硼替佐米對裸鼠人宮頸癌SiHa細胞移植瘤作用的研究

[摘 " 要] " 目的：探討硼替佐米對裸鼠人宮頸癌SiHa細胞移植瘤生長的作用及其與Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）表達的關(guān)系。方法：建立裸鼠人宮頸癌SiHa細胞移植瘤模型，成瘤后隨機分為對照組和給藥組，每組8只。觀察裸鼠體質(zhì)量變化及移植瘤體積。干預(yù)結(jié)束后處死裸鼠，剝?nèi)×鲶w稱重，計算抑瘤率。將腫瘤組織行HE染色作病理觀察，RT-PCR檢測腫瘤組織JAK2、STAT3基因表達，Western blot印跡法檢測腫瘤組織中JAK2、STAT3總蛋白及磷酸化的JAK2、STAT3蛋白表達。結(jié)果：（1）干預(yù)前及干預(yù)2周后兩組裸鼠體質(zhì)量無明顯差異，但在干預(yù)后3周及4周給藥組裸鼠體質(zhì)量小于對照組（均P＜0.05）。（2）干預(yù)后各時間段給藥組腫瘤體積小于對照組（均P＜0.05），給藥組抑瘤率為21.4%。（3）對照組中腫瘤細胞侵襲結(jié)締組織、脂肪組織區(qū)域，給藥組中腫瘤組織與結(jié)締組織、脂肪組織之間邊界完整、規(guī)則；（4）兩組JAK2和STAT3基因表達的差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。（5）兩組JAK2和STAT3總蛋白表達量的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但給藥組磷酸化JAK2和STAT3蛋白表達量低于對照組（均Pgt;0.01）。結(jié)論：硼替佐米能抑制宮頸癌SiHa細胞移植瘤的生長及侵襲，其機制可能通過抑制磷酸化JAK2和STAT3蛋白表達，降低JAK2/STAT3信號通路活性。

[關(guān)鍵詞] " 硼替佐米；SiHa細胞；裸鼠；移植瘤；Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子信號通路

[中圖分類號] " R737.33 [文獻標志碼] " A [DOI] " 10.19767/j.cnki.32-1412.2024.06.002

Effect of Bortezomib on human cervical cancer SiHa cell transplanted tumor in nude mice

ZHANG Dandan1， YAO Jia1， WANG Yan1， LIU Chun2

（1Department of Obstetrics and Gynecology， the Second People’s Hospital of Nantong， Jiangsu 226002;

2Experimental Animal Center of Nantong University）

[Abstract] " Objective： To investigate the effect of Bortezomib on human cervical cancer SiHa cell transplanted tumor in nude mice and its relationship with Janus kinase 2（JAK2） and signal transducer and activator of transcription 3（STAT3） expression. Methods： The model of human cervical cancer SiHa cell transplanted tumor in nude mice was established， and the mice were randomly assigned into the control group（n=8）， and the administration group （n=8）. The changes of body mass and transplanted tumor volume in nude mice were monitored. The nude mice were sacrificed at the end of trial， and the tumors were removed for calculation of tumor inhibition rate. The tumor tissues were stained with HE. The gene expressions of JAK2 and STAT3 were detected by RT-PCR. The protein expressions of JAK2， STAT3， phosphorylated JAK2， and phosphorylated STAT3 were determined by western blot. Results：（1） There was no significant difference in weight of nude mice between the two groups before and after intervention 2 weeks， but the weight of nude mice in the administration group was significantly lower than that in the control group at 3 and 4 weeks after intervention （Plt;0.05）; （2） The tumor volume of the administration group was significantly smaller than that in the control group （P＜0.05）， and the tumor suppression rate in the administration group was 21.4%; （3） In the control group， tumor cells invaded the region of connective tissue and adipose tissue. But in the administration group， the boundary between tumor tissue and connective tissue， adipose tissue was complete and regular; （4） There was no significant difference in the gene expression of JAK2 and STAT3 between the two groups （Pgt;0.05）; （5） There was no significant difference in the protein expression of total JAK2 and STAT3， but the protein expression of phosphorylated JAK2 and STAT3 in the administration group was significantly lower than that in the control group （Pgt;0.01）. Conclusion： Bortezomib can "inhibit the growth and invasion of human cervical cancer SiHa cells transplanted tumor in nude mice， which may reduce the activity of JAK2 /STAT3 signaling pathway by inhibiting the expression of phosphorylated JAK2 and STAT3 proteins.

