玉米轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB12提高植物抗旱性和低磷耐受性的功能鑒定

王麗平 王曉鈺 傅競(jìng)也 王 強(qiáng)

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 西南作物基因資源發(fā)掘與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川成都 611130

玉米是世界三大糧食作物之一, 也是十分重要的能源及飼料作物[1]。玉米在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)受到多種非生物脅迫的影響, 例如干旱、高溫、鹽漬以及營(yíng)養(yǎng)元素匱乏等, 導(dǎo)致玉米生長(zhǎng)延緩、花期延長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率低, 最終導(dǎo)致玉米品質(zhì)下降, 減產(chǎn)歉收[2]。干旱目前已經(jīng)成為全世界范圍內(nèi)限制糧食產(chǎn)量的重要因素之一, 全球氣候變暖加劇了高溫干旱氣候的發(fā)生, 作物在其各個(gè)發(fā)育時(shí)期受到干旱脅迫都會(huì)造成不同程度的減產(chǎn)[3]。干旱對(duì)作物產(chǎn)生諸多直接和間接性的損傷, 進(jìn)而對(duì)植物形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生長(zhǎng)發(fā)育造成影響[4]。

受到干旱脅迫后, 植物細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡被打破, 植物體內(nèi)積累大量的活性氧(ROS)以及其他有害代謝物, 造成細(xì)胞損傷[5]。植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞, 會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增加, 胞內(nèi)大量電解質(zhì)滲出, ROS還會(huì)抑制各類生物酶的活性,影響植物多個(gè)生理代謝反應(yīng)[6]。植物體內(nèi)主要通過(guò)酶法和非酶法來(lái)清除活性氧, 其中酶法包括過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等[7]。Newton[8]研究表明, 耐旱性越強(qiáng)的玉米品種體內(nèi)SOD酶活性更高; 將SOD合成關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)入煙草后, 提高了煙草的抗旱性, 說(shuō)明植物體內(nèi)抗氧化酶關(guān)鍵基因的表達(dá)量以及抗氧化物質(zhì)的積累量與植物耐旱性呈正相關(guān)。同時(shí), 脫落酸(ABA)是常見(jiàn)的逆境調(diào)節(jié)激素, 在植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控下游靶基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮極其重要的作用[9]。干旱脅迫下, 植物體內(nèi)ABA含量增加, 該信號(hào)隨之傳導(dǎo)至葉片, 引起氣孔的關(guān)閉, 減少水分散失, 因此ABA含量也是衡量干旱脅迫程度的重要指標(biāo)[10]。ABA的主要功能是調(diào)節(jié)氣孔開(kāi)度, 改善植物根系形態(tài), 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓, 以此提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性[11]。

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一, 它是核糖核酸、脂膜、卵磷脂以及腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的重要組成部分, 同時(shí)也在植物的光合呼吸作用、能量代謝以及信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)途徑中發(fā)揮著十分重要的作用, 尤其是生殖生長(zhǎng)時(shí)期[12]。當(dāng)遭受低磷脅迫時(shí), 植物會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)矮小, 葉片變紅, 光合速率下降, 地上和地下的能量轉(zhuǎn)運(yùn)速率降低, 最終導(dǎo)致作物產(chǎn)量下降[13]。缺磷導(dǎo)致細(xì)胞分裂減緩,根毛以及側(cè)根的發(fā)育均受到影響, Bieleski等[14]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), 低磷脅迫會(huì)促進(jìn)植物根系的發(fā)育, 增加根系對(duì)磷元素的吸收, 吸收的磷主要會(huì)保存在根部,因此地上部的運(yùn)輸較少, 導(dǎo)致根冠比增大。玉米屬于低磷敏感型作物, 其受到低磷脅迫后主要有以下癥狀: 葉尖及葉邊緣失綠黃化、嚴(yán)重時(shí)呈現(xiàn)出紫紅色, 葉邊緣壞死; 植株矮化, 授粉結(jié)實(shí)率下降, 籽粒干癟, 內(nèi)容物較少; 雄穗花粉量較少, 根系不發(fā)達(dá),根系面積下降等[15]。低磷脅迫作為一種常見(jiàn)的逆境脅迫, 植物通常會(huì)啟動(dòng)自身保護(hù)酶系統(tǒng), 用于消耗更多的氧化代謝產(chǎn)物, 提高細(xì)胞自我修復(fù)能力, 是植物提高逆境適應(yīng)能力的途徑之一[16-17]。

