小肽Ospep5對水稻耐鎘性的影響

李明月 張文婷 李 陽 張保龍 楊立明 王金彥,*

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所, 江蘇南京 210014; 2生物育種鐘山實驗室, 江蘇南京 210014; 3南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院, 江蘇南京 210037

水稻是人類的主要糧食作物之一, 是人類賴以生存和發(fā)展的最基本的物質(zhì)基礎(chǔ), 而水稻的食用安全與人類的健康和幸福息息相關(guān)[1]。隨著人類活動的增加, 大量的重金屬污染對土壤和環(huán)境造成了嚴重的影響[2]。鎘是水稻生長和人體的非必需元素, 它具有高毒性、易積累、難降解等特點, 且在微量濃度下便會對水稻生長發(fā)育和人體健康造成影響, 被廣泛認為是限制植物生長和發(fā)育的主要的重金屬脅迫之一[3]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn), 當植物受到鎘脅迫時,植物自身會產(chǎn)生針對鎘脅迫的防御策略, 這些防御策略主要有3種形式[4]。第1種是通過阻止重金屬被植物吸收, 可以防止鎘離子在細胞中的積累, 從而減少對植物的損害[5]。第2種是通過絡(luò)合作用和螯合作用, 來減少鎘離子在細胞中的游離。鎘離子在進入細胞后會迫使細胞產(chǎn)生活性氧, 而通過清除活性氧的方式可以有效減少鎘脅迫對生物大分子危害。植物能夠產(chǎn)生多種化合物, 如金屬硫蛋白、植物螯合劑和氨基酸等, 以清除活性氧, 從而減輕其對細胞的毒性[6]。第3種是提高抗氧化酶的活性來清除自由基和活性氧。一些重要的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶等。這些酶可以幫助將自由基和活性氧轉(zhuǎn)化為較為穩(wěn)定的分子, 從而減輕氧化應激的程度[7]。植物可以通過各種途徑提高這些抗氧化酶的活性, 例如調(diào)節(jié)基因表達、增加酶的合成等, 從而增強對鎘脅迫的耐受性[8]。

此前研究表明, 植物細胞可以分泌一些5～60個氨基酸組成的多肽, 這類多肽與另一種細胞表面受體結(jié)合后可以調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育, 由于它們具有植物激素的許多特征, 因此也被稱為多肽激素[9]。多肽激素與傳統(tǒng)植物激素相似, 可以在很低的濃度下起作用, 在植物生長和應激反應中成為重要的細胞外信號分子[10]。小肽是其中一類較短的多肽分子,其分子量通常在2～10 kD之間, 可以在植物體內(nèi)參與許多生理過程, 如生長調(diào)節(jié)、環(huán)境適應和脅迫響應等[11]。根據(jù)來源和合成方式的不同, 小肽可以分為內(nèi)源性小肽和外源性小肽[12]。內(nèi)源性小肽是由細胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的, 包括信號肽、激素和酶促肽等; 外源性小肽是由植物或其他生物分泌的, 包括植物防御肽、抗菌肽和胰島素等[13]。在過去的幾十年中, 越來越多的研究表明, 小肽可以提高植物對重金屬的耐受性。其中, 小肽對植物耐鎘的作用受到了廣泛關(guān)注。小肽的作用機制包括但不限于促進植物抗氧化能力、促進植物生長和代謝、調(diào)節(jié)植物根系的形態(tài)和生長、提高植物對鎘的吸收和轉(zhuǎn)運等[14]。在薺菜的研究中發(fā)現(xiàn), 過表達AtPCS1基因可以提高植株體內(nèi)螯合肽的含量, 從而增加了薺菜對鎘和砷的耐受性[15]。Lan等[16]新發(fā)現(xiàn)了一個新型的植物小肽家族IRON MANs (IMAs), 鎘處理可顯著誘導擬南芥小肽基因IMA1和IMA3的表達。在水稻中, CAL1和DEF8均能夠通過跨膜方式將鎘向細胞外運輸, 表明植物體內(nèi)可能存在一類新型的小肽螯合轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[17]。

