地舒單抗在大鼠脆性骨折愈合中的療效觀察*

莊洵榮 吳文華 莊雪瑜 鄭劍鋒 何立江

福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院脊柱骨科,福建省泉州市 362000

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨礦物質(zhì)含量減少和骨密度降低為特征的全身性疾病,隨著骨骼脆性增加,容易發(fā)生脆性骨折,是中老年多發(fā)病[1]。它被認為是引起老年骨折的最主要原因,此類骨折患者因本身骨質(zhì)疏松疾病特點,骨折多呈粉碎性,愈合慢,且因骨強度降低更易導致內(nèi)固定松動及再骨折,不僅大大降低了患者的生活質(zhì)量,而且具有極高的致殘率和致死率[2]。隨著我國社會的老年化,對于骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折的防治是現(xiàn)今研究的重點領(lǐng)域。

抗骨質(zhì)疏松藥物種類繁多,地舒單抗(denosumab)是一種針對破骨細胞的全人源單克隆抗體,其通過與核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)相耦合,有效阻礙RANKL與其受體RANK結(jié)合,抑制破骨細胞的生成與活化,進而減少骨的吸收,提高骨的密度[3]。地舒單抗作為全球迄今唯一獲得批準上市的單克隆抗體類藥物,為老年骨質(zhì)疏松疾病的治療提供了新的解決方案。雖然地舒單抗在抗骨質(zhì)疏松癥治療方面具有確切療效,但近年來隨著對該類患者的骨微結(jié)構(gòu)和質(zhì)量進行深入研究,人們發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)的雙膦酸鹽類抗骨質(zhì)疏松藥物,地舒單抗具有更低的骨重塑率,部分病例甚至發(fā)生非典型股骨骨折的并發(fā)癥。因此,對于合并骨質(zhì)疏松癥的骨折患者使用地舒單抗,其有效抑制破骨細胞同時是否會影響新生骨重建,進而對骨折恢復過程造成干擾目前尚存在爭議[4]。本實驗意在建立骨質(zhì)疏松骨折的大鼠模型,探討地舒單抗在骨質(zhì)疏松骨折愈合中的作用,為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物:60只健康的6月齡無特定病原體(SPF級)雌性SD大鼠,體重(278.19±15.33)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK (京) 2019-0008]。實驗前所有大鼠均適應性喂養(yǎng)1周,實驗動物于泉州醫(yī)學高等?？茖W校動物實驗中心分組籠養(yǎng)[SYXK(閩)2016-0001],隨機分為A、B、C三組,每組20只。按實驗動物的3R使用原則給予照護,專人喂養(yǎng),自由飲水,飼養(yǎng)溫度控制在(26±1)°C,實驗過程中每周稱重并記錄。(2)藥物與儀器:實驗藥物地舒單抗(普羅力)購自美國Amgen制藥有限公司;DR數(shù)字化X線攝影系統(tǒng)購自荷蘭飛利浦公司;雙能X線骨密度測定儀購自美國HOLOGIC公司;光學顯微鏡購自德國萊卡公司;萬能力學實驗機購自美國Bose公司。

1.2 建立骨質(zhì)疏松骨折模型 10%水合氯醛按300mg/kg劑量對大鼠腹腔內(nèi)注射麻醉,大鼠取俯臥位,以脊柱兩側(cè)各約1cm髂骨脊上2cm為術(shù)野中心,去毛后消毒鋪巾,B、C兩組大鼠切除雙側(cè)卵巢,A組大鼠切除等量脂肪團塊。手術(shù)當天肌注80萬單位青霉素。4周后,雙能X線骨密度測定儀檢查骨密度,確定成功制備B、C兩組大鼠骨質(zhì)疏松動物模型。三組大鼠分別在初次手術(shù)后第5周,同樣方式麻醉大鼠,以左股骨處為手術(shù)切口,截骨鉗截斷股骨,克氏針固定斷端,手術(shù)當日肌注80萬單位青霉素。B組大鼠依照實驗動物體重劑量折算系數(shù)法,手術(shù)當日按375mg/kg劑量皮下注射地舒單抗。

