大麥耐鹽近等基因系葉片響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

摘要：為解析大麥耐鹽基因QSl.TxNn.2H響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制，以包含耐鹽基因QSl.TxNn.2H的1對(duì)近等基因系N53（鹽敏感）和T66（耐鹽）為供試材料，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）分析對(duì)照和鹽脅迫（300 mmol/L NaCl）處理120 h的近等基因系葉片中響應(yīng)鹽脅迫的差異表達(dá)基因，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行DEG篩選、GO富集和KEGG分析，并使用qPCR技術(shù)分析基因的表達(dá)水平，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果。研究表明，從N53中共鑒定到6 652個(gè)DEG，其中3 348個(gè)基因上調(diào)，3 304個(gè)基因下調(diào)；T66中只鑒定到1 447個(gè)DEG，716個(gè)基因上調(diào)，731個(gè)基因下調(diào)。GO富集表明，DEG主要富集在細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、細(xì)胞膜等。KEGG富集表明，耐鹽系T66中特異性富集激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物MAPK信號(hào)通路，并篩選到12個(gè)在近等基因系間差異表達(dá)的基因。使用qPCR技術(shù)分析了鹽脅迫中與離子運(yùn)輸相關(guān)的HvHKT、HvNHX和HvVHP基因的表達(dá)水平，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組里基因表達(dá)趨勢(shì)一致，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。QSl.TxNn.2H可能通過(guò)調(diào)控離子相關(guān)基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表達(dá)調(diào)控大麥耐鹽性。此外，在QSl.TxNn.2H定位區(qū)間內(nèi)，有10個(gè)DEG，為QSl.TxNn.2H候選基因鑒定提供了參考。研究結(jié)果初步探索了耐鹽基因QSl.TxNn.2H調(diào)控大麥耐鹽性的分子機(jī)制，并分析了QSl.TxNn.2H定位區(qū)間內(nèi)的DEG，為大麥耐鹽育種提供了候選基因及理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：大麥；鹽脅迫；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因；KEGG富集；候選基因

中圖分類號(hào)：S512.301；S512.303" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）24-0044-09

收稿日期：2024-09-12

基金項(xiàng)目：江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：202411117241Y）；國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32301871）；省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（編號(hào)：XZNKY-CZ-2024-02）；江蘇省重點(diǎn)及面上項(xiàng)目（編號(hào)：BE2023334）；國(guó)家大麥青稞產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-05）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：李璐飛（2002—），男，山西晉中人，主要從事大麥遺傳育種研究。E-mail：2711607287@qq.com。

通信作者：朱 娟，博士，講師，主要從事大麥遺傳育種研究。E-mail：007670@yzu.edu.cn。

土壤鹽漬化是全球農(nóng)業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)，世界上約20%的灌溉農(nóng)田受到土壤鹽漬化的不利影響^［1］，且灌溉不善、氣候變化加劇了土壤鹽漬化問(wèn)題。我國(guó)鹽堿地涉及17個(gè)省區(qū)，主要分布在東北平原、西北干旱區(qū)、黃淮海平原及東部沿海地區(qū)，嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食安全^［2］。我國(guó)約有1億hm2鹽堿地，其中約0.1億hm2具有開(kāi)發(fā)利用潛力，培育推廣耐鹽作物品種，是有效利用鹽堿地、保障糧食安全生產(chǎn)的重要舉措。

鹽脅迫下，高濃度的Na+在細(xì)胞中積累，過(guò)量的Na+會(huì)導(dǎo)致K+缺失，最終產(chǎn)生毒害，破壞植物體內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)^［3］。因此，維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較高的鉀鈉離子比，維持植物體內(nèi)的離子平衡，是植物耐鹽的關(guān)鍵^［4］。目前關(guān)于鹽脅迫下植物離子平衡研究主要集中在HKT基因家族（high-affinity K+ transporter，高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）、NHX基因家族（Na+/H+ exchangers，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）及VHP基因家族（vacuolar H+-pyrophosphatase，液泡H+-焦磷酸酶）。

