21色流式檢測人非小細(xì)胞肺癌組織中免疫細(xì)胞亞群方案的建立

郭婷婷 謝鴻觀

肺癌是全球發(fā)病率極高的癌癥之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，每年約2萬新發(fā)病例和1.76萬死亡病例[1]。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），其中NSCLC約占85%[2]。NSCLC由于早期癥狀不明顯，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期狀態(tài)，且易對化療和放療抵抗，致5年生存率僅為10%-20%[3]。而肺癌的發(fā)生和進(jìn)展與免疫微環(huán)境的改變相關(guān)，因此通過檢測肺癌組織中免疫細(xì)胞亞群的比例可監(jiān)測疾病的進(jìn)展及預(yù)后等[4,5]。

目前，流式細(xì)胞術(shù)能快速進(jìn)行各種免疫細(xì)胞量和功能的檢測[6]，對臨床診斷與治療具有指導(dǎo)意義[7]。常規(guī)流式方案分析的參數(shù)少，需要多管聯(lián)合分析，細(xì)胞需求量大，耗時較長，結(jié)果不夠穩(wěn)定及準(zhǔn)確，解析各細(xì)胞亞群之間和細(xì)胞表型相互關(guān)系的能力弱[8]。隨著流式細(xì)胞儀的更新?lián)Q代，檢測的熒光通道增加，多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)出來[9]。多色流式能快速準(zhǔn)確并穩(wěn)定地檢測多個指標(biāo)，從而識別出罕見細(xì)胞群體，為疾病的診斷、藥物開發(fā)提供強(qiáng)大的工具[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了在單管中加入20種熒光抗體和1種熒光染料以檢測人肺癌組織中免疫細(xì)胞主要亞群的流式檢測方案，可實(shí)現(xiàn)單管同時分析人肺癌組織中多種免疫細(xì)胞的表達(dá)和細(xì)胞亞群間的關(guān)聯(lián)，并同時呈現(xiàn)免疫細(xì)胞功能與分化狀態(tài)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 6份健康志愿者外周血樣本和6例肺癌樣本取自四川大學(xué)華西醫(yī)院，肺癌患者病理診斷均為NSCLC。受試者均簽署知情同意書。

1.1.2 試劑 熒光抗體分化簇（cluster of differentiation, CD）3、CD19、CD27、CD69、CD56、CD8、CD25、CD127、趨化因子受體8（chemokine receptor 8, CCR8）、CD39、CD11c、CD62L、CCR7、CD45RA購自美國BD公司；CD45、CD4、CD38、CD103、人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen,HLA）-DR、程序性死亡受體1（programmed cell death 1,PD-1）購自Biolegend公司；LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain（L/D）、BV stain buffer購自Sigma-Aldrich公司；胎牛血清（FBS, 500 mL, 319801-5）購自ZETA LIFE公司；IV型膠原酶（50 U/mL, 17104-019）購自Thermo Fisher公司；脫氧核糖核酸酶I（DNase I, 20 U/mL, 10104159002）購自Roche公司。

1.1.3 儀器 Symphony A5流式細(xì)胞儀（美國BD Bioscience）配置355、405、488、561、640 nm激光器。

1.2 方法

1.2.1 抗體或熒光素搭配 根據(jù)流式細(xì)胞儀的配置，包括激光和檢測濾片等以及多色流式中抗原抗體結(jié)合的強(qiáng)弱搭配原則，即強(qiáng)表達(dá)抗原選擇弱熒光素抗體，反之。通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)找到抗體與熒光素的最佳搭配方案。表1為所需抗體信息。

表1 21色流式檢測人肺癌組織中免疫細(xì)胞亞群方案Tab 1 The 21-color panel for flow cytometry of leukocytic subsets in human lung cancer tissue

1.2.2 樣本采集

1.2.2.1 外周血樣本處理 選取6名健康成年志愿者，男女各3名，年齡范圍25-30歲。采集外周靜脈血5 mL于含有EDTA抗凝劑的真空采血管中，顛倒混勻，轉(zhuǎn)移到離心管中，以1:1比例，將外周血緩慢加入Ficoll液中，4oC、800g離心20 min，吸取白膜層于5 mL RPMI-1640中，4oC、500g離心7 min，棄上清。PBS清洗，4oC、500g離心5 min，獲取外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。將細(xì)胞重懸于PBS，計(jì)數(shù)后備用[11]。

1.2.2.2 肺癌組織樣本處理 收集NSCLC樣本，共6例。手術(shù)切除的NSCLC樣本，盡量去除壞死組織，PBS沖洗，置于10% FBS+RPMI-1640中，冰上運(yùn)輸。提前配置10 mL 0.5 mg/mL IV型膠原酶+RPMI-1640和10 mL 2%FBS+RPMI-1640，冰上預(yù)冷，待組織取回后，將組織置于2%FBS+RPMI-1640中，剪取約5 mm×5 mm×5 mm，盡量剪碎，加入5 mL消化酶，37oC培養(yǎng)箱旋轉(zhuǎn)消化30 min。消化完成后，4oC、100g離心1 min，將未消化的組織離心到管底，吸取上清。加入1倍體積的2% FBS+RPMI-1640終止消化，70 μm濾網(wǎng)過濾，4oC、500g離心5 min、去上清。1 mL 2%FBS+RPMI-1640重懸，40 μm濾網(wǎng)過濾，將細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)成1.0×107個/mL備用[12]。