根系是植物汲取水分及養(yǎng)分的主要器官, 其形態(tài)發(fā)育主要包括其在不同生長(zhǎng)環(huán)境中的構(gòu)型及分布。研究表明, 旱作水稻對(duì)磷吸收效率較高的品種,其根系形態(tài)主要有以下特征: 側(cè)根及不定根分布較為均勻, 主要從土壤表層發(fā)吸收磷; 主根下扎較深,用于旱作下吸收更多的水分, 從而很好地協(xié)調(diào)干旱及低磷脅迫下水分及養(yǎng)分新的運(yùn)輸[18]。低磷脅迫增長(zhǎng)擬南芥主根, 增加與土壤的接觸面積; 在低磷脅迫下, 過(guò)表達(dá)AtMYB62株系地上部分磷含量下降,赤霉素合成相關(guān)基因表達(dá)受到抑制, 從而抑制其主根伸長(zhǎng), 因此可以通過(guò)外源施加赤霉素來(lái)緩解低磷脅迫[19]。與此同時(shí), 低磷脅迫也影響側(cè)根發(fā)育, 側(cè)根的長(zhǎng)度及數(shù)量與植物吸收磷的效率呈顯著正相關(guān)。對(duì)2個(gè)小麥品種NC81和37進(jìn)行低磷處理, 統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)低磷環(huán)境增加側(cè)根數(shù)量及側(cè)根密度; 且與其他元素處理相比, 低磷處理下側(cè)根數(shù)量更多[20]。土壤中大部分磷為有機(jī)磷, 不能直接被植物吸收利用, 根系中有機(jī)酸及酶類的合成及分泌, 分解土壤中的有機(jī)磷為無(wú)機(jī)磷供植物吸收利用。低磷脅迫下根系分泌物發(fā)生變化, 進(jìn)而改變根系周圍pH值, 增加磷吸收。有關(guān)研究表明, 低磷脅迫誘導(dǎo)酸性磷酸酶合成基因AtPAP10的表達(dá), 低磷條件下根系分泌的有機(jī)酸增加,pH下降, 增加了植物對(duì)難溶性磷的吸收效率[21-22]。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物體內(nèi)最多的轉(zhuǎn)錄因子之一, 廣泛參與到植物初級(jí)代謝及次級(jí)代謝調(diào)控中, 其功能復(fù)雜多樣, 具有深入研究的價(jià)值[23]。MYB類轉(zhuǎn)錄因子系列均包括一段保守的MYB結(jié)構(gòu)域, 根據(jù) MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)目不同, 可將MYB類轉(zhuǎn)錄因子分為R1-MYB (R1/R2-MYB、MYB-related)、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和R4-MYB四個(gè)亞家族,目前研究最多的主要是R2R3類MYB蛋白[24]。大量研究表明MYB轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)多種途徑來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。在擬南芥中過(guò)表達(dá)FtMYB9后, 過(guò)表達(dá)體內(nèi)活性氧積累更少, 逆境響應(yīng)基因表達(dá)量更高, 提高了擬南芥的抗旱能力[25]。在煙草中過(guò)表達(dá)SbMYB15后增強(qiáng)了煙草的抗旱及耐鹽性, 脅迫處理后過(guò)表達(dá)細(xì)胞膜完整性較好, 葉綠素含量高于WT野生型[26]。作為植物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子之一, MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物磷脅迫中具有十分重要的作用。水稻OsPHR3具有相應(yīng)低磷調(diào)控的功能, 從小麥7A染色體上克隆到了其同源基因TaPHR3-A, 在水稻中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)提高了穗數(shù)、穗粒數(shù), 有增產(chǎn)效應(yīng); 利用RNAi技術(shù)在小麥種沉默該基因進(jìn)行低磷脅迫后,幼苗生長(zhǎng)及根毛發(fā)育延遲, 最終產(chǎn)量下降; 這表明TaPHR3-A通過(guò)影響根系發(fā)育來(lái)積極響應(yīng)低磷脅迫;另外, 通過(guò)酵母單雜交篩選到了TaPHR3-A的等位基因, 為小麥高產(chǎn)分子標(biāo)記輔助育種提供新的資源[27]。

綜上所述, MYB轉(zhuǎn)錄因子參與到多個(gè)非生物脅迫途徑當(dāng)中, 本研究從玉米干旱處理的材料中克隆到一個(gè)R2R3-MYB家族轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB12, 同時(shí)響應(yīng)自然干旱、ABA及PEG等誘導(dǎo)基因表達(dá)上調(diào),推測(cè)該基因可能參與到干旱脅迫中。建立玉米病毒誘導(dǎo)沉默(virus induced gene silencing, VIGS)植株后進(jìn)行自然干旱處理,ZmMYB12病毒誘導(dǎo)沉默植株自然干旱下長(zhǎng)勢(shì)相較于對(duì)照更差, 活性氧積累更多,表現(xiàn)出對(duì)干旱更加敏感; 且復(fù)水后ZmMYB12沉默植株存活率更低, 進(jìn)一步表明ZmMYB12正調(diào)控玉米響應(yīng)干旱脅迫。然后將ZmMYB12在擬南芥中過(guò)表達(dá),鑒定其生物學(xué)功能。自然干旱處理后, 與WT相比,過(guò)表達(dá)ZmMYB12活性氧積累更少, 側(cè)根更多, 從而增強(qiáng)擬南芥植株抗旱能力。本研究發(fā)現(xiàn)ZmMYB12過(guò)表達(dá)擬南芥在低磷脅迫下側(cè)根數(shù)量更多, 根系環(huán)境更加酸化、葉綠素及花青素含量更多。低磷脅迫下ZmMYB12過(guò)表達(dá)體內(nèi)無(wú)機(jī)磷含量高于野生型。表明過(guò)表達(dá)ZmMYB12參與到低磷脅迫過(guò)程中, 并且提高了植株對(duì)磷元素的吸收及利用率。本研究得出ZmMYB12調(diào)控干旱抗性并響應(yīng)低磷脅迫, 為作物抗旱及耐低磷育種提供了一個(gè)良好的基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 玉米自交系B73、Mo17種子均由本實(shí)驗(yàn)室提供。1.0%～1.5%的雙氧水對(duì)種子進(jìn)行浸泡消毒, 37℃下放置6～8 h后播種到土里, 放置于光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)兩周(25～28℃, 65%相對(duì)濕度, 4 μmol m–2s–1光強(qiáng), 光照8 h/黑暗16 h)。玉米幼苗培養(yǎng)2周后, 分別進(jìn)行自然干旱、PEG-6000和ABA處理, 提取葉片RNA, 用于基因克隆及表達(dá)模式分析。擬南芥選用哥倫比亞野生型Col-0。將擬南芥種子均勻撒至土表, 覆膜后置于4℃冰箱春化2～3 d后移至擬南芥培養(yǎng)室中正常培養(yǎng)(22℃, 16 h光照/8 h黑暗), 適當(dāng)澆水。