1995年Rubio等從小麥中克隆了第1個(gè)HKT基因TaHKT2；1，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HTK基因?qū)a+也具有轉(zhuǎn)運(yùn)作用^［5］。Rosario等研究發(fā)現(xiàn)HTK基因功能上差異與第一選擇性成孔區(qū)（P-loop ）的Ser/Gly殘基有關(guān)^［6］。Ser殘基SGGG型，多為Na+單向轉(zhuǎn)運(yùn)體，而Gly殘基GGGG型，多為Na+和K+同向轉(zhuǎn)運(yùn)體。在模式作物擬南芥中，AtHKT1可以控制Na+進(jìn)入和高親和力K+攝取^［7］。athkt1突變體的雄蕊在鹽脅迫下過(guò)度積累Na+，會(huì)限制雄蕊的伸長(zhǎng)，導(dǎo)致雄性不育。AtHKT1在擬南芥雄蕊的韌皮部和木質(zhì)部周?chē)禺愋员磉_(dá)，為鹽脅迫下提高植物產(chǎn)量提供了新策略^［8］。來(lái)自面包小麥的TmHKT1；5-A，通過(guò)增強(qiáng)排Na+能力，可以降低葉片中的Na+含量。在鹽堿地中，與不包含TmHTK1；5-A的鹽敏感系相比，含有TmHTK1；5-A的近等基因系產(chǎn)量可提高25%^［9］，具有較大應(yīng)用潛力。大麥中HvHKT1；5具有Na+轉(zhuǎn)運(yùn)能力，敲除HvHKT1；5可以減少Na+從根部向地上部轉(zhuǎn)移，從而提高大麥的耐鹽性，不同于其他禾本科作物中的HKT1；5，HvHKT1；5負(fù)調(diào)控大麥的耐鹽性^［10］。

NHX基因家族屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一價(jià)陽(yáng)離子/質(zhì)子反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（CPA1）家族，對(duì)維持離子穩(wěn)態(tài)和pH梯度有關(guān)鍵作用。在擬南芥中，鑒定到6個(gè)NHX基因，主要分布在液泡和高爾基體中，與離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存密切相關(guān)。Elias等發(fā)現(xiàn)擬南芥AtNHX1和AtNHX2定位在液泡，與野生型相比，nhx1/nhx2雙突變體液泡的酸性pH值更高，K+含量更低，表明AtNHX1和AtNHX2對(duì)控制液泡pH值和K+穩(wěn)態(tài)具有重要作用^［11］。水稻中OsNHX3受鹽脅迫正向調(diào)節(jié)表達(dá)，且在葉片中的表達(dá)水平較高，可能通過(guò)控制葉片中Na+區(qū)隔化來(lái)提高水稻的耐鹽性^［12］。Jabeen等通過(guò)分析鹽脅迫下36份野生大麥和2份栽培大麥中HvNHX基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)HvNHX1和HvNHX3在耐鹽品種中的表達(dá)始終高于鹽敏感品種，HvNHX1和HvNHX3的序列存在豐富的變異，西藏野生大麥獨(dú)有的HvNHX1和HvNHX3等位基因可以提高大麥耐鹽性，推測(cè)HvNHX1和HvNHX3是通過(guò)Na+在液泡中的隔離調(diào)節(jié)鹽脅迫下離子穩(wěn)態(tài)^［13］。

液泡H+泵焦磷酸酶類（VHP）為Na+在液泡中的區(qū)域化提供了質(zhì)子梯度。VHP產(chǎn)生的電化學(xué)梯度H+可以驅(qū)動(dòng)次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的H+梯度驅(qū)動(dòng)Na+向液泡運(yùn)輸，不僅可以減少細(xì)胞質(zhì)中多余的Na+，還可以增加細(xì)胞的滲透壓，因此在植物耐鹽性中發(fā)揮重要作用。上調(diào)表達(dá)VHP可以為液泡中Na+的區(qū)域化提供額外的能量，并賦予轉(zhuǎn)基因植物耐鹽性。HVP10是大麥Nax3控制排鈉的候選基因，HVP10敲除突變體Na+積累增加，耐鹽性降低^［14］。

RNA-Seq是一種用于研究轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序技術(shù)^［15］，近年來(lái)RNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具，通過(guò)對(duì)基因組序列已經(jīng)探明的物種進(jìn)行基因組測(cè)序，并進(jìn)行基因表達(dá)差異性分析，可以發(fā)現(xiàn)大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、插入缺失位點(diǎn)（InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（SV）等，有助于理解物種的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系^［16］。董明等通過(guò)對(duì)高粱苗期鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)高粱苗期響應(yīng)鹽脅迫主要受到激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光合作用調(diào)控，且類黃酮生物合成途徑在耐鹽品種中發(fā)揮重要作用^［17］。劉佳月等通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，挖掘出許多離子運(yùn)輸、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝過(guò)程等相關(guān)的基因，為解釋植物耐鹽機(jī)制提供了理論依據(jù)^［18］。