1.2.3 抗體濃度滴定 方案里的所有抗體均進(jìn)行濃度滴定，共設(shè)立6個抗體的工作濃度梯度，分別為0.0、0.5、1.0、2.0、4.0及8.0 μg/mL，根據(jù)反應(yīng)體系（100.00 μL）及質(zhì)量濃度（200.00 μg/mL）分別加入各對應(yīng)的抗體體積，即0.00、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 μL。以CD4抗體滴定為例，準(zhǔn)備6支流式管，通過倍比稀釋的方法，在第1管中加入96 μL PBS，其余5管中分別加入50 μL PBS。于第1管中加入4 μL CD4抗體，充分混勻后吸出50 μL至第2管，依次加入第5管，混勻后取50 μL混合液丟棄，第6管則作為空白對照組。各管中均加入50 μL已準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液，完全混勻后室溫避光孵育15 min，加入1 mL PBS，500g離心5 min清洗。棄上清，300 μL PBS重懸，上機(jī)檢測，收集約106個Events，F(xiàn)lowjo 10.8.0軟件分析，計(jì)算CD4的染色指數(shù)（stain index,SI）。選取最大SI值，即陽性與陰性細(xì)胞群分離度最大的值為該抗體最適濃度。其余抗體滴定及結(jié)果分析均依照此方法進(jìn)行。

1.2.4 電壓優(yōu)化、減一色對照及單色染色 在流式檢測過程中，以空白對照組確定基準(zhǔn)電壓，后在此基礎(chǔ)上依次增加40 V，共檢測6個不同的電壓值，再通過計(jì)算SI值找到該抗體最適電壓，即SI值最大時的電壓值。減一色染色指不加多色染色方案中某一種抗體或染料，驗(yàn)證其余抗體或染料對該相應(yīng)通道的影響。單色染色為確定每個抗體或染料的最佳質(zhì)量濃度后，并用于檢測通道的補(bǔ)償調(diào)節(jié)。

1.2.5 流式方案驗(yàn)證 根據(jù)已確定好的流式檢測條件，檢測分析6例健康人PBMCs。將6份抗體及染料混合于300 μL PBS中，再分別加50 μL于各管中，分別加入已準(zhǔn)備好的50 μL細(xì)胞懸液并充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入1 mL PBS，500g離心5 min，清洗，棄上清，300 μL PBS重懸，上機(jī)檢測，收集約106個Events，F(xiàn)lowjo 10.8.0軟件分析。

1.2.6 樣本檢測 根據(jù)已確定好的流式檢測方案，檢測分析6例人NSCLC組織樣本。將20種熒光抗體和L/D染料按滴定好的濃度混合于50 μL PBS中，加入已準(zhǔn)備好的50 μL細(xì)胞懸液并充分混勻，室溫下避光孵育15 min，加入1 mL PBS，400g離心5 min，清洗，棄上清，300 μL PBS重懸，上機(jī)檢測，至少收集106個Events，F(xiàn)lowjo 10.8.0軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Flowjo 10.8.0（BD, USA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。通過Flow AI軟件包去除質(zhì)量較差的細(xì)胞；R-tsne軟件包進(jìn)行降維分析；數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為軟件導(dǎo)出；呈正態(tài)分布的連續(xù)變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。

2 結(jié)果

2.1 抗體滴定 根據(jù)SI值，該體系下CD4抗體加入的體積為0.25 μL，工作濃度為0.50 μg/mL時，SI值最大，陰性群和陽性群分離度最大；CD45、CD3、CD19、CD8、CD25、CD127、CD39、CD103、CCR8、CD38、CD69、CD27和CD56抗體加入體積均為1 μL，則工作濃度為2.00 μg/mL；CD45RA、CCR7、CD62L、HLA-DR、CD11c和PD-1抗體加入體積均為2 μL，工作濃度為4.00 μg/mL；L/D染料工作濃度為0.10 μg/mL。如圖1A所示，加入0.25 μL CD4抗體時為最適工作濃度。

圖1 CD4抗體最適質(zhì)量濃度的選擇（A）和最適電壓選擇（B）Fig 1 Optimal mass concentration (A) and optimal voltage (B) of CD4 antibody