[Key words] " Bortezomib; SiHa cell; nude mice;transplanted tumor; JAK-STAT signaling pathway

女性惡性腫瘤中宮頸癌發(fā)病率僅次于乳腺癌，我國每年新發(fā)宮頸癌約13萬例，死亡約3萬例，特別是晚期患者療效較差，預(yù)后不良。硼替佐米（Brotezomib，BTZ）通過泛素-蛋白酶體途徑下調(diào)目的蛋白，抑制細胞增殖、促進調(diào)亡、阻止新生血管生成，從而發(fā)揮抗癌作用[1]。此前實驗證明，硼替佐米對宮頸癌SiHa細胞具有抑制作用[2]。本研究建立裸鼠宮頸癌SiHa細胞模型，探討硼替佐米對宮頸癌治療的可行性，為臨床治療提供新思路。

1 " 材料與方法

1.1 " 材料 " 人宮頸癌SiHa細胞株由南通大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室贈送。SPF級BALB／c雌性裸鼠，3周齡，體質(zhì)量13～15 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2012-0002，合格證序號：0267545。裸鼠飼養(yǎng)在南通大學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境內(nèi)，溫度（22±2）℃，相對濕度40%～70%，噪音＜60 dB，工作照度200 lx，動物照度18 lx，晝夜明暗交替時間12 h/12 h。喂飼無菌顆粒飼料，飲水為自來水瓶裝后高壓滅菌。

1.2 " 主要試劑 " Trizol總RNA提取液（美國Invitrogen公司）、異丙醇（上海生工生物技術(shù)工程有限公司）、DEPC（sigma公司）、RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司）、WB marker（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、Tris（Bio-Rad）、Gly（Bio-Rad）、PMSF（BBI）、Tween-20（上海時代生物科技有限公司）、Rabbit anti-GAPDH antibody（Santa Cruz公司）、Rabbit anti-BTG1 antibody（Proteintech公司）、Goat Anti-Rabbit IgG，HRP-linked Antibody（Cell Signaling公司）、Western一抗稀釋液（海門市碧云天生物科技公司）、Western二抗稀釋液（海門市碧云天生物科技公司）、SDS（上海生工生物技術(shù)工程有限公司）。

1.3 " 實驗方法

1.3.1 " 細胞培養(yǎng)：采用含10％胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)SiHa細胞，置于5％CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)。取對數(shù)生長期細胞，磷酸鹽緩沖液制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×107/mL，接種裸鼠。

1.3.2 " 裸鼠移植瘤模型建立：在嚴格的無菌操作條件下，于裸鼠左側(cè)腋窩中部外側(cè)皮下接種0.2 mL SiHa細胞懸液，約含2×106個細胞。接種后嚴密觀察裸鼠一般狀態(tài)，腫瘤部位有無出血和破潰。以皮下結(jié)節(jié)直徑達10 mm×10 mm為成瘤標準。

1.3.3 " 實驗分組及干預(yù)方案：待移植瘤達到成瘤標準后，將裸鼠稱重后以隨機數(shù)字表法分成給藥組和對照組，每組8只。給藥組小鼠腹腔內(nèi)注射硼替佐米，1.5 mg/kg；對照組小鼠腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水。每周注射2次，共4周。

1.3.4 " 病理檢查：干預(yù)結(jié)束后斷頸處死裸鼠，剝離腫瘤，測量腫瘤質(zhì)量和直徑。取腫瘤組織置于4%中性甲醛固定，取材、脫水、透明、石蠟包埋、切片脫蠟，HE染色、封片，光鏡下進行形態(tài)學觀察。