1.3 實驗檢測指標 三組大鼠骨折術(shù)后第3、6周分別各隨機挑選10只處死,股骨標本經(jīng)DR數(shù)字化攝影機拍照觀察骨折愈合情況;同時X線骨密度測定儀測量標本骨密度值變化;萬能力學實驗機采用四點彎曲力學檢測方法,控制應力方向,加載速度2mm/min,記錄壓力—位移曲線并計算最大載荷及最大載荷回復率;最后標本切片經(jīng)處理后常規(guī)脫蠟,蘇木精—伊紅染液進行染色,觀察骨痂處骨小梁、軟骨細胞及骨基質(zhì)等顯微形態(tài)學變化。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠骨折模型骨密度比較 各時點骨密度(BMD)結(jié)果顯示,骨折建模術(shù)后第3周時,B組BMD(0.119±0.010)與C組(0.109±0.011)相當,兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但兩組BMD數(shù)值均低于A組(0.176±0.010) (P<0.05)。骨折術(shù)后第6周時,三組大鼠BMD較術(shù)后第3周時有明顯增加,但表現(xiàn)為A組(0.221±0.029)>B組(0.197±0.024)>C組(0.174±0.021),三組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠骨折模型骨密度對比

2.2 三組大鼠最大載荷值、最大載荷回復率比較 力學測試結(jié)果顯示,三組各數(shù)值在骨折建模術(shù)后第3周時均降低,但隨著時間推移而回升,骨折建模術(shù)后第6周時各組數(shù)值均高于術(shù)后第3周。骨折建模術(shù)后3周、6周時股骨最大載荷和最大載荷回復率由大到小依次為:A組>B組>C組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠最大載荷值、最大載荷回復率力學對比

2.3 影像學變化 術(shù)后第6周各組大鼠均實現(xiàn)骨折愈合,股骨骨折處骨痂生長,但A、B組較C組骨膜反應深,骨小梁更濃密,骨痂體積肥厚,密度增深,斷端局部骨痂密度更接近骨皮質(zhì)密度。見圖2。

A組 B組 C組

2.4 組織病理學變化 術(shù)后第6周時,A、B組較C組骨皮質(zhì)更厚實,骨小梁連續(xù)性更好且更密集,骨小梁附近成骨細胞與骨細胞數(shù)量更多、密度更高。見圖3。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是最常見的老年慢性進展性疾病,由于骨礦物質(zhì)含量丟失導致骨骼脆性增加,此類患者極易因為骨的強度降低發(fā)生骨折,伴發(fā)的骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性骨折不僅大大降低了患者的生活質(zhì)量,而且骨折手術(shù)容易發(fā)生骨內(nèi)固定物松動、骨折骨愈合和再次骨折,盡快提高患者的骨礦物質(zhì)密度和骨強度,促進骨折愈合,避免二次骨折尤其重要[5]。

藥物治療是治療骨質(zhì)疏松癥的重要途徑,地舒單抗作為目前新獲批上市的、活性最強的、可用于人體治療的RANKL抑制類藥物,其與同樣作為抗骨吸收藥的雙膦酸鹽類藥物作用機制卻大不相同,它對骨礦物質(zhì)沒有親和力,而是通過結(jié)合和抑制RANKL達到降低破骨細胞分化與增殖的目的,已有研究表明其比雙膦酸鹽類藥物能更高效地提高患者骨密度[6-7]。此外地舒單抗起效不存在平臺期,沒有“藥物假期”的現(xiàn)象,長期使用可以持續(xù)提高全身骨密度[8]。針對大多數(shù)主要臨床研究僅面向絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松治療,Jeong等人[9]分析了地諾單抗對男性骨質(zhì)疏松患者的影響,這是亞洲地區(qū)人群首批此類研究,研究結(jié)果表明與女性療效相當,地諾單抗也有效地增加了骨質(zhì)疏松癥男性回顧性隊列腰椎和髖部的骨礦物質(zhì)密度,包括那些初次治療即使用地舒單抗的患者和最初使用雙膦酸鹽而后改用地舒單抗的患者。但需要注意的是地舒單抗抑制骨轉(zhuǎn)換具有可逆性,且停藥具有反彈效應,即停藥可能導致骨轉(zhuǎn)換增加和骨密度迅速下降,導致多發(fā)性椎骨骨折的潛在高風險。目前地舒單抗停藥后序貫治療的理想方案仍在探尋中[10]。

