HNRNPF 促進前列腺癌的增殖、遷移和侵襲

王適雨 謝雪鋒 陳 剛△

（1復旦大學附屬金山醫(yī)院臨床醫(yī)學研究中心， 2泌尿外科 上海 201508）

前列腺癌是男性中最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅男性身體健康［1］。早期局限性前列腺癌可通過根治性切除術得到較好的療效，而進展期前列腺癌一般行雄激素剝奪治療［2］，但是多數(shù)行雄激素剝奪治療的進展期前列腺癌患者會逐漸發(fā)展至去勢抵抗階段［3］，此時患者會面臨很高的死亡風險［2］。因此，有必要尋找影響前列腺癌發(fā)生發(fā)展的新的靶點。

核不均一核糖核蛋白F（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins F，HNRNPF）是HNRNP 蛋白家族的成員之一，其可以與核不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）結合，在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可以影響hnRNA 的剪接和修飾、mRNA 的成熟和穩(wěn)定性以及mRNA 的核漿轉運等過程［4］。HNRNPF 在人體各器官組織中廣泛表達，且在前列腺中的表達非常豐富［5］。已有多項研究報道HNRNPF 在多種惡性腫瘤中呈高表達［6-7］，提示HNRNPF可能是一個重要的原癌基因。目前HNRNPF 在前列腺癌中的表達特征和生物學功能尚不明確。

本研究首先對HNRNPF 在前列腺癌中的表達特征及其與前列腺癌患者臨床病理特征之間的相關性進行了分析，然后通過細胞生物學實驗探究其對前列腺癌細胞PC-3 和DU145 的增殖、遷移和侵襲能力的影響。本研究有助于提高對于HNRNPF在前列腺癌中作用的認識，有望為探索新的前列腺癌診療靶點提供幫助。

材 料 和 方 法

數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)集癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）是一個收集了多種惡性腫瘤的患者臨床數(shù)據(jù)及相應基因表達數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)庫［8］，本研究分析了HNRNPF 在TCGA數(shù)據(jù)庫中的前列腺癌數(shù)據(jù)集中的表達特征、免疫浸潤特征和臨床相關性?；虮磉_數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）是一個儲存高通量芯片或測序數(shù)據(jù)集的公共數(shù)據(jù)庫［9］，本研究分析了HNRNPF 在GEO 數(shù)據(jù)庫中的6 個前列腺癌數(shù)據(jù)集（GSE35988、GSE46602、GSE60329、GSE69223、GSE70770、GSE114740）中的表達特征。

細胞培養(yǎng)人前列腺癌細胞PC-3、DU145 和人胚胎腎細胞HEK293T 采購自上海富衡生物科技有限公司。PC-3 細胞使用DME/F12 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司），DU145 和HEK293T 細胞使用DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）。培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清（以色列Biological Industries 公司）和1%青霉素-鏈霉素溶液，細胞培養(yǎng)于37 ℃恒溫、5%CO2、潮濕的環(huán)境中。

質(zhì)粒的構建和轉染靶向HNRNPF mRNA 的shRNA 序列如下（5’-3’）：sh-HNRNPF1，AGCGACCGAGAACGACATTTACTCGAGTAAATGTCGTTCTCGGTCGCTTTTTT；sh-HNRNPF2，TGGATCAGAAGATGATGTAAACTCGAGTTTACATCATCTTCTGATCCATTTTT。以無意義shRNA 為對照：shNC，TTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTT。 將上述序列克隆至載體質(zhì)粒pLKO.1-Puro 中，與輔助質(zhì)粒pMD2.G 和pSPAX2共轉染至HEK293T 細胞中，收集病毒上清液感染前列腺癌細胞PC-3 和DU145，使用2 μg/mL 的嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞。