在前期研究中, 我們通過翻譯組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等方法, 在水稻中發(fā)現(xiàn)了一個新型小肽Ospep5。在本研究中我們通過鎘處理水稻幼苗, 測定幼苗的形態(tài)指標和生理指標, 發(fā)現(xiàn)Ospep5可顯著提高水稻幼苗的耐鎘性。本研究結(jié)果不僅為水稻耐鎘提供了一種潛在有用的調(diào)節(jié)因子, 還為研究植物耐鎘性的復雜分子機制提供了更多的信息, 同時為植物鎘生物修復潛能的拓展提供了理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 基因編輯載體構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)化

根據(jù)Hua等[18]的研究方法, 構(gòu)建了一個靶向Ospep5的CRISPR/Cas9載體。將該載體轉(zhuǎn)化A.tumefaciens菌株EHA105中。然后按照Ma等[19]的研究方法, 使用農(nóng)桿菌侵染水稻日本晴的愈傷組織進行轉(zhuǎn)化。根據(jù)表1中的引物序列進行擴增, 對PCR產(chǎn)物直接測序。最后選擇純合的敲除突變體ospep5-3進行下一步分析。

1.2 過表達載體構(gòu)建及水稻轉(zhuǎn)化

將Ospep5基因連接到pCM1309載體中, 利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化日本晴愈傷組織, 生成轉(zhuǎn)基因水稻植株。在T2代中選擇純合的轉(zhuǎn)基因株系Ospep5-OX,用于鎘敏感性分析和鎘含量測定。

1.3 試驗材料與處理

試驗在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院人工氣候室內(nèi)完成。試驗水稻品種為日本晴, 日本晴Ospep5的CRISPR/Cas9突變體ospep5-3, 日本晴過表達植株Ospep5-OX。試驗中使用的小肽Ospep5 (MLDPTHMFVQPHVAD MIRSKISEFRDQNSYEKPS)由中國杭州丹港生物科技有限公司合成。首先挑選健康飽滿的水稻種子浸在清水中, 放在37℃烘箱中催芽3 d, 清水每天更換1次。采用水培法進行培養(yǎng), 水培盒為黑色避光96孔, 長127 mm, 寬87 mm, 高124 mm, 水培營養(yǎng)液采用霍格蘭營養(yǎng)液, 每3 d換1次。每個水培盒種48顆飽滿水稻種子, 在水稻幼苗生長10 d時進行鎘脅迫處理, 將CdCl2·2.5H2O (分析純)一起與營養(yǎng)液拌勻后澆灌水稻, 同時將體外合成的小肽Ospep5均勻噴施在水稻幼苗表面, 直至有液滴形成, 對照組噴施等量蒸餾水。10 d齡的健康水稻幼苗植株被分為3個處理, 分別是對照(CK), 500 μmol L–1CdCl2(Cd), 500 μmol L–1CdCl2+300 nmol L–1Ospep5 (Cd+S5)。水稻幼苗處理7 d后取樣測定各生理生化指標。

1.4 形態(tài)學相關(guān)指標測定

每個重復隨機選取10株水稻幼苗, 去蒸餾水洗凈后用濾紙吸干其表面的水分進行測量。采用1‰的電子精密天平稱量植株鮮重, 使用0.1 cm的直尺測量植株地上部高度和主根長度。以平均值作為各項結(jié)果的基準。

1.5 生理學相關(guān)指標測定

稱取水稻葉片0.05 g, 剪碎放入20 mL丙酮∶無水乙醇(1∶1)混合液中置于黑暗條件下浸提至葉片完全脫綠變白進行葉綠素提取, 中間需混勻2～3次, 并在OD645和OD663處測量提取溶液的吸光度。水稻葉綠素含量的計算公式是: Chl = (8.04×OD663+20.29×OD645)×V/W。