1.1.2 菌株與載體 基因克隆測(cè)序載體pMD19-T購(gòu)于北京擎科生物科技股份有限公司; pCAMBIA-3301 保存于本實(shí)驗(yàn)室, 作為擬南芥穩(wěn)定過(guò)表達(dá)載體; 大腸桿菌(E.coli) TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司, 用于重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化;GV3101根瘤農(nóng)桿菌保存于本實(shí)驗(yàn)室中同于擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化。pCMV2bN81載體、根癌土壤桿菌C58C1感受態(tài)、pCMV101和pCMV301等菌株均由本實(shí)驗(yàn)提供用于病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒誘導(dǎo)基因沉默ZmMYB12參考已報(bào)道文章[28], 設(shè)計(jì)病毒誘導(dǎo)基因沉默引物MYB12-VIGSF/R (表1), 構(gòu)建重組載體pCMV2bN81-ZmMYB12,分別將pCMV2bN81-ZmMYB12與pCMV101/301經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1誘導(dǎo)后, 以1∶1∶1混合, 同時(shí)以GFP作為陰性對(duì)照, 注射四葉期的本氏煙草葉片,放置16 h/24℃白天, 8 h/22℃黑夜條件下培養(yǎng)。在注射本氏煙草的第4天取接種葉片, 以1.5∶10 (w/v)的比例加入預(yù)冷的病毒接種緩沖液(0.01 mol L–1磷酸鹽緩沖液pH 7.0)和0.1% Na2SO3(w/v), 在預(yù)冷的研缽中研磨, 轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中, 4℃離心機(jī)中3000轉(zhuǎn) min–1離心3 min, 取上清液即為病毒粗提液, 作為后續(xù)針刺接種玉米種子的毒源。在常溫下將玉米自交系B73種子消毒后置于自來(lái)水中浸泡30～40 min, 以種胚向上, 使玉米種胚變軟易針刺,擺放在自來(lái)水濕潤(rùn)后的吸水紙上。取15 μL病毒粗提液滴在玉米種胚上, 并在胚芽?jī)蓚?cè)用接種針從60°方向斜向下刺入胚中1～2 mm, 避免傷到胚芽。接種后的玉米種子在25℃黑暗濕潤(rùn)條件下催芽2～3 d, 取已萌發(fā)出胚芽的玉米種子移至含有營(yíng)養(yǎng)土的直徑為10 cm的花盆中, 種子上覆土厚度約為2 cm的營(yíng)養(yǎng)土放置在同一托盤(pán)中, 并向花盆下的托盤(pán)中澆足水, 放置在16 h/0℃白天, 8 h/18℃培養(yǎng), 等玉米幼苗生長(zhǎng)后, 提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 之后PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證目的條帶。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的建立 參考前人的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因擬南芥株系[29]。設(shè)計(jì)引物p3301-ZmMYB12-F/R, 構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301-35S-ZmMYB12, 轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞,用5%蔗糖溶液重懸菌體至OD600為0.8, 加入0.05% Silwet L-77表面活性劑, 混勻作為侵染液, 選擇生長(zhǎng)良好且花蕾多的擬南芥, 將花序完全浸入侵染液,浸染15～30 s。浸染完成后的擬南芥避光放置24 h后正常培養(yǎng)。每隔1周侵染1次, 共侵染3次, 擬南芥結(jié)莢后, 收取種子。下一代擬南芥長(zhǎng)出真葉后,0.5%除草劑Basta均勻噴灑于葉片上, 每隔3～4 d噴灑1次, 共噴灑3次。轉(zhuǎn)化成功的植株表現(xiàn)出Basta的抗性, 單獨(dú)分株移栽, 生長(zhǎng)至有5～8葉后, 提取DNA, 跑PCR進(jìn)行檢測(cè)。DNA水平檢測(cè)為陽(yáng)性的植株提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA水平為陽(yáng)性的植株, 收種子后繼續(xù)播種鑒定, 得到純合陽(yáng)性植株。

1.2.3 觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)和干旱處理 擬南芥野生型及穩(wěn)定過(guò)表達(dá)種子收獲后干燥一周保存。種子滅菌后置于正常的MS培養(yǎng)基上, 4℃春化2～3 d轉(zhuǎn)移至擬南芥培養(yǎng)室培養(yǎng), 用于統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。自然干旱處理正常生長(zhǎng)兩周的擬南芥, 持續(xù)干旱半月后觀察照相, 隨后復(fù)水5 d, 統(tǒng)計(jì)存活率。一次重復(fù)每個(gè)株系至少20株, 3次以上生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 DAB染色和丙二醛(MDA)測(cè)定 配制1 mg mL–1DAB, 先用少量濃鹽酸溶解后再定容, 用濃鹽酸調(diào)至pH 3.8。將葉片放入1 mg mL–1DAB浸沒(méi)過(guò)夜, 然后轉(zhuǎn)入脫色液(乙醇∶乙酸=3∶1)洗至脫色液無(wú)色, 照相觀察。稱取0.25 g植物葉片, 加入1 mL 4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液(150 mmol L–1的PBS,pH 7.0), 冰上充分研磨, 4℃, 4500轉(zhuǎn) min–1離心20 min, 吸取上清液, 得到粗酶提取液, 參考前人方法檢測(cè)丙二醛(MDA)及抗氧化物酶活測(cè)定[30]。取適量粗酶液, 加入反應(yīng)液(含20% w/v的三氯乙酸(TCA)和0.5% w/v的硫代巴比妥酸(TBA), 檢測(cè)植物樣品提取液中MDA的含量。