RNA 提取和實時定量PCR使用RNA 快速提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）提取細胞中的總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix（日本Takara 公司）進行逆轉錄。使用BeyoFast SYBR Green qPCR Mix（2×，High ROX，上海碧云天生物技術有限公司）進行實時定量PCR。以β-actin 為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCT法計算基因相對表達量。本研究所用引物序列如下（5’-3’）：HNRNPF，ACTGCCAGGAGGTACATTGG（正向）/CTGAGGTCTCTCCCGAACAG（反向）；β-actin，CATGTACGTTGCTATCCAGGC（正向）/CTCCTTAATGTCACGCACGAT（反向）。

Western blot 實驗使用10%的SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，然后將蛋白質(zhì)電轉移到經(jīng)甲醇激活的PVDF 膜（美國Millipore 公司）上，使用5%的脫脂牛奶封閉PVDF 膜30 min，使用HNRNPF 和GAPDH（美國Proteintech 公司）一抗在 4 ℃下孵育過夜，使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL 化學發(fā)光檢測系統(tǒng)記錄實驗結果。

細胞增殖實驗細胞增殖曲線參考Hanniford等［10］報道的實驗步驟完成。將前列腺癌細胞以5 000 個/孔的密度鋪至96 孔板中，分別培養(yǎng)0、24、48、72 h 后，用4%多聚甲醛固定液固定細胞，然后使用1%結晶紫染液對細胞進行染色，洗滌后使用分光光度計檢測595 nm 波長處的吸光度值，繪制吸光度隨培養(yǎng)時間變化的曲線；EdU 實驗使用Alexa Fluor 555 EdU 細胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）完成，使用倒置熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）進行拍攝；集落形成實驗：將前列腺癌細胞以1 000 個/孔的密度鋪至6 孔板中培養(yǎng)14天，使用4%多聚甲醛溶液固定細胞，使用1%結晶紫染液對細胞進行染色。

細胞遷移、侵襲實驗Transwell 實驗：在Transwell 上層小室中加入4 萬個（DU145）或8 萬個（PC-3）細胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸，體積統(tǒng)一為100 μL。在下層小室中加入500 μL 含有20%胎牛血清的DMEM 或DME/F12 培養(yǎng)基。置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h（DU145）或48 h（PC-3）后，使用4%多聚甲醛固定液固定細胞，使用1%結晶紫染液對細胞進行染色，洗滌后使用棉簽擦掉上層小室中的細胞，顯微鏡下觀察細胞遷移至下層小室的情況。在每個Transwell 上層小室中加入100 μL 用無血清培養(yǎng)基稀釋至250 μg/mL 的Matrigel 基質(zhì)膠，于細胞培養(yǎng)箱中靜置過夜。次日吸棄小室內(nèi)仍然呈液態(tài)的基質(zhì)膠后，可見小室底面內(nèi)側覆蓋了一層凝固的基質(zhì)膠。使用這種經(jīng)過處理的小室進行上述實驗即可檢測細胞的侵襲能力。劃痕愈合實驗：將前列腺癌細胞鋪入6 孔板中培養(yǎng)至100%匯合度，使用200 μL 移液器槍頭在細胞中劃出等寬的劃痕，然后將完全培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，在劃痕后0、24、48 h 觀察劃痕寬度的變化情況。

統(tǒng)計學分析使用R（v.3.6.3）或GraphPad Prism（v.8.0.2）進行統(tǒng)計分析和繪圖。使用獨立樣本t檢驗（數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布）或Wilcoxon 秩和檢驗（數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布）進行2 組樣本間的比較檢驗，使用單因素方差分析進行3 組樣本間的比較檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

HNRNPF 在前列腺癌中高表達本研究分析了GEO 數(shù)據(jù)庫中的6 個前列腺癌數(shù)據(jù)集（表1），在這些數(shù)據(jù)集中，HNRNPF 在前列腺癌標本中的表達均顯著高于正常前列腺組織（圖1A～F）。對TCGA 數(shù)據(jù)庫中配對的前列腺癌樣本數(shù)據(jù)的分析顯示，HNRNPF 在前列腺癌標本中的表達顯著高于正常前列腺組織（圖1G）。

