m2cryAb-vip3Aa和bar在LG11轉(zhuǎn)化體中呈組成型表達(dá), 但不同發(fā)育時期的不同組織器官中表達(dá)量存在差異。

表2 轉(zhuǎn)化體LG11外源基因的表達(dá)模式分析Table 2 Relative expression pattern of the exogenous genes in LG11 transformants

2.4 LG11轉(zhuǎn)化體對靶標(biāo)害蟲的抗性分析

為了評價LG11轉(zhuǎn)化體對靶標(biāo)害蟲玉米螟和草地貪夜蛾的抗性, 我們通過室內(nèi)人工接蟲和田間人工接蟲2種方法對LG11轉(zhuǎn)化體的抗蟲性進(jìn)行了分析。離體葉片人工接蟲后, 啃食LG11的玉米螟全部死亡, 葉片近乎完整, 而對照昌7-2中的玉米螟則正常進(jìn)食, 死亡很少(圖4-A, B)。離體葉片的室內(nèi)生測統(tǒng)計結(jié)果(表3)顯示, BC5F2代LG11葉片造成的玉米螟死亡率為100.00%, 顯著高于對照(10.00±1.50)%,以此計算的校正死亡率為100.00%, 表明LG11葉片對玉米螟的抗性級別為高抗; BC5F2代LG11葉片造成的草地貪夜蛾死亡率為97.50%, 顯著高于對照(2.50±0.50)%, 以此計算的校正死亡率為97.44%, 表明LG11葉片對草地貪夜蛾的抗性級別為高抗。離體花絲人工接蟲后, 啃食LG11的玉米螟全部死亡, 花絲基本完整, 而對照昌7-2中的玉米螟則正常進(jìn)食,花絲被啃食嚴(yán)重(圖4-C, D)?；ńz的室內(nèi)生測統(tǒng)計結(jié)果(表3)表明, BC5F2代LG11花絲造成的玉米螟死亡率為100.00%, 顯著高于對照(7.50±4.80)%, 以此計算的校正死亡率為100.00%, 表明花絲對玉米螟的抗性級別為高抗; BC5F2代LG11花絲造成的草地貪夜蛾死亡率為100.00%, 顯著高于對照(7.50±5.00)%,以此計算的校正死亡率為100.00%, 表明花絲對草地貪夜蛾的抗性級別為高抗。

圖4 玉米心葉期葉片和玉米花絲對玉米螟室內(nèi)生測結(jié)果(接蟲后5 d)Fig. 4 Laboratory bioassay of maize leaves at heart leaf stage and maize silks on Ostrinia furnacalis (5 days after insect ingestion)

表3 玉米螟和草地貪夜蛾室內(nèi)生測Table 3 Laboratory bioassay of Ostrinia furnacalis and Spodoptera frugiperda

田間生測結(jié)果(表4)顯示, 心葉期接蟲玉米螟后,對照昌7-2的食葉級別為7.73±0.31, 蟲害級別為7,抗性級別為感, 說明該材料為當(dāng)?shù)馗邢x材料, 本次人工接蟲質(zhì)量可滿足抗性鑒定要求, 同時, LG11的食葉級別為1.33±0.24, 顯著低于對照, 蟲害級別為1,抗性級別為高抗; 穗期的田間生測結(jié)果(表3和圖5-A,B)顯示, 接蟲玉米螟后, 對照昌7-2的雌穗被害級別為6.50±0.71, 抗性級別為感, 說明該材料為當(dāng)?shù)馗邢x材料, 人工接蟲質(zhì)量可滿足抗性鑒定要求, LG11的雌穗被害級別為1.40±0.06, 顯著低于對照, 抗性級別為高抗。

圖5 花絲接玉米螟和草地貪夜蛾后的穗期抗蟲效果Fig. 5 Insect resistance of silk grafted with Ostrinia furnacalis and Spodoptera frugiperda at ear stage