1.2.5 抗氧化物酶活性測(cè)定 取適量上述(方法1.2.4)粗酶液, 加入100 mmol L–1HAc-NaAc緩沖液(pH 5.8), 10 mmol L–1AsA, 0.003 mmol L–1EDTA和5 mmol L–1H2O2測(cè)抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)。取適量粗酶液, 加入50 mmol L–1PBS, 和45 mmol L–1H2O2測(cè)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性。取適量粗酶液, 加入100 mmol L–1HAc-NaAc緩沖液(pH 5.0), 0.25%愈創(chuàng)木酚和H2O2測(cè)過(guò)氧化物酶(POD)活性。取適量粗酶液, 加入50 mmol L–1PBS (pH 7.8), 0.06 mmol L–1VB2, 195 mmol L–1蛋氨酸, 0.003 mmol L–1EDTA和1.125 mmol L–1NBT測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.2.6 低磷脅迫實(shí)驗(yàn) 擬南芥種子消毒后, 點(diǎn)播在MS固體培養(yǎng)基上, 4℃春化2 d, 移至生長(zhǎng)室培養(yǎng)6 d,轉(zhuǎn)移在正常MS和低磷培養(yǎng)基(MS中KH2PO4濃度替換為1.699 mg L–1)上。觀察到明顯的低磷脅迫表型時(shí),用根系掃描儀(EPSON Expression 12000XL掃描儀,型號(hào)J331B)照相記錄, 統(tǒng)計(jì)根系并測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。

1.2.7 溴甲酚紫指示劑pH原位顯示法 配置pH 5.7～5.9的低磷培養(yǎng)基, 同時(shí)加入終濃度為0.006%(w/v)的溴甲酚紫指示劑。超凈臺(tái)中將在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)9 d的幼苗, 移至含溴甲酚紫指示劑的低磷培養(yǎng)基中, 放入擬南芥生長(zhǎng)室培養(yǎng), 分時(shí)間段觀察低磷培養(yǎng)基顏色變化并照相記錄。

1.2.8 擬南芥根系酸化能力測(cè)定 配置pH為5.7～5.9的MS和低磷液體培養(yǎng)基, 同時(shí)加入終濃度為0.006% (w/v)的溴甲酚紫指示劑使得, 混勻后分別加300 μL MS和低磷液體培養(yǎng)基于96孔酶標(biāo)板中。選生長(zhǎng)9 d長(zhǎng)勢(shì)相同的野生型和過(guò)表達(dá)幼苗, 每3顆幼苗置于一個(gè)孔中, 放入生長(zhǎng)室繼續(xù)光照培養(yǎng)3 h。每孔用移液槍吸取100 μL液體, 加至新的透明96孔酶標(biāo)板中, 用酶標(biāo)儀(賽默飛Varioskan LUX)測(cè)定590 nm吸光值, 計(jì)算出對(duì)應(yīng)的酸化值, 數(shù)值越小,說(shuō)明pH越低, 酸化程度越高。

1.2.9 擬南芥無(wú)機(jī)磷含量測(cè)定 準(zhǔn)備野生型和過(guò)表達(dá)材料, 地上部及地下部分各稱取0.02 g, 置離心管中, 加入60 μL去離子水, 充分研磨后, 加水至150 μL, 12,000轉(zhuǎn) min–1離心5 min。吸取10 μL上清液, 加到干凈的96孔酶標(biāo)板里, 然后依次加入15 μL去離子水, 100 μL 1 mmol L–1的HCl, 25 μL鉬酸銨, 75 μL孔雀綠, 室溫下靜置15～20 min。加入100 μL 1.5%的Tween-20, 靜至15 min, 用酶標(biāo)儀(賽默飛Varioskan LUX)測(cè)定660 nm吸光值, 根據(jù)無(wú)機(jī)磷標(biāo)曲計(jì)算出對(duì)應(yīng)的無(wú)機(jī)磷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmMYB12響應(yīng)多種脅迫

為了挖掘潛在的抗旱基因, 增強(qiáng)玉米抗旱防御能力。通過(guò)干旱處理的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(http://ipf.sustech.edu.cn/pub/zmrna/)篩選到一個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因ZmMYB12, 在Maize GDB網(wǎng)站(https://www.maizegdb.org/)分析該基因在不同組織中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)ZmMYB12主要在玉米根中表達(dá), 包括側(cè)根和根毛,其余組織中本底表達(dá)水平較低; 同時(shí)在網(wǎng)站里檢索到ZmMYB12被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)基因顯著表達(dá)上調(diào)。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn), PEG、ABA及自然干旱處理后, 該基因在玉米葉片中均有不同程度的上調(diào)表達(dá), 推測(cè)該基因可能參與到干旱脅迫應(yīng)答中(圖1-A)。