圖1 HNRNPF mRNA 在GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)集中的前列腺癌和正常前列腺癌標本中的表達Fig 1 The expression of HNRNPF mRNA in prostate cancer and normal prostate tissues in GEO and TCGA datasets

表1 本研究納入的GEO 數(shù)據(jù)集信息Tab 1 Details of GEO datasets included in this study

HNRNPF 與前列腺癌患者臨床病理特征之間的相關性臨床相關性分析基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中前列腺癌患者的臨床信息和基因表達數(shù)據(jù)完成。首先使用Logistic 回歸法分析，結果顯示HNRNPF表達量更高的患者具有更高的T 分期（P=0.006）和Gleason 評分（P=0.019），與年齡、N 分期、M 分期和前列腺特異性抗原（prostate specific antigen， PSA）水平的關聯(lián)不顯著（表2）。當以不同的臨床病理特征對患者進行分組，比較具有不同特征患者的前列腺癌標本中HNRNPF 表達量的差異時，結果顯示T分期、PSA 水平、Gleason 評分更高的患者，其前列腺癌標本中HNRNPF 的表達量顯著升高（圖2A～C）。，HNRNPF 表達量更高的患者，其總生存期和疾病特異性生存期均較短（圖2D～E）。

圖2 HNRNPF mRNA 表達量與前列腺癌患者臨床病理特征之間的相關性Fig 2 Relationship between HNRNPF mRNA expression and clinicopathologic characteristics in prostate cancer

表2 HNRNPF 與前列腺癌患者臨床病理特征之間的Logistic 回歸分析Tab 2 Logistic regression of HNRNPF expression and clinicopathological characteristics in prostate cancer

HNRNPF 的表達量與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤相關免疫浸潤分析基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中前列腺癌數(shù)據(jù)集的基因表達數(shù)據(jù)完成。分析結果顯示HNRNPF 的表達量與多數(shù)類型的免疫細胞的浸潤水平呈負相關（圖3A），其中與漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）（圖3B、F）和自然殺傷（natural killer，NK）細胞（圖3C、G）的負相關程度最為顯著。另一方面，HNRNPF 的表達量與2 型輔助型T（T helper 2，Th2）細胞（圖3D、H）和中央記憶型T（central memory T，Tcm）細胞（圖3E、I）呈較為顯著的正相關。

圖3 HNRNPF mRNA 表達量與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞浸潤水平的關系Fig 3 Relationship between HNRNPF mRNA expression and immune infiltration in the tumor microenvironment

沉默HNRNPF 基因可抑制前列腺癌細胞增殖能力首先使用RNA 干擾法在前列腺癌細胞系PC-3 和DU145 中成功敲低HNRNPF mRNA 和蛋白質(zhì)的表達量（圖4A～C）。細胞增殖曲線顯示沉默HNRNPF后，前列腺癌細胞的生長速度顯著降低（圖4D～E）。EdU 實驗顯示，沉默HNRNPF后，EdU 陽性細胞的比例顯著下降（圖4F～I），這表明固定細胞時正處于分裂增殖狀態(tài)的前列腺癌細胞比例下降，證明前列腺癌細胞增殖能力受損。此外，HNRNPF被沉默后，前列腺癌細胞形成的單克隆集落的數(shù)量和大小均下降（圖4J～L），這反映了細胞定植能力和定植后的增殖速度均下降。

圖4 沉默HNRNPF 抑制前列腺癌細胞增殖Fig 4 HNRNPF silencing inhibits prostate cancer cell proliferation

沉默HNRNPF 基因可抑制前列腺癌細胞遷移、侵襲能力Transwell 實驗證實沉默HNRNPF后，前列腺癌細胞穿過小孔遷移/侵襲至下層小室的數(shù)量顯著下降（圖5A、B、E、F）。劃痕愈合實驗證實沉默HNRNPF后，前列腺癌細胞想劃痕中線遷移的速度顯著降低（圖5C、D、G、H）

圖5 沉默HNRNPF 抑制前列腺癌細胞遷移和侵襲Fig 5 HNRNPF silencing inhibits prostate cancer cell migration and invasion