田間心葉期接蟲草地貪夜蛾后, 對照昌7-2的食葉級別為7.83±0.24, 蟲害級別為7, 抗性級別為感,說明該材料為當(dāng)?shù)馗邢x材料, 人工接蟲質(zhì)量可滿足抗性鑒定要求; 而LG11的食葉級別為1.09±0.09, 顯著低于對照, 轉(zhuǎn)化體蟲害級別為1, 抗性級別為高抗(表5)。穗期的田間生測結(jié)果(表5和圖5-D)顯示, 接蟲草地貪夜蛾后, 對照昌7-2的雌穗被害級別為6.20±0.57, 抗性級別為感, 說明該材料為當(dāng)?shù)馗邢x材料, 人工接蟲質(zhì)量可滿足抗性鑒定要求, 而LG11的食葉級別為1.41±0.41, 顯著低于對照, 抗性級別為高抗。

2.5 LG11轉(zhuǎn)化體對除草劑的耐受性分析

為了在田間控制條件下評價轉(zhuǎn)化體LG11對除草劑草銨膦的耐受性, 我們通過人工噴施方法對播種后18 d (幼苗處于三葉一心期到五葉一心期)的轉(zhuǎn)化體LG11和對照昌7-2噴施草銨膦, 并在噴施后1、2和4周分別調(diào)查藥害等級植株數(shù)(含無藥害植株)和株高, 噴施效果如圖6所示, 統(tǒng)計結(jié)果如表6所示。陰性對照昌7-2在噴施草銨膦1周后, 所有植株均出現(xiàn)4～5級藥害, 植株大部分死亡, 成苗率0, 受害率達(dá)100%; LG11在不同劑量下皆能100%成苗,但有一定藥害產(chǎn)生, 藥害率達(dá)4.57%～4.69%, 噴施2周后藥害癥狀消失。對其株高進(jìn)行調(diào)查, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量下轉(zhuǎn)化體株高沒有顯著性差異, 但顯著高于同處理的對照。該結(jié)果表明LG11可耐受4倍田間推薦劑量中量的草銨膦。

圖6 噴施草銨膦1周后LG11和對照昌7-2的耐受性Fig. 6 Tolerance of LG11 and control Chang 7-2 after one week of spraying with glufosinate

表6 BC5F2代LG11對草銨膦除草劑耐受性Table 6 Tolerance of LG11 of BC5F2 generation to glufosinate herbicide

3 討論

玉米蟲害是影響我國玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素之一, 亞洲玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲是我國各玉米產(chǎn)區(qū)面臨的最嚴(yán)重的生物脅迫[8]。大面積高劑量噴施化學(xué)殺蟲劑嚴(yán)重污染生態(tài)環(huán)境, 且增加生產(chǎn)成本。因此, 抗蟲始終是玉米品種改良的重要研究內(nèi)容, 也是現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行品種改良的首選目標(biāo)性狀之一[8]。培育抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米可有效減少化學(xué)殺蟲劑的使用, 同時因其殺蟲具有特異性, 對非靶標(biāo)生物安全, 有利于保護(hù)生物多樣性[17-18]。本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得抗蟲耐除草劑T0代轉(zhuǎn)基因植株, 通過與生產(chǎn)上應(yīng)用較多的骨干自交系昌7-2回交轉(zhuǎn)育, 獲得了農(nóng)藝性狀優(yōu)異且抗蟲耐除草劑的玉米新種質(zhì), 豐富了抗蟲耐除草劑玉米種質(zhì)資源。