使用北京索萊寶科技有限公司丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒對水稻幼苗植株進行丙二醛含量檢測;使用北京索萊寶科技有限公司脯氨酸(Pro)含量檢測試劑盒進行脯氨酸含量檢測檢測; 使用南京建成生物工程研究所有限公司總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒進行總超氧化物歧化酶活力測定。各處理3個重復。

1.6 水稻幼苗鎘離子含量測定

對處理7 d的水稻幼苗進行采樣, 取4個生物學重復, 每個重復6～8株。將幼苗表面用去離子水沖洗干凈, 吸干表面水分, 去除殘留的胚, 分成地上部和根部, 稱量鮮重。之后將樣品放在烘箱, 先用105℃烘15 min, 于80℃恒溫烘干1周至恒重, 稱量干重。將樣品轉(zhuǎn)移至25 mL帶蓋玻璃刻度試管, 加入適量濃硝酸(地上部5 mL, 根部3 mL), 50℃水浴過夜, 再用95℃水浴消煮至樣品充分溶解, 其間多次震蕩搖勻, 冷卻后加入去離子水定容至20 mL。最后使用ICP-OES測定鎘離子含量。

1.7 實時熒光定量PCR分析

對處理6 h后的日本晴水稻幼苗進行取樣, 每個處理3個重復, 每個重復隨機取4～6株幼苗。使用TRIzol試劑從幼苗中提取總RNA, 然后用無RNA酶的DNA消化酶I進行處理以去除殘留基因組DNA, 用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA用于qRT-PCR分析, 并使用表1中提供的特異性引物確定鎘應答基因的轉(zhuǎn)錄水平, qRT-PCR在QuantiDx Q16S熒光定量PCR儀(中國香港)中進行。Actin作為內(nèi)參基因。

1.8 數(shù)據(jù)處理

借助Microsoft Excel 2020進行數(shù)據(jù)整理,Graphpad Prism 9.3繪制圖表, 并利用SPSS 26.0進行方差分析和顯著性檢驗(P<0.05), 采用最小顯著差異法(LSD)進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ospep5突變體的獲得和過表達植株的表達分析

在前期研究中我們鑒定到一個編碼34個氨基酸的小肽, 命名為Ospep5, 其前體編碼一個具有65個氨基酸、類似于修復因子IIH亞基TFB5蛋白。利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯方法在野生型日本晴背景下產(chǎn)生了Ospep5基因的敲除突變體, 通過測序驗證, 獲得了具有2-bp缺失的突變體ospep5-3進行后續(xù)研究(圖1-A)。經(jīng)過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化得到過表達植株Ospep5-OX, 并以Actin作為內(nèi)參進行Ospep5的qPCR分析, 其結(jié)果如圖1-B, 目的基因Ospep5在過表達Ospep5-OX的表達顯著高于野生型植株日本晴,其表達量高出野生型植株的5倍。

圖1 Ospep5的基因編輯突變體和過表達株系分析Fig. 1 Relative expression level of CRISPR/Cas9 mutant and overexpression lines of Ospep5

2.2 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗表型的影響

為了研究Ospep5在調(diào)節(jié)重金屬鎘脅迫下水稻幼苗生長中的作用, 我們在水稻苗期進行了鎘脅迫處理和外施合成小肽處理, 并在處理7 d后對水稻幼苗進行表型觀察。圖2-A表明, Cd處理組和Cd+S5處理組與對照日本晴CK相比, 生長都受到了鎘脅迫的抑制。然而, 與單獨CdCl2處理的幼苗相比, 外施合成小肽Ospep5的幼苗生長明顯緩解了鎘脅迫的抑制。圖2-B表明, 在突變體ospep5-3中, 結(jié)果與圖2-A在野生型日本晴中的結(jié)果相同, 經(jīng)過CdCl2處理的幼苗生長都受到了明顯的抑制, 經(jīng)過小肽Ospep5處理的幼苗生長明顯緩解了鎘脅迫的抑制。圖2-C表明, 在單獨CdCl2處理的幼苗中, 野生型日本晴和過表達Ospep5-OX幼苗, 其生長明顯優(yōu)于突變體ospep5-3的幼苗。綜上所述, 鎘處理會顯著抑制水稻幼苗的生長, 小肽Ospep5可以緩解鎘脅迫對水稻幼苗的生長抑制。