討 論

HNRNP 蛋白家族在hnRNA 的剪接、成熟、穩(wěn)定、轉運等過程中發(fā)揮重要作用［17］。也有文獻報道HNRNP 可以影響circRNA 和lncRNA 的形成［18-19］。已有多個HNRNP 蛋白家族成員被報道具有促癌作用，例如HNRNPA1 可促進肺癌和乳腺癌的進展［20-21］；HNRNPA2/B1 對多個癌癥細胞系的增殖能力有影響［22］；HNRNPL 可促進前列腺癌細胞增殖［19］。

HNRNPF 已被報道與直腸癌、膀胱癌、甲狀腺癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關［6，23-24］，但目前其在前列腺癌中扮演的角色尚無相關研究，有研究報道HNRNPF 在前列腺組織中的表達非常豐富［5］，這提示我們HNRNPF 可能對保持前列腺的正常生理功能非常重要，其表達異常可能會與前列腺疾病的發(fā)生發(fā)展有關。本研究發(fā)現(xiàn)，在多個前列腺癌數(shù)據(jù)集中，HNRNPF 在前列腺癌組織中的表達量均顯著高于癌旁，且癌組織中HNRNPF 的表達量更高的患者其癌癥分期更高、預后更差。而沉默前列腺癌細胞中的HNRNPF之后，前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力均有顯著下降，但這其中的作用機制尚待研究。

RNA 選擇性剪接是真核細胞中廣泛存在的生物學過程［25］，這一過程的異?？赡軙е露喾N疾?。?6］。HNRNPF 是一個重要的選擇性剪接調(diào)節(jié)因子，有文獻報道HNRNPF 可通過其3’末端修飾功能促進膀胱癌細胞的遷移和侵襲［23］。還有文獻報道HNRNPF 在癌癥中可以調(diào)節(jié)RNA G-四鏈體介導的RNA 翻譯和RNA 剪接［27］。Montero-Conde等［24］通過高通量測序發(fā)現(xiàn)沉默HNRNPF后，細胞中出現(xiàn)174 項剪接異常，這些異常會影響RTK/RAS/MAPK 和PI3K/AKT/MTOR 等多個癌癥相關信號通路。

免疫細胞浸潤和免疫微環(huán)境對前列腺癌發(fā)生發(fā)展也具有重要影響［28］。本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPF 的表達量與前列腺癌腫瘤微環(huán)境中pDC 和NK 細胞的浸潤呈負相關，與Tcm 和Th2 細胞的浸潤呈正相關。pDC 可以分泌大量Ⅰ型干擾素，促進抗腫瘤免疫［29］；NK 細胞可以直接殺傷腫瘤細胞并增強抗體和T 細胞的抗腫瘤功能［30］。pDC 和NK 細胞的缺失已被報道與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關［31-32］。Tcm 是原始T 細胞經(jīng)抗原刺激后產(chǎn)生的記憶細胞，其本身不直接發(fā)揮功能，而是當其再次接受相同抗原刺激后轉化為效應記憶T（effector memory T，Tem）細胞發(fā)揮功能［33］。Th2 細胞主要在2 型免疫途徑中發(fā)揮輔助作用，提高抗體的產(chǎn)生以應對外源性病原體［34］。目前未見Tcm 和Th2 細胞與癌癥直接相關的報道。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)HNRNPF 在前列腺癌中呈高表達，高表達HNRNPF 的患者具有更高的癌癥分期和更短的生存期，在前列腺癌細胞中沉默HNRNPF可顯著抑制前列腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力。本研究提示HNRNPF 能夠促進前列腺癌的惡性進展，顯著的臨床相關性使其具有成為前列腺癌診斷或預后評估標志物的潛力。

作者貢獻聲明王適雨 實驗設計和執(zhí)行，數(shù)據(jù)整理和分析，論文撰寫和修訂。謝雪鋒 數(shù)據(jù)整理和分析。陳剛 實驗設計和指導，論文修訂。

利益沖突聲明所有作者均聲明沒有利益沖突。