大麥（Hordeum vulgare L.）是世界第四大禾谷類作物，具有食用、飼用、釀酒、保健等功能。與其他糧食作物水稻、小麥相比，大麥耐鹽性強(qiáng)，但大麥耐鹽基因挖掘進(jìn)展緩慢。因此，本研究通過(guò)對(duì)1對(duì)耐鹽性有差異的近等基因系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)大麥耐鹽機(jī)制進(jìn)行初步研究，以期為大麥耐鹽遺傳育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以包含耐鹽基因QSl.TxNn.2H的1對(duì)近等基因系N53（鹽敏感）和T66（耐鹽）為試驗(yàn)材料。該近等基因系在正常生長(zhǎng)時(shí)無(wú)明顯差異，鹽脅迫后，N53葉片萎蔫甚至死亡，而T66葉片持綠，無(wú)明顯鹽害癥狀^［19-20］。

1.2 供試材料培養(yǎng)與處理

取飽滿且大小一致的N53、T66種子，用10%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，無(wú)菌水沖洗3遍，正常發(fā)芽后，選取露白一致的種子，于2023年11月種植于揚(yáng)州大學(xué)氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)置溫度15～20 ℃，12 h光照—12 h黑暗，濕度50%。播種于 3 cm×3 cm×10 cm的小黑盆中，每盆播種4粒。待大麥幼苗生長(zhǎng)至3葉1心期進(jìn)行鹽脅迫處理，鹽脅迫濃度為300 mmol/L的NaCl溶液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照加入等量的蒸餾水，均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。鹽脅迫4 d之前，近等基因系和對(duì)照間無(wú)明顯差異（葉片健康生長(zhǎng)，株高差異不顯著），而在處理5 d時(shí)（120 h），鹽敏感系N53葉片開(kāi)始出現(xiàn)輕微鹽害癥狀時(shí)（葉尖萎蔫）而T66無(wú)鹽害表現(xiàn)。因此，收集鹽脅迫下120 h的葉片液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，送樣至百邁客生物公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

采用 Trizol法提取大麥幼苗樣品的總RNA，并利用超微量分光光度計(jì)Nanodrop和生物分析儀Agilent 2100檢測(cè)RNA濃度和純度。用Oligo（dT）磁珠富集mRNA。將mRNA打斷后，以其為模板合成cDNA，經(jīng)磁珠純化、末端修復(fù)及3′-末端加 A、連接接頭和 USER 酶消化、PCR擴(kuò)增和純化完成文庫(kù)構(gòu)建，質(zhì)檢合格后利用Novaseq6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行cDNA的文庫(kù)測(cè)序。通過(guò)內(nèi)部 Perl 腳本對(duì)FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，移除接頭序列、Ploy-N序列和低質(zhì)量序列。利用HISAT2工具軟件比對(duì)，將質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)映射到參考基因組序列，過(guò)濾出干凈讀數(shù)。將鹽脅迫組和對(duì)照組樣品測(cè)序得到的序列進(jìn)行比較，基因表達(dá)水平通過(guò)FPKM （fragments per kilobase of transcript per million fragments）來(lái)估計(jì)。利用DESeq R軟件包（1.10.1）進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，以Plt;0.01，絕對(duì)值 "|log2FC|gt;1.5 作為篩選差異基因的條件。之后進(jìn)行GO分析和KEGG分析，篩選顯著性高的差異表達(dá)基因。基因本體論（GO） 通過(guò)clusterProfiler R軟件包進(jìn)行富集分析；KEGG分析中通過(guò) Kobas軟件來(lái)測(cè)試差異表達(dá)基因的統(tǒng)計(jì)富集，使用clusterProfiler R軟件包來(lái)尋找顯著富集的KEGG途徑。將差異表達(dá)基因分別與GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得相應(yīng)差異表達(dá)基因的注釋信息。為確保轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，選取與大麥鹽脅迫相關(guān)的HvNHX、HvHKT及HvVHP基因，進(jìn)行qPCR驗(yàn)證?；虻木幋a區(qū)序列于Ensembleplants 網(wǎng)站 （https：//plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index）下載，根據(jù)其序列長(zhǎng)度，使用 primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)熒光qPCR引物（表1），以大麥GAPDH（HORVU.MOREX.r3.7HG0703580）基因?yàn)閮?nèi)參基因，由擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成。在7500 Real-time PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，具體程序：95 ℃ 變性2 min；95 ℃退火10 s；60 ℃延伸30 s。利用2^-ΔΔCT值，并進(jìn)行定量分析。重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下大麥幼苗轉(zhuǎn)錄組分析