圖2 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗生長的表型影響Fig. 2 Phenotypic effects of Ospep5 on rice seedling growth under cadmium stress

2.3 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗鮮重、株高和根長的影響

為了研究Ospep5在重金屬鎘脅迫下水稻植株的生長發(fā)育情況, 進行了相應形態(tài)指標的測定。苗期是植物生長發(fā)育的重要時期, 也是對鎘脅迫較為敏感的時期, 鮮重、株高、根長是最為直觀的植株生長發(fā)育指標。對鮮重、株高、根長進行統(tǒng)計, 由表2可知, 在野生型日本晴中, 單獨鎘處理顯著降低了幼苗的鮮重、株高和根長; 而與單獨鎘處理相比, 施加小肽Ospep5后, 幼苗的鮮重、株高和根長顯著升高。在ospep5-3中, 其結(jié)果與在野生型日本晴中相同, 經(jīng)過單獨鎘處理的幼苗, 其鮮重、株高和根長被顯著抑制; 而與單獨鎘處理相比, 施加小肽Ospep5后, 幼苗的鮮重、株高和根長顯著升高。并且在單獨鎘脅迫處理的幼苗中,Ospep5-OX的鮮重、株高和根長顯著高于ospep5-3的鮮重、株高和根長。因此, 表明Ospep5在鎘脅迫條件下可以對水稻幼苗植株的鮮重、株高和根長起到調(diào)節(jié)作用,證實了Ospep5可以緩解鎘脅迫下水稻幼苗的生長發(fā)育。

表2 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗的鮮重、株高和根長的影響Table 2 Effects of Ospep5 on fresh weight, plant height, and root length of rice seedlings under cadmium stress

2.4 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗葉綠素、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

為了研究Ospep5在重金屬鎘脅迫下對水稻幼苗生理特性的影響, 我們對水稻幼苗進行了生理指標測定。測定了在鎘處理前后葉綠素、脯氨酸(Pro)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。實驗結(jié)果顯示, 鎘脅迫下與無鎘對照組相比, 葉綠素含量顯著減少, 而MDA、Pro含量和SOD活性則顯著增加(圖3)。這表明在重金屬鎘脅迫下, 水稻幼苗體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)能夠抵抗由于鎘脅迫引起的過氧化反應。在進行鎘脅迫處理的同時, 施加了Ospep5,實驗結(jié)果顯示, 與單獨加鎘處理相比, 施加Ospep5的處理組葉綠素和SOD的含量顯著增加, 而MDA和Pro的含量則顯著降低。這表明Ospep5能夠緩解鎘脅迫對植物的負面影響。同時, 發(fā)現(xiàn)在單獨鎘脅迫處理中,Ospep5-OX植株的葉綠素含量比ospep5-3和日本晴高, 而MDA和Pro的含量則比ospep5-3和日本晴低。綜上所述, 實驗結(jié)果表明, 在重金屬鎘脅迫下, Ospep5對植物生長的影響是多方面的, 包括葉綠素、Pro、MDA和SOD等。因此, 在進一步的研究中, 需要更深入地探究Ospep5在重金屬鎘脅迫下的分子機制和生理作用。

圖3 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗生理指標的影響Fig. 3 Effects of Ospep5 on physiological indexes of rice seedlings under cadmium stress