圖1 ZmMYB12的表達(dá)模式分析和進(jìn)化分析Fig. 1 Relative expression pattern and evolutionary of ZmMYB12 genes

目前玉米中已報(bào)道的MYB轉(zhuǎn)錄因子主要參與淀粉、木質(zhì)素及花青素等物質(zhì)的合成, 響應(yīng)干旱、高低溫、高鹽等非生物脅迫[31]。為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)ZmMYB12的生物學(xué)功能, 利用CLC Sequence viewer 對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的序列進(jìn)行同源比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖1-B), 發(fā)現(xiàn)ZmMYB12與玉米中已報(bào)到的ZmMYB94具有較高同源性, 已知ZmMYB94參與響應(yīng)ABA信號(hào)途徑, 其可以促進(jìn)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成, 進(jìn)而合成更多角質(zhì), 增強(qiáng)植物耐旱性[32]。

2.2 病毒誘導(dǎo)沉默ZmMYB12后降低玉米抗旱性

為進(jìn)一步驗(yàn)證ZmMYB12在玉米中的抗旱功能, 利用病毒誘導(dǎo)基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)在玉米中沉默該基因后進(jìn)行功能驗(yàn)證, 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ZmMYB12基因表達(dá), 與對(duì)照(CK)相比,ZmMYB12-VIGS植株中ZmMYB12下調(diào)表達(dá)了約75%, 沉默效果較好(圖2-A)。于是對(duì)對(duì)照及ZmMYB12-VIGS植株進(jìn)行自然干旱處理, 干旱2周后觀察到對(duì)照植株僅在葉尖出有輕微萎蔫癥狀, 而ZmMYB12-VIGS植株大部分已經(jīng)倒伏, 葉片大量枯萎卷曲(圖2-B)。復(fù)水5 d后對(duì)照植株存活率高達(dá)80%, 而ZmMYB12-VIGS植株僅有10%恢復(fù)生長(zhǎng)(圖2-C)。

圖2 玉米ZmMYB12-VIGS沉默植株的干旱處理表型Fig. 2 Phenotype of ZmMYB12-VIGS maize plants in drought treatment

將干旱后的玉米葉片剪下, 進(jìn)行DAB染色, 得出ZmMYB12-VIGS植株葉片有大量活性氧積累, 其氧化損傷程度嚴(yán)重于對(duì)照植株(圖2-D)。根系在植物抗旱中扮演了重要角色, 本研究發(fā)現(xiàn), 與對(duì)照植株相比, 干旱處理前和處理后,ZmMYB12-VIGS植株的根系更不發(fā)達(dá)(圖2-E, F)。干旱促進(jìn)根系生長(zhǎng)從而吸收更多水分, 然而ZmMYB12-VIGS沉默植株的根系不發(fā)達(dá), 造成水分吸收受阻, 對(duì)干旱更加敏感。以上結(jié)果表明, ZmMYB12對(duì)干旱脅迫起著正向調(diào)控的作用, 并且是抑制活性氧積累和影響根系發(fā)育來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。

2.3 過(guò)表達(dá)ZmMYB12抑制擬南芥活性氧積累并增強(qiáng)抗旱性

玉米VIGS沉默植株不能繼代得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植株, 同時(shí)與擬南芥或者水稻等模式植物相比,構(gòu)建玉米穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植株更難, 因此本研究先在模式植物擬南芥中穩(wěn)定過(guò)表達(dá)ZmMYB12基因, 驗(yàn)證其抗旱表型。將ZmMYB12基因轉(zhuǎn)至擬南芥中, 在T3代穩(wěn)定過(guò)表達(dá)植株中檢測(cè)ZmMYB12基因表達(dá)(圖3-A), 在WT中沒(méi)有檢測(cè)到ZmMYB12基因表達(dá),過(guò)表達(dá)中ZmMYB12基因很高, 表明過(guò)表達(dá)株系構(gòu)建成功。自然干旱15 d后, 野生型葉片已經(jīng)呈現(xiàn)萎蔫卷曲狀, 而ZmMYB12過(guò)表達(dá)植株生長(zhǎng)更好(圖3-B)。復(fù)水5 d后統(tǒng)計(jì)存活率, 過(guò)表達(dá)存活率高于野生型(圖3-C), 表明ZmMYB12過(guò)表達(dá)增強(qiáng)擬南芥的抗旱性。

圖3 ZmMYB12通過(guò)減少活性氧積累增強(qiáng)擬南芥抗旱Fig. 3 ZmMYB12 enhances Arabidopsis thaliana drought resistance by reducing ROS accumulation