轉(zhuǎn)Bt基因玉米因具有特定且高效的目標(biāo)性狀而深受種植者歡迎[17]。但大面積持續(xù)種植抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米, 也會引發(fā)靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性。有研究表明, 在南非, 表達(dá)Bt Cry1Ab殺蟲蛋白的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米MON810對草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda表現(xiàn)中等殺蟲效果, 導(dǎo)致在田間很快產(chǎn)生抗性[19]; 在波多黎各和巴西, 表達(dá)Bt Cry1F的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米對草地貪夜蛾的殺蟲效果沒有達(dá)到高劑量, 田間很快產(chǎn)生抗性[10]; 在巴西, 草地貪夜蛾對表達(dá)Bt Cry1Ab的抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米也產(chǎn)生了抗性[11]; 在加拿大, 表達(dá)Bt Cry1F的抗蟲轉(zhuǎn)基因?qū)W洲玉米螟Ostrinianubilalis的殺蟲效果沒有達(dá)到高劑量, 田間很快產(chǎn)生抗性[12]。因此, 為了阻止或延緩靶標(biāo)害蟲抗性種群的發(fā)生, 保障轉(zhuǎn)基因作物的可持續(xù)利用, 必須配套實施有效的抗性治理措施。為此, 各國生物學(xué)者提出了抗性治理策略IRM (insect resistance management),目前應(yīng)用最為廣泛且能有效延緩靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性的策略主要有“高劑量/庇護(hù)所” (high dose/refuge)策略和“多基因” (pyramid)策略[13]。在“高劑量/庇護(hù)所”策略中, “高劑量”是指轉(zhuǎn)Bt基因作物能保持高劑量表達(dá)殺蟲蛋白, 這樣就可以殺死靶標(biāo)害蟲中的100%隱性敏感純合(ss)個體和99%抗性雜合(sr)個體, 僅有抗性純合(rr)個體可能存活; “庇護(hù)所”是指在轉(zhuǎn)Bt基因作物周圍種植一定數(shù)量的非轉(zhuǎn)基因作物, 提供足夠數(shù)量的害蟲敏感個體, 與來自轉(zhuǎn)Bt基因作物區(qū)的抗性純合個體進(jìn)行交配, 從而產(chǎn)生雜合個體, 被高劑量表達(dá)殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因作物殺死, 達(dá)到稀釋抗性基因的目的, 減少抗性遺傳可能性[14]。轉(zhuǎn)Bt基因作物高劑量表達(dá)Bt殺蟲蛋白是“高劑量/庇護(hù)所”策略實施成功與否的關(guān)鍵。單個殺蟲蛋白質(zhì)往往殺蟲譜比較窄, 殺蟲活性比較低, 長期大量使用、可引起害蟲抗性的發(fā)展[20], 因此, 獲得具有高殺蟲活性的新型蛋白質(zhì)殺蟲毒素, 對提高殺蟲能力和減緩害蟲抗性的發(fā)生具有重要的應(yīng)用價值[21]; 相比單個基因的轉(zhuǎn)化, 多個基因的聚合或融合具有明顯優(yōu)勢: 殺蟲效果更好, 殺蟲譜更廣, 多個抗蟲基因之間殺蟲譜可以互相彌補, 有效延緩昆蟲產(chǎn)生抗性的時間并延緩抗性品種的使用壽命。LG11的抗蟲性分析結(jié)果表明, 含有m2cryAb-vip3Aa融合蛋白的LG11轉(zhuǎn)化體對靶標(biāo)害蟲玉米螟和草地貪夜蛾的抗性為高抗, 這對今后制定實施“高劑量/庇護(hù)所”策略提供了重要科學(xué)依據(jù)。在“多基因”策略中, 在同一株植物中同時導(dǎo)入2個或多個沒有交互抗性的針對同一靶標(biāo)害蟲的抗蟲基因, 使得轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗性的風(fēng)險減小,可有效延緩抗性的產(chǎn)生和發(fā)展[12]。LG11可以同時表達(dá)Cry1Ab和Vip3Aa兩種不同類型的殺蟲蛋白, 且這2種蛋白不同源、殺蟲機制不同, 相較于僅含單一Bt殺蟲蛋白的植株, 能有效降低靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性的幾率, 對害蟲的抗性治理起到積極作用。

4 結(jié)論

抗蟲耐除草劑玉米LG11是將m2cryAb-vip3Aa和bar基因串聯(lián)導(dǎo)入受體材料并與昌7-2進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育獲得的新種質(zhì)。PCR檢測和Southern雜交檢測證實m2cryAb-vip3Aa和bar基因已整合進(jìn)植物基因組,均為單個拷貝且穩(wěn)定遺傳; 表達(dá)模式分析顯示m2cryAb-vip3Aa和bar基因在LG11中呈組成型表達(dá),但在不同發(fā)育時期的不同組織器官中表達(dá)量存在差異; 抗蟲性分析顯示LG11對靶標(biāo)害蟲玉米螟和草地貪夜蛾高抗; 耐除草劑分析顯示LG11可耐受4倍田間推薦劑量中量的草銨膦。