2.2 檢測電壓優(yōu)化、補(bǔ)償調(diào)節(jié) 根據(jù)得到的各個通道的SI值，確立了CD45、CD3、CD19、CD4、CD8、CD39、CD103、CD25、CD127、CCR8、CD56、CD11c、HLA-DR、CD62L、CD45RA、CCR7、CD69、CD38、CD27、PD-1抗體和L/D染料檢測通道的電壓為430、510、410、530、550、530、540、550、550、520、450、420、550、300、400、380、460、390、530、480和450 V。圖1B為CD4抗體電壓滴定結(jié)果，其余抗體均按此方法進(jìn)行。補(bǔ)償調(diào)節(jié)可先通過自動補(bǔ)償進(jìn)行調(diào)節(jié)，后再用單染樣本調(diào)節(jié)并通過全染的樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 樣本檢測與分析 已確定的流式檢測方案對6名健康成年人外周血及6例人NSCLC組織進(jìn)行檢測，主要細(xì)胞亞群比例見表2。流式分析過程見圖2，圖2A為PBMCs設(shè)門步驟，圖2B為肺癌組織設(shè)門步驟。分別通過Time參數(shù)設(shè)門選擇信號穩(wěn)定的細(xì)胞群進(jìn)行分析；根據(jù)FSC-A/SSC-A設(shè)門以去除碎片和部分死細(xì)胞；FSC-A/FSCH設(shè)門，去除粘連細(xì)胞；L/D陰性為活細(xì)胞；CD45和L/D選擇CD45+L/D-細(xì)胞群進(jìn)行后續(xù)分析。圖3為PBMCs和肺癌組織主要亞群分析策略，圖3A為PBMCs分析策略，圖3B為肺癌組織分析策略，分別選取CD45+活細(xì)胞，進(jìn)行T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷（natural killer, NK）細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dentric cell,DC）以及B細(xì)胞亞群漿細(xì)胞（plasma cells）、組織駐留B細(xì)胞（resident memory B cells, Brm）、記憶B細(xì)胞（memory B cells）等細(xì)胞群的分析。圖4來源細(xì)胞為CD4+/CD8+T細(xì)胞的亞群進(jìn)一步分析，圖4A為PBMCs分析，圖4B為肺癌組織分析，包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells, Tregs）和CD4+中央記憶細(xì)胞（central memory cells, Tcm）CD8+腫瘤浸潤T細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes CD8, CD8 TILs）、PD-1分析及CD8+組織駐留細(xì)胞（tissue resident memory cells,Trm）的分析，以及CD4+初始T細(xì)胞（naive T cells, Tn）、效應(yīng)記憶型T細(xì)胞（effector memory T cells, Tem）、中央記憶型T細(xì)胞（central memory T cells, Tcm）的檢測。圖5為t-SNE分析，選擇L/D-和CD45+細(xì)胞群，分析結(jié)果。圖5A為肺癌組織中除L/D和CD45外的19個抗體在腫瘤組織上的表達(dá)情況，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和Treg細(xì)胞亞群的分布情況，為整合后的6個肺癌樣本?？梢奣細(xì)胞為CD3+，B細(xì)胞為CD19+，CD11c主要表現(xiàn)在非淋巴細(xì)胞；CD4和CD8高表達(dá)在T細(xì)胞；CD25、CD127和CD103主要在T細(xì)胞表達(dá)；CD38只在B細(xì)胞表達(dá)；CD27、CD39、HLA-DR、CD45RA、CCR7、CD62L和CD69在多個細(xì)胞群有表達(dá)。其中，CD25+CD127-則為Treg細(xì)胞；CD19+CD38+CD27+為漿細(xì)胞；CD11c+HLA-DR+為DC細(xì)胞；CD8+CD39+CD103+為CD8 TILs細(xì)胞；CD8+CD69+CD103+為Trm細(xì)胞。

圖2 PBMCs和肺癌組織設(shè)門步驟。A：PBMCs設(shè)門步驟；B：肺癌組織設(shè)門步驟。Fig 2 Gating steps for PBMCs and lung cancer tissues. A: PBMCs gating step; B: Lung cancer tissues gating step.

圖3 PBMCs和肺癌組織主要亞群分析策略。A：PBMCs分析策略；B：肺癌組織分析策略。圖3A、3B分別分析了PBMCs和肺癌組織的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK T細(xì)胞、DC、漿細(xì)胞等細(xì)胞亞群，結(jié)果顯示不同組織之間具有差異性。Fig 3 Analysis strategies for major subpopulation of PBMCs and lung cancer tissues. A: PBMCs analysis strategy; B: Lung cancer tissues analysis strategy. Fig 3A and 3B analyses the cell subpopulations of T cells, B cells, NK cells, NK T cells, DC and plasma cells in PBMCs and lung cancer tissues, respectively, with variability between different tissues.

圖4 PBMCs和肺癌組織中CD4+/CD8+ T細(xì)胞亞群功能、活化分析。A：PBMCs分析；B：肺癌組織分析。圖4A、4B分別分析了PBMCs和肺癌組織的功能和活化的細(xì)胞亞群，如Tregs、CD8+ TILs、CD8+ Trm、Tcm、Tn、Tem以及PD-1的表達(dá)等，結(jié)果不同組織之間具有差異性。Fig 4 Functional and activation analysis of CD4+/CD8+ T cell subsets in PBMCs and lung cancer tissues. A: PBMCs analysis; B: Lung cancer tissues analysis. Fig 4A and 4B analyses the function of PBMCs and lung cancer tissues, respectively, and the activated cell subpopulations, such as Tregs,CD8+ TILs, CD8+ Trm, Tcm