對(duì)對(duì)照（CK）和鹽脅迫處理（S）下12個(gè)cDNA文庫(kù)（每個(gè)樣品3個(gè)獨(dú)立生物學(xué)重復(fù)）進(jìn)行高通量測(cè)序，各樣本凈讀數(shù)均大于19 507 294，凈數(shù)據(jù)量大于5.84 G，GC含量在53.75%～55.34%，說(shuō)明高通量測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，數(shù)據(jù)量充足，GC含量穩(wěn)定。對(duì)于二代測(cè)序，通常認(rèn)為質(zhì)量控制參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)為Q20大于95%、Q30大于85%，本研究測(cè)序結(jié)果中Q20 堿基比例大于97.48%，Q30堿基百分比大于93.80%，意味著測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，滿足轉(zhuǎn)錄組分析的要求（表2）。

將樣品比對(duì)至大麥參考基因組，各樣品比對(duì)基因組讀數(shù)在94.94%以上，其中唯一比對(duì)讀數(shù)在91.15% 以上，表明測(cè)序結(jié)果與參考基因組具有較高的相似性和一致性。唯一比對(duì)讀數(shù)的比例稍低可能是由于大麥基因基因組部分序列高度保守或者是存在高GC含量區(qū)域，導(dǎo)致部分讀數(shù)無(wú)法唯一地映射到參考基因組上（表3）。

為驗(yàn)證樣品的可重復(fù)性，對(duì)N53和T66的12個(gè)樣品進(jìn)行PCA（圖1）。降維之后，4個(gè)試驗(yàn)組的3個(gè)生物重復(fù)距離相近，重復(fù)性好。同時(shí)N53CK和T66CK樣品距離相近，N53S和T66S距離遠(yuǎn)，說(shuō)明N53CKY和T66CKY之間基因表達(dá)差異較小，而N53S和T66S之間基因表達(dá)差異較大。

2.2 差異表達(dá)基因（DEG）鑒定

鹽脅迫與對(duì)照相比，從N53中共鑒定到6 652個(gè)DEG，其中3 348個(gè)基因上調(diào)，3 304個(gè)基因下調(diào)；T66中只鑒定到1 447個(gè)DEG，716個(gè)基因上調(diào)，731個(gè)基因下調(diào)；鹽脅迫下N53和T66相比，共鑒定到 4 845 個(gè)DEG，其中2 103個(gè)基因上調(diào)，2 742 個(gè)基因下調(diào)（圖2-A）。進(jìn)一步對(duì)N53和T66上調(diào)和下調(diào)的差異基因進(jìn)行分析，繪制韋恩圖（圖 2-B、圖2-C），在N53和T66中，515個(gè)DEG均上調(diào)表達(dá)，455個(gè)DEG均下調(diào)表達(dá)。

2.3 差異基因GO富集分析

GO富集分析可以將DEGs分為生物學(xué)過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecular function）3個(gè)層面。對(duì)N53和T66的DEG分別進(jìn)行GO富集分析。N53富集的結(jié)果顯示，從生物學(xué)過(guò)程層面看，DEG以細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、生物調(diào)控和對(duì)刺激反應(yīng)為主；從細(xì)胞組分層面看，細(xì)胞解刨實(shí)體占比最多，細(xì)胞內(nèi)受體其次，含蛋白質(zhì)復(fù)合物最少；分子功能層面看，則以結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活動(dòng)為主。T66的GO富集結(jié)果與N53相似（圖3）。