另外, 用20% PEG-6000處理WT及ZmMYB12過(guò)表達(dá)離體葉片, 發(fā)現(xiàn)處理24 h后, 野生型葉片活性氧積累更多; 持續(xù)處理3 d后二者ROS均有更多積累, 無(wú)差異(圖3-D)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)植株應(yīng)對(duì)滲透脅迫時(shí)更快作出反應(yīng), 更快清除體內(nèi)ROS, 降低氧化損傷。推測(cè)ZmMYB12通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng), 清除植物體內(nèi)活性氧。因此, 干旱15 d后取樣, 測(cè)定滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)MDA含量以及抗氧化酶活性(圖3-E)。結(jié)果表明, 正常生長(zhǎng)情況下, WT及過(guò)表達(dá)體內(nèi)MDA含量及酶活性幾乎無(wú)差異。當(dāng)干旱處理時(shí), 野生型體內(nèi)脯氨酸含量顯著高于過(guò)表達(dá)植株, 細(xì)胞滲透性增強(qiáng), 細(xì)胞膜損傷程度更高, 植物細(xì)胞保水性變差, 從而導(dǎo)致葉片過(guò)度失水造成萎蔫。過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性在過(guò)表達(dá)植株體內(nèi)顯著上升, 可以更快清除體內(nèi)積累的過(guò)氧化氫及超陽(yáng)根離子, 從而提高植物的抗旱能力。以上結(jié)果表明, 過(guò)表達(dá)ZmMYB12可能通過(guò)加快清除植物體內(nèi)的活性氧, 減少細(xì)胞損傷, 從而提高擬南芥對(duì)干旱的抵御能力。

2.4 過(guò)表達(dá)ZmMYB12提高擬南芥對(duì)低磷的耐受性

為了進(jìn)一步探究根系形態(tài)是否也參與到低磷脅迫中, 持續(xù)低磷脅迫7 d, 觀察到過(guò)表達(dá)側(cè)根原基發(fā)育早于野生型, 且側(cè)根原基數(shù)量更多, 根毛更早發(fā)育; 低磷脅迫21 d后, 過(guò)表達(dá)側(cè)根長(zhǎng)度較長(zhǎng)(圖4-A)。將幼苗移至低磷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后觀察統(tǒng)計(jì)根系形態(tài), 過(guò)表達(dá)的側(cè)根密度顯著高于野生型(圖4-B, C)。推測(cè)過(guò)表達(dá)ZmMYB12可能通過(guò)調(diào)控側(cè)根發(fā)育來(lái)對(duì)響應(yīng)低磷脅迫, 于是在低磷處理5 d后在體式顯微鏡下觀察根系形態(tài)。

(圖4)

首先觀察統(tǒng)計(jì)側(cè)根發(fā)育情況, 正常生長(zhǎng)時(shí)過(guò)表達(dá)側(cè)根長(zhǎng)度高于WT, 低磷處理后均促進(jìn)二者側(cè)根伸長(zhǎng), 過(guò)表達(dá)植株的側(cè)根生長(zhǎng)更快, 說(shuō)明ZmMYB12通過(guò)促進(jìn)側(cè)根發(fā)育來(lái)響應(yīng)低磷(圖4-D, E)。根系對(duì)于磷的吸收還可以通過(guò)根毛來(lái)實(shí)現(xiàn), 同時(shí)統(tǒng)計(jì)了根毛發(fā)育情況。發(fā)現(xiàn)正常MS培養(yǎng)基生長(zhǎng)5 d后, 過(guò)表達(dá)株系根毛長(zhǎng)于野生型, 但二者在側(cè)根密度無(wú)差異; 低磷脅迫可以顯著增加根毛長(zhǎng)度, 促進(jìn)有機(jī)酸的分泌;低磷處理后根毛密度有所降低(圖4-F～H)。

2.5 過(guò)表達(dá)ZmMYB12增加擬南芥吸收磷

土壤中絕大部分均為難溶性磷酸鹽, 而這些難溶性磷酸鹽不能被植物直接吸收利用。前人研究發(fā)現(xiàn)低磷能夠誘導(dǎo)根際酸化, 通過(guò)分泌蘋(píng)果酸、檸檬酸和草酸等有機(jī)酸, 釋放被土壤中的Al3+、Fe3+和Ca2+結(jié)合的難溶磷, 緩解低磷脅迫造成的危害。根系周圍pH值的變化可以通過(guò)溴甲酚紫指示劑顯色來(lái)表征。于是將在正常MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)9 d的幼苗分別移至含有溴甲酚紫的MS和低磷(LP)培養(yǎng)基上,觀察根際顯色情況。圖5-A可以看出移至正常MS培養(yǎng)基上3 d后野生型及過(guò)表達(dá)植株的根系周圍顏色變化無(wú)差異; 低磷處理3 d后, 過(guò)表達(dá)株系的根系明顯變黃, 持續(xù)處理5 d后過(guò)表達(dá)植株根系接觸的區(qū)域變黃更加明顯。利用溴甲酚紫顯色法得出, 低磷脅迫可以增加根系酸化程度, 而過(guò)表達(dá)植株的表現(xiàn)更加明顯(圖5-B)。

圖5 過(guò)表達(dá)ZmMYB12增強(qiáng)擬南芥對(duì)磷的吸收Fig. 5 Over-expression of ZmMYB12 enhances phosphorus uptake in Arabidopsis

低磷脅迫下過(guò)表達(dá)根系更加酸化, 是否會(huì)影響植物根系對(duì)于無(wú)機(jī)磷的吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)？于是測(cè)定了正常及低磷脅迫下WT和過(guò)表達(dá)ZmMYB12擬南芥體內(nèi)無(wú)機(jī)磷的含量。將生長(zhǎng)在MS培養(yǎng)基上6 d的WT和過(guò)表達(dá)ZmMYB12的幼苗, 分別移至MS與低磷培養(yǎng)基上處理14 d, 分別收集二者的根和葉, 測(cè)定其無(wú)機(jī)磷含量。正常情況下, WT和過(guò)表達(dá)植株地上部分對(duì)于磷的吸收無(wú)差異(圖5-C), 而過(guò)表達(dá)植株的根系對(duì)于磷素的吸收要高于野生型(圖5-D), 這與前面根系酸化程度的測(cè)定結(jié)果是一致的。低磷處理后,過(guò)表達(dá)葉片及根中無(wú)機(jī)磷含量均顯著高于WT, 說(shuō)明低磷下過(guò)表達(dá)對(duì)于磷素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)速率更高, 主要通過(guò)其根系的吸收向地上部分運(yùn)輸來(lái)實(shí)現(xiàn)。