人體骨折愈合骨修復重建時,骨轉(zhuǎn)換過程是成骨細胞與破骨細胞相互偶聯(lián)的動態(tài)變化過程,除了成骨細胞在骨折愈合過程中發(fā)揮主要作用,破骨細胞在骨組織的塑形重建中亦發(fā)揮重要功能,兩者相輔相成,在骨痂形成同時又避免骨痂過度生長影響骨骼重建和骨折愈合[11]。地舒單抗治療骨質(zhì)疏松癥效果肯定,但在骨質(zhì)疏松骨折患者應用該類藥物,其抑制破骨細胞的藥理作用是否會干擾骨折愈合過程中的新生骨重建和塑形,進而對骨折愈合造成影響目前相關(guān)研究尚少,國外僅有小規(guī)模臨床研究表明,老年骨質(zhì)疏松癥患者全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后2周內(nèi)應用地舒單抗治療,1年后假體周圍骨量較安慰劑組增加[12]。本次對卵巢切除骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨骨折術(shù)后應用地舒單抗的實驗發(fā)現(xiàn),應用地舒單抗組大鼠股骨骨折處骨愈合良好,未發(fā)生骨折延遲愈合,地舒單抗抑制破骨細胞的同時,對成骨細胞的生物活性功能無明顯干擾。骨折術(shù)后第3周時,B組與C組大鼠的BMD差異無統(tǒng)計學意義,但兩組BMD數(shù)值均低于A組大鼠BMD值(P<0.05),證明了合并有骨質(zhì)疏松的骨折病例,其骨折處骨密度含量較正常骨折病例為低。骨折術(shù)后第6周時,三組大鼠間BMD由高至低依次為:A組>B組>C組,各組間差異均有統(tǒng)計學意義,此外三組大鼠的最大載荷和最大載荷回復率也呈現(xiàn)同樣的差異(P<0.05),同時X線影像學觀察結(jié)果顯示C組大鼠骨折處的骨痂較其他兩組來說骨痂相對體積更狹小,骨小梁顯得疏松,局部骨密度顯影低。組織病理切片可觀察到其他兩組較C組骨皮質(zhì)更厚實,骨小梁連續(xù)性更好且更密集,骨細胞數(shù)量更多和密度更高。實驗結(jié)果表明,骨質(zhì)疏松脆性骨折愈合中使用地舒單抗,在骨折愈合期可以明顯提高骨密度,增加骨骼應力強度,這得益于單克隆抗體能以高度親和力與RANKL結(jié)合,阻斷其與受體RANK的相互作用,抑制破骨細胞的生成與活性,從而減少骨吸收、增加骨量、改善骨強度的作用機理有關(guān)[13]。此外無大鼠拒食等其他不良事件發(fā)生,表明地舒單抗對RANKL的結(jié)合同時具有高度特異性,目前研究未發(fā)現(xiàn)其與TNF家族的其他成員(如TNF-α、TNF-β等)相結(jié)合而導致相應不良反應,具有較高的藥物安全性[14-16]。

作為國內(nèi)批準上市不久的單克隆抗體藥物,地舒單抗在本次應用研究中未對實驗動物的骨折愈合造成不利影響,而且在骨折治愈期,實驗組表現(xiàn)出更好的骨密度和更佳的骨強度,表明地舒單抗對增強骨折愈合能力,預防內(nèi)固定松動和發(fā)生二次骨折具有一定作用。當然本實驗也有不足之處:首先本實驗為大鼠卵巢去勢切除模仿絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松骨折模型,實驗動物無法配合術(shù)后制動,而自由活動可能在一定程度上會對骨折愈合造成影響。其次,停用地舒單抗可能會導致機體骨密度丟失和骨吸收增加同步發(fā)生,進而提高發(fā)生骨折的風險[17],因此對該藥物如何確定理想的停藥時間及停藥后的合理序貫治療,需要進一步研究并制定最佳的策略。