進(jìn)一步從3個(gè)層面進(jìn)行分析（圖4），N53的生物學(xué)過(guò)程在對(duì)蛋白磷酸化、熱反應(yīng)、蛋白質(zhì)復(fù)合物寡聚化、過(guò)氧化氫反應(yīng)、水反應(yīng)等過(guò)程顯著富集；T66的生物學(xué)過(guò)程在蛋白磷酸化、熱反應(yīng)、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、L-脯氨酸生物合成過(guò)程、對(duì)生物刺激的反應(yīng)等過(guò)程顯著富集。分子功能富集結(jié)果顯示，N53最顯著富集的6條GO是ATP結(jié)合、金屬離子結(jié)合、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性、催化活性、跨膜受體激酶活性。T66最顯著富集的6條GO分別是ATP結(jié)合、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、鈣離子結(jié)合、多糖結(jié)合、蛋白激酶活性和跨膜受體激酶活性。細(xì)胞組分富集結(jié)果顯示，N53中的DEG在光系統(tǒng)Ⅱ放氧復(fù)合體、葉綠體基質(zhì)、膜的外源性成分等顯著富集。T66中的DEG在質(zhì)膜、膜的整體成分和液泡部分顯著富集。

2.4 差異基因的KEGG通路分析

為了研究在N53和T66中響應(yīng)鹽脅迫的生物學(xué)通路，分別對(duì)N53和T66中DEGs進(jìn)行KEGG通路分析。N53的KEGG分析結(jié)果顯示，最顯著富集的5條通路分別是碳代謝、氨基酸生物合成、亮氨酸和異亮氨酸降解、戊糖磷酸途徑和乙醛酸和二羧酸代謝。T66的KEGG分析結(jié)果顯示，DEG最顯著富集的5條通路分別是淀粉和蔗糖代謝、植物-病原菌互作、精氨酸和脯氨酸代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。以上這些代謝途徑可能是大麥響應(yīng)鹽脅迫的重要途經(jīng)，其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在耐鹽材料T66中顯著富集，該通路可能對(duì)提高大麥耐鹽性起關(guān)鍵作用（圖5）。

2.5 富集通路差異基因挖掘

對(duì)T66特有的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集的DEG，以FPKMgt;1、｜log2FC｜gt;1.5、Plt;0.01為標(biāo)準(zhǔn)，篩選到78個(gè)DEG。分析78個(gè)DEGs在N53和T66中的表達(dá)水平，用log2FC繪制圖6。大部分基因在N53和T66中的表達(dá)變化水平一致，但12個(gè)DEG在2個(gè)材料中差異表達(dá)，HORVU.MOREX.r3.UnG0753020、HORVU.MOREX.r3.3HG0220680、HORVU.MOREX.r3.1HG0000690、 HORVU.MOREX.r3.5HG0484690、HORVU.MOREX.r3.4HG0331910在N53中表達(dá)水平無(wú)顯著變化，在T66中顯著下調(diào)表達(dá)；HORVU.MOREX.r3.7HG0642890在N53中顯著下調(diào)表達(dá)，在T66中顯著上調(diào)表達(dá)。HORVU.MOREX.r3.6HG0561620、HORVU.MOREX.r3.3HG0273500、HORVU.MOREX.r3.2HG0188860、HORVU.MOREX.r3.3HG0304380在N53中顯著上調(diào)表達(dá)，在T66顯著下調(diào)表達(dá)。

2.6 qPCR驗(yàn)證

以FPKMgt;1、Plt;0.01、｜log2FC｜gt;1.5為差異基因標(biāo)準(zhǔn)，分析鹽脅迫中鈉鉀離子運(yùn)輸關(guān)鍵基因HKT基因、NHX基因和VHP基因的表達(dá)水平，得到HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2、NHX7和HvVHP1.1為差異表達(dá)基因，其中HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2在N53中顯著上調(diào)表達(dá)，NHX7在N53和T66中均顯著下調(diào)表達(dá)，HvVHP1.1在N53中顯著下調(diào)表達(dá)。

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的DEG的可靠性，利用qPCR驗(yàn)證以上7個(gè)差異表達(dá)基因，以log2FC繪制熱圖（圖7）。差異基因的轉(zhuǎn)錄水平和qPCR結(jié)果趨勢(shì)一致，證明了本研究數(shù)據(jù)的可靠性。也表明QSl.TxNn.2H可能通過(guò)調(diào)控離子相關(guān)基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表達(dá)調(diào)控大麥耐鹽性。