擬南芥葉綠素含量受到低磷處理的影響, 于是測(cè)定了二者葉綠素的含量。將生長(zhǎng)在MS培養(yǎng)基上6 d的WT和ZmMYB12過(guò)表達(dá)擬南芥的幼苗, 分別移至MS與低磷培養(yǎng)基上處理14 d。取樣后進(jìn)行葉綠素的提取和測(cè)定。結(jié)果表明, 低磷處理后二者均有黃化, 過(guò)表達(dá)的葉綠素A和葉綠素B含量均顯著高于野生型(圖5-E, F)。擬南芥受到低磷脅迫時(shí), 表現(xiàn)出的一個(gè)明顯特征就是花青素積累導(dǎo)致的葉片變紅。測(cè)定葉片花青素的含量得出, 正常生長(zhǎng)下野生型及過(guò)表達(dá)葉片花青素含量較低, 無(wú)顯著差異; 受到低磷脅迫后, 與WT相比, 過(guò)表達(dá)擬南芥葉片中積累更多的花青素(圖5-G), 表明過(guò)表達(dá)ZmMYB12使擬南芥對(duì)低磷脅迫更加敏感。

2.6 過(guò)表達(dá)ZmMYB12影響擬南芥種子萌發(fā)

另外, 還觀察了過(guò)表達(dá)擬南芥種子的萌發(fā)情況。將消毒后的野生型(WT)及ZmMYB12過(guò)表達(dá)種子點(diǎn)在MS固體培養(yǎng)基上春化2 d后, 連續(xù)6 d觀察統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明: 正常情況下ZmMYB12過(guò)表達(dá)種子萌發(fā)晚于WT, 其萌發(fā)率及子葉綠化率要顯著低于野生型(圖6-A～C)。種子萌發(fā)與體內(nèi)赤霉素(GA)及脫落酸(ABA)水平有關(guān), 高水平GA和低水平ABA可以打破種子休眠, 促進(jìn)萌發(fā);而高水平的ABA和低水平的GA可以使種子萌發(fā)延遲[33-35]。通過(guò)GA以及ABA抑制劑處理得出: 施加GA后促進(jìn)過(guò)表達(dá)種子萌發(fā), 第4天與WT萌發(fā)率持平(圖6-D～F)。與此同時(shí), ABA抑制劑氟啶酮處理后也提高了過(guò)表達(dá)種子萌發(fā)率(圖6-G, H)。以上結(jié)果表明, 過(guò)表達(dá)ZmMYB12后對(duì)擬南芥種子萌發(fā)有影響,導(dǎo)致其萌發(fā)推遲, 推測(cè)可能與體內(nèi)GA和ABA激素水平有關(guān)。

圖6 ZmMYB12過(guò)表達(dá)影響擬南芥種子萌發(fā)Fig. 6 Seed germination of Arabidopsis thaliana with over-expression of ZmMYB12

3 討論

3.1 ZmMYB12是響應(yīng)干旱的正調(diào)控因子

干旱對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖發(fā)育造成諸多不利影響, 嚴(yán)重危害作物的產(chǎn)量及品質(zhì)。MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族通過(guò)多種途徑參與植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[36]。與野生型相比, 過(guò)表達(dá)ZmMYB12植株顯著增強(qiáng)擬南芥的抗旱性, 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株中ROS積累更少, 并且前期通過(guò)萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果, 推測(cè)可能過(guò)表達(dá)種子內(nèi)源ABA含量較高, 進(jìn)一步影響其對(duì)于干旱脅迫的響應(yīng)。ABA是調(diào)控干旱脅迫的主要激素之一, 可以通過(guò)控制氣孔的開(kāi)關(guān), 降低水分蒸騰, 較少葉片失水率, 提高植物的抗旱能力[37]。從谷子中發(fā)現(xiàn)SiMYB56受干旱誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào), 在水稻中過(guò)表達(dá)SiMYB56后調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成以及ABA信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性, 值得關(guān)注的是過(guò)表達(dá)該基因后可增加水稻種子中ABA的積累[38]。本研究表明干旱脅迫來(lái)臨時(shí)過(guò)表達(dá)ZmMYB12擬南芥體內(nèi)ROS積累更少, 檢測(cè)過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等活性在過(guò)表達(dá)體內(nèi)顯著上升, 很快清除體內(nèi)由于干旱造成的過(guò)氧化氫及超氧根離子的積累, 從而提高植物的抗旱能力。

3.2 ZmMYB12積極響應(yīng)低磷脅迫

我國(guó)大面積耕地面臨缺磷的現(xiàn)象十分普遍, 耕地的酸堿值很大程度影響磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究中, 對(duì)野生型及過(guò)表達(dá)幼苗進(jìn)行7 d及21 d持續(xù)低磷處理, 觀察到過(guò)表達(dá)的側(cè)根原基更早發(fā)育, 最終其側(cè)根數(shù)量更多。對(duì)根系進(jìn)行酸化定量得出正常情況下, 由于過(guò)表達(dá)側(cè)根更加發(fā)達(dá), 其根系分泌的有機(jī)酸更多, 更加酸化, 進(jìn)而可以將更多難溶性磷分解為可溶性磷供植株吸收利用, 因此過(guò)表達(dá)植株中磷含量顯著高于野生型。擬南芥中R2R3類蛋白MYB62受低磷脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 通過(guò)部分依賴GA信號(hào)途徑的DELLA蛋白來(lái)響應(yīng)低磷, 增強(qiáng)DELLA功能的突變體表現(xiàn)出正向調(diào)控低磷反應(yīng), 缺磷時(shí)擬南芥根的細(xì)胞核內(nèi)被綠色熒光蛋白標(biāo)記的DELLA蛋白顯著積累。與此同時(shí), 低磷會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)赤霉素活性的下降, 進(jìn)一步影響與赤霉素代謝相關(guān)的基因表達(dá)被抑制; 同時(shí)過(guò)表達(dá)MYB62導(dǎo)致擬南芥根長(zhǎng)下降, 側(cè)根數(shù)量及長(zhǎng)度均較少, 酸性磷酸酶活性降低, 地上部分磷含量下降, 植株矮小; 以及MYB62過(guò)表達(dá)體內(nèi)調(diào)控開(kāi)花基因SOC1以及GA合成基因均受到抑制, 從而負(fù)向調(diào)控低磷反應(yīng)[19]。菜豆中也報(bào)道了一個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子PvPHR1, 是與磷轉(zhuǎn)運(yùn)、再活化和內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因的正調(diào)節(jié)因子[39]。最近研究發(fā)現(xiàn)植物中的磷積累有助于增加其對(duì)真菌侵染的抗性, 磷含量較高的植株對(duì)于半活體以及死體營(yíng)養(yǎng)型真菌的侵染具有一定抗性, 高磷植株體內(nèi)JA及SA信號(hào)通路基因表達(dá)水平更高, 主要依賴JA途徑中ERF1和MYC2兩個(gè)分支來(lái)實(shí)現(xiàn), 為植物免疫響應(yīng)提供了新的見(jiàn)解[40]。

3.3 ZmMYB12在植物干旱和低磷交叉適應(yīng)性的應(yīng)用

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中通常會(huì)遭受多個(gè)逆境脅迫,從而進(jìn)化出對(duì)不同逆境脅迫的交叉耐受機(jī)制。逆境交叉耐受性是指植物受到某種非致死的逆境脅迫時(shí),會(huì)啟動(dòng)其自身的防御系統(tǒng)來(lái)應(yīng)對(duì), 同時(shí)也增強(qiáng)了對(duì)其它逆境的耐受性。目前對(duì)于交叉逆境的研究較多,Tariq等[41]研究表明, 增加磷肥提高了干旱脅迫下植物細(xì)胞質(zhì)的溶質(zhì)濃度, 溶質(zhì)的積累可以通過(guò)膜蛋白來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受干旱引起的脫水反應(yīng)。Begum等[42]在煙草中研究發(fā)現(xiàn)施加磷增強(qiáng)植物根系發(fā)育從而增加植物對(duì)水分及營(yíng)養(yǎng)元素的吸收能力; 同時(shí)由于磷的供應(yīng)可以降低丙二醛的含量, 并且上調(diào)抗氧化系統(tǒng)的代謝, 從而緩解由于干旱帶來(lái)的損傷。Hansel等[43]在田間研究發(fā)現(xiàn), 施加磷肥后可以顯著提高大豆深層土壤得到根系生長(zhǎng), 提高了對(duì)干旱脅迫的耐受性。以上研究結(jié)果, 可以得出缺磷, 首先是促進(jìn)植物根系發(fā)育, 增加磷素向地上部分運(yùn)輸; 另外也可以通過(guò)降低細(xì)胞滲透物質(zhì), 提高酶活從而減少活性氧的積累來(lái)實(shí)現(xiàn)抗旱。本研究前期發(fā)現(xiàn), 正常生長(zhǎng)下其根系更加酸化, 因此過(guò)表達(dá)植株土壤無(wú)機(jī)磷含量要顯著高于WT, 對(duì)于磷素的吸收攝入更多, 從而促進(jìn)其向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)干旱來(lái)臨時(shí)土壤相對(duì)含水量明顯下降, 可溶性磷含量顯著降低, 因此土壤無(wú)機(jī)磷含量更低。但由于過(guò)表達(dá)植株前期對(duì)磷的攝入較多, 其在干旱脅迫下表現(xiàn)更好。推測(cè)ZmMYB12響應(yīng)干旱及低磷交叉耐受性可能是通過(guò)其根系來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié)論

本研究鑒定到一個(gè)玉米MYB家族轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB12, 通過(guò)抑制活性氧積累和調(diào)控側(cè)根發(fā)育增強(qiáng)植物抗旱性; 同時(shí)調(diào)控側(cè)根伸長(zhǎng)和根毛密度響應(yīng)低磷脅迫, 增強(qiáng)在過(guò)表達(dá)擬南芥中的磷元素?cái)z取。本研究為玉米抗旱及耐低磷育種提供了一個(gè)良好的基因資源, 為植物逆境交叉耐受適應(yīng)性提供新的見(jiàn)解。