2.5 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗鎘含量的影響

為了分析Ospep5是否參與調(diào)節(jié)水稻植株對鎘脅迫的響應, 我們對處理7 d后的野生型日本晴水稻幼苗進行了鎘離子含量測定。圖4表明, 在鎘脅迫下, 水稻幼苗的地上部分和地下部分的鎘離子含量均顯著增加。然而, 與單獨鎘脅迫相比, 經(jīng)過外施Ospep5發(fā)現(xiàn), 水稻幼苗在鎘脅迫下, 其地上部分和地下部分的鎘離子含量均顯著降低。因此, 表明Ospep5能夠降低水稻幼苗在鎘脅迫下的鎘含量, 并增強其抗鎘能力。

圖4 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗鎘含量的影響Fig. 4 Effects of Ospep5 on cadmium content in rice seedlings under cadmium stress

2.6 基因表達分析

為了進一步揭示Ospep5是否參與調(diào)控鎘脅迫相關(guān)基因, 我們對處理6 h后的水稻幼苗進行qRT-PCR表達分析(圖5)。與對照相比, 在鎘脅迫下OsHMA2和OsCAL1基因表達下調(diào),Ospep5和OsHMA3表達上調(diào); 與單獨鎘脅迫處理相比, 通過外源施加合成Ospep5可使4個基因表達量均上調(diào)。這些研究表明, Ospep5可導致水稻幼苗對鎘脅迫的敏感降低, 減少鎘在植物體內(nèi)的積累, 這驗證了Ospep5在介導水稻耐鎘性方面的功能, 可能是通過調(diào)節(jié)細胞離子穩(wěn)態(tài)實現(xiàn)的。

圖5 Ospep5對鎘脅迫下水稻幼苗相關(guān)基因的qRT-PCR的分析Fig. 5 Relative expression level of Ospep5 on rice seedling related genes under cadmium stress

3 討論

近年的研究表明, 小肽作為信號分子廣泛參與植物的生長發(fā)育、免疫及環(huán)境適應性的調(diào)控, 因此越來越多的科學家認識到植物小肽的生物學意義[20]。在擬南芥中, 激素類多肽分子AtPep3可調(diào)控植物抗鹽脅迫[21]。在干旱脅迫中, 多肽CLE25能在根部感受缺水信號, 并進行運輸, 有效提高植物的抗旱性[22]。然而, 關(guān)于植物小肽如何緩解水稻中的鎘脅迫的信息尚不充分。在本研究中, 葉面均勻噴施合成小肽Ospep5能有效緩解鎘脅迫對水稻苗期的生長發(fā)育的影響, 鮮重、株高和葉綠素顯著增加, 并促進根系生長。植物小肽Ospep5可能介導鎘積累并賦予植物較強的鎘耐性。Gu等[23]發(fā)現(xiàn)了一種具有類轉(zhuǎn)運功能的韌皮部鎘卸載蛋白DEF8, 該蛋白通過螯合和跨細胞膜分泌機制, 在重金屬Cd向地上部位的長途轉(zhuǎn)運以及籽粒中韌皮部鎘卸載過程中發(fā)揮了雙重作用。在之前研究中,OsHMA2參與鎘離子從根到地上部分的運輸以及鎘在節(jié)中的分配,OsHMA3位于液泡膜上在鎘向液泡運輸中起著重要作用, 過表達OsHMA2和OsHMA3可以顯著降低水稻植株鎘含量[1]。OsCAL1是水稻防御素蛋白, 能夠蝥合細胞質(zhì)中的鎘排至細胞外, 過表達OsCAL1可以顯著降低水稻植株的鎘含量, 提高其對鎘的耐受性[24]。在本實驗中, Ospep5可以通過上調(diào)OsHMA2、OsHMA3和OsCAL1基因的表達來降低水稻幼苗體內(nèi)鎘積累,從而顯著提高水稻耐鎘性。其中,OsHMA2和OsHMA3通過調(diào)節(jié)鎘的轉(zhuǎn)運減少鎘在細胞質(zhì)中的積累, 而OsCAL1則是通過與鎘結(jié)合減少鎘的自由態(tài)從而降低植物體內(nèi)鎘含量。Ospep5過表達顯著提高水稻的耐鎘性, 可能是因為重塑細胞內(nèi)鎘的吸收和轉(zhuǎn)運。相反, Ospep5功能缺失突變體ospep5-3表現(xiàn)出明顯的鎘敏感性。用外源Ospep5肽處理的ospep5-3突變體產(chǎn)生與Ospep5-OX植株相似的表型。說明Ospep5可以增強水稻幼苗的耐鎘性, 緩解水稻幼苗在鎘脅迫下傷害。