1.3.5 " 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測移植瘤JAK2、STAT3基因表達：（1）提取RNA：使用Trizol法提取移植瘤組織中總RNA，測量總RNA濃度和OD260/OD280比值，選擇比值在1.8～2.0之間的標本用于逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。（2）逆轉(zhuǎn)錄：于RNase-free離心管中配制RNase free ddH2O 16 μL、4×gDNA wiper Mix [4×gDNA wiper Mix是一種試劑，可以徹底去除殘留的基因組DNA污染]4 μL、總RNA 1 μL，移液器輕輕吹打混勻，42 ℃水浴2 min。逆轉(zhuǎn)錄體系：5×HiScript II qRT SuperMix II 4 μL、第一步反應(yīng)液16 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。（3）RT-PCR：反應(yīng)體系包括cDNA后產(chǎn)物1 μL，AceQ■ qPCR SYBR■ Green Master Mix（High ROX Premixed）10 μL，上下游引物各0.4 μL，滅菌蒸餾水加至總體積為20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，循環(huán)反應(yīng)95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 5 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。引物全長序列見表1。

1.3.6 " Western blot法檢測Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）總蛋白及磷酸化JAK2、STAT3蛋白表達：將小鼠腫瘤組織剪碎，裂解，研磨至均漿，搖床上冰浴30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清。BCA法測定蛋白濃度，5×SDS上樣緩沖液稀釋至相同濃度，煮沸5 min，離心取上清。采用12.5%SDS-PAGE膠，20 mA/膠恒流電泳120 min，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜35 min。室溫下5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h，α-synuclein（1∶1 000稀釋）、TH（1∶800稀釋）和β-actin（1∶5 000）抗體4 ℃孵育過夜，次日山羊抗兔/鼠HRP二抗室溫孵育1 h，ECL顯影，采用天能化學發(fā)光掃描儀對PVDF膜進行掃描。利用Image J軟件分析條帶吸光度，GraphPad 6.0軟件作圖分析。

1.4 " 觀察指標 " （1）腫瘤移植前后裸鼠體質(zhì)量變化。（2）移植瘤體積和抑瘤率：腫瘤移植后每3 d用毫米游標卡尺測量腫瘤長徑（a）、短徑（b），單位cm，保留一位小數(shù)。腫瘤體積（cm3）＝a×b2×π/6，繪制腫瘤生長曲線。根據(jù)干預(yù)結(jié)束后移植瘤質(zhì)量計算抑瘤率，抑瘤率＝（對照組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量）/對照組平均瘤質(zhì)量×100％。（3）裸鼠腫瘤組織病理檢查。（4）JAK2和STAT3轉(zhuǎn)錄水平。（5）JAK2、STAT3總蛋白及磷酸化JAK2、STAT3總蛋白。

1.5 " 統(tǒng)計學處理 " 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以■±s表示，兩組間比較應(yīng)用SNK檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 " 結(jié) " " "果

2.1 " 兩組裸鼠體質(zhì)量比較 " 干預(yù)前及干預(yù)2周后兩組裸鼠體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），干預(yù)3周及4周后給藥組裸鼠體質(zhì)量小于對照組（P＜0.05）。見表2。

2.2 " 兩組干預(yù)后移植瘤體積比較及給藥組抑瘤率 " 干預(yù)后1 W、2 W、3 W、4 W給藥組移植瘤體積小于對照組（均P＜0.05），見表３。對照組腫瘤生長曲線較陡直，生長幅度較大，給藥組腫瘤生長幅度緩慢（圖1）。干預(yù)結(jié)束后移植瘤質(zhì)量對照組為2.8±0.2 g，給藥組為2.2±0.2 g，給藥組抑瘤率為21.4%。

2.3 " 裸鼠腫瘤組織病理觀察 " 對照組腫瘤細胞侵襲結(jié)締組織和脂肪組織區(qū)域，給藥組腫瘤組織與結(jié)締組織、脂肪組織之間邊界完整、規(guī)則。見圖2。