3 討論

植物的耐鹽性易受環(huán)境影響 是非常復(fù)雜的數(shù)量性狀^［21］。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為挖掘植物耐鹽基因提供了高效、低成本的方法。本研究通過(guò)對(duì)1對(duì)耐鹽性有差異的近等基因系N53和T66進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，在N53和T66中分別篩選出6 652個(gè)和 1 447 個(gè)DEG，N53中3 348個(gè)基因上調(diào)，3 304個(gè)基因下調(diào)；T66中716個(gè)基因上調(diào)，731個(gè)基因下調(diào)。在鹽敏感材料N53中的DEG數(shù)目顯著多于耐鹽材料T66，說(shuō)明N53的基因表達(dá)水平受鹽脅迫的影響更大。Kong等對(duì)RPY geng（耐鹽品種）和Chao 2R（鹽敏感品種）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，Chao 2R的DEG顯著多于RPY geng，本研究結(jié)果與之一致。鹽脅迫對(duì)鹽敏感材料的基因轉(zhuǎn)錄水平影響更大^［22］。

DEG的GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物MAPK信號(hào)通路在T66中特異性富集。絲氨酸/蘇氨酸激酶通過(guò)磷酸化下游信號(hào)蛋白，把細(xì)胞外信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)，影響基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)多種生物學(xué)功能^［23］。PP2CA（protein phosphatase 2 catalytic subunit alpha）是4種主要的絲氨酸/蘇氨酸激酶之一，也是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路核心負(fù)調(diào)控部分^［24］。KIM等發(fā)現(xiàn)水稻中OsRF1靶向OsPP2C09蛋白進(jìn)行泛素化和降解，OsPP2C09蛋白的降解，使野生型對(duì)鹽脅迫更加敏感^［25］。Wu等也發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)RGLG1可以增強(qiáng)PP2CA和其他可能的PP2Cs的降解，調(diào)節(jié)擬南芥耐鹽性^［26］。KEGG分析富集了大量植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因，該研究中近等基因系的DEGs也發(fā)現(xiàn)了大量ABA通路相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如bZIP、CBL、WRKY等，以絲氨酸/蘇氨酸活性為關(guān)鍵的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能對(duì)大麥鹽脅迫響應(yīng)有重要意義。

QSl.TxNn.2H是影響N53和T66耐鹽性的關(guān)鍵位點(diǎn)，位于大麥2H上10 217 825～15 025 898 bp的區(qū)域^［27］。本研究以FPKMgt;1，｜log2FC｜gt;1.5，Plt;0.01為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)N53和T66該區(qū)域的DEG進(jìn)行篩選，共鑒定到10個(gè)DGE（表4）。HORVU.MOREX.r3.2HG0099930編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶，是細(xì)胞內(nèi)糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，是鹽脅迫下維持光合作用和植物發(fā)育的重要因子^［28］。HORVU.MOREX.r3.2HG0101890編碼甲基轉(zhuǎn)移基因，是鹽敏感系N53中表達(dá)水平上調(diào)程度最大的基因，Hafeez等研究發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移基因?qū)γ迣俚柠}脅迫、纖維發(fā)育和次級(jí)細(xì)胞壁的形成有多重反應(yīng)^［29］。甲基轉(zhuǎn)移基因主要參與次級(jí)代謝和代謝途徑，次生代謝產(chǎn)物（如木質(zhì)素、類黃酮、酚酸）在植物響應(yīng)非生物脅迫時(shí)增加，為植物提供更好的耐受性。

4 結(jié)論

綜上所述，通過(guò)對(duì)近等基因系N53和T66葉片在對(duì)照和鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析，篩選到在近等基因系間差異表達(dá)的基因4 845個(gè)，其中2 103個(gè)上調(diào)表達(dá)，2 742個(gè)下調(diào)表達(dá)。GO及KEGG富集分析表明植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是T66耐鹽性調(diào)控的的關(guān)鍵通路。利用qPCR技術(shù)分析與離子運(yùn)輸相關(guān)的HvHKT、HvNHX和HvVHP基因在N53和T66葉片中的表達(dá)水平，QSl.TxNn.2H可能通過(guò)調(diào)控離子相關(guān)基因如HvNHX1、HvNHX4、HvHTK1.3、HvHTK2.2、HvVHP1.2和HvVHP1.1的表達(dá)調(diào)控大麥耐鹽性。在QSl.TxNn.2H定位區(qū)間內(nèi)存在10個(gè)差異表達(dá)基因，為QSl.TxNn.2H候選基因鑒定提供了參考。

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