鎘脅迫是作物遭受的環(huán)境脅迫之一, 對大多數(shù)生物體, 包括人類和植物, 具有較強毒性[25]。在鎘脅迫下, 植物會遭受氧化損傷, 導致活性氧的積累,其積累速度遠遠超過抗氧化酶清除的速度, 結(jié)果發(fā)生膜脂過氧化, 對植物細胞造成嚴重傷害, 最終損害超過了植物自我修復的能力[26]?？寡趸负涂寡趸瘎┰诩毎趸€原平衡中起著至關(guān)重要的作用[27]。一些研究表明, 植物小肽可以調(diào)節(jié)植物的氧化還原狀態(tài)[28]。在本實驗中, 當植物處于鎘脅迫時, 與對照相比, 顯著提高了水稻幼苗SOD活性和MDA含量。當外施Ospep5, 增加了SOD活性并且降低了MDA含量, 保護了細胞免受活性氧的侵害。因此Ospep5可能調(diào)節(jié)抗氧化酶活性, 具有解毒的作用, 提高了植物的耐脅迫性。在鎘脅迫下, 植物體內(nèi)會迅速累積脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì), 用以抵抗鎘對植物造成的傷害, 維持細胞正常的結(jié)構(gòu)功能, 提高植物的抗逆性[29]。在本研究中, 脯氨酸在鎘脅迫下顯著增加, 提示水稻幼苗為了維護細胞的穩(wěn)定性而做出的生理性適應措施。這些結(jié)果與張家欣[30]在旱柳中的研究結(jié)果以及程雪等[31]在芹菜中的研究結(jié)果相似。然而, 在鎘脅迫下施用Ospep5肽處理水稻幼苗植株, 逆轉(zhuǎn)了鎘脅迫誘導的高水平脯氨酸。因此,Ospep5可能通過調(diào)節(jié)其他滲透保護劑而不是脯氨酸來緩解鎘對植物的傷害。同時, Ospep5可以促進植物根系中超氧化物歧化酶(SOD)的活性, 從而增強了水稻幼苗對鎘脅迫的抗氧化防御能力, 降低了鎘對水稻幼苗的毒性影響。這些結(jié)果還需要進一步深入研究。綜上所述, 鎘脅迫會抑制水稻幼苗的生長,而Ospep5有助于促進水稻幼苗在鎘脅迫下的生長。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9突變體ospep5-3、過表達Ospep5-OX和野生型日本晴材料, 施加CdCl2和合成小肽Ospep5處理, 證實小肽Ospep5可以有效促進水稻幼苗在鎘脅迫下生長。Ospep5可通過調(diào)節(jié)水稻幼苗體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)酶POD的活性, 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Pro含量, 增加葉綠素含量, 抑制膜脂過氧化物MDA含量, 降低鎘離子含量, 使耐鎘基因OsHMA2、OsHMA3和OsCAL1表達上調(diào)等方式, 有效地緩解水稻的鎘脅迫。研究表明Ospep5通過調(diào)節(jié)水稻幼苗各種生理生化反應以及調(diào)控耐鎘基因表達的方式, 最終提高了水稻幼苗對鎘脅迫的耐受性。