2.4 " RT-PCR檢測結(jié)果 "兩組腫瘤組織JAK2和STAT3轉(zhuǎn)錄水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

2.5 " Western blot檢測結(jié)果 " 兩組腫瘤組織JAK2和STAT3總蛋白表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；給藥組磷酸化JAK2和STAT3總蛋白表達量低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖4。

3 " 討 " " "論

不同病理類型和分期的子宮頸惡性腫瘤有多種治療方法，對于復(fù)發(fā)性宮頸癌和晚期宮頸癌，放療效果較好，臨床運用廣泛[3-4]。但有研究顯示，盆腔放療的成功率低于70%，且單純性放療不能明顯提高患者遠期生存率，如何提升宮頸癌患者遠期生存率是臨床研究的重點[5-6]。

高危型人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素[7]。HPV早期編碼區(qū)E6、E7基因是病毒癌基因，其表達產(chǎn)物E6、E7蛋白是致癌的關(guān)鍵[8-9]。HPV E6蛋白開啟泛素-蛋白酶體途徑，使抑癌蛋白p53過度降解，導(dǎo)致細胞突變，誘發(fā)宮頸癌。蛋白酶體抑制劑通過與蛋白酶體內(nèi)的酶解活性位點結(jié)合，阻擾相關(guān)蛋白的降解。很多研究證明，蛋白酶體抑制劑可明顯下調(diào)多種惡性腫瘤的活性[10]。硼替佐米可以選擇性結(jié)合蛋白酶體活性位點的蘇氨酸，抑制蛋白酶體26 S亞單位的蛋白酶活性。26 S蛋白酶體是細胞內(nèi)一種大的蛋白質(zhì)復(fù)合體，通過泛素-蛋白酶體途徑參與多種蛋白質(zhì)的降解[1]。硼替佐米通過影響泛素-蛋白酶體途徑影響細胞內(nèi)的信號串聯(lián)和傳導(dǎo)，引起與細胞增殖分化相關(guān)蛋白發(fā)生代謝紊亂，最終促使細胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，泛素化可以影響乳腺癌細胞在裸鼠中的腫瘤形成，控制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[11-12]。本研究結(jié)果顯示，給藥組腫瘤體積、質(zhì)量小于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相較于對照組，給藥組腫瘤組織與結(jié)締組織、脂肪組織之間邊界完整、規(guī)則，說明硼替佐米可明顯抑制SiHa細胞移植瘤的生長、侵襲，控制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）信號通路由Janus激酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子構(gòu)成，屬于進化保守型信號通路，參與細胞增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等眾多生物學過程。JAK2是JAK家族中的主要調(diào)節(jié)因子，是STAT3的上游激酶。在非激活狀態(tài)下STAT3位于細胞質(zhì)中，當JAK2被激活后，使STAT3磷酸化，磷酸化STAT3由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運入細胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達，參與腫瘤生長和免疫逃逸[13-14]。JAK2/STAT3是細胞內(nèi)調(diào)控轉(zhuǎn)錄的一條關(guān)鍵通路，超過70%人類腫瘤中STAT3異?；罨遗c患者預(yù)后密切相關(guān)[15-16]。JAK/STAT信號通路與甲狀腺癌[17]、卵巢癌[16]、前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌等多種惡性腫瘤有密切關(guān)系。本研究RQ-PCR檢測結(jié)果顯示，兩組JAK2和STAT3基因表達的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明硼替佐米并非在轉(zhuǎn)錄水平抑制JAK2和STAT3。Western blot檢測結(jié)果顯示，兩組JAK2和STAT3總蛋白表達量的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但給藥組磷酸化JAK2和STAT3蛋白表達水平低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示硼替佐米可能通過抑制磷酸化JAK2和STAT3蛋白的表達，降低JAK2/STAT3信號通路的活性。

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[收稿日期] 2024-11-29

（本文編輯 " 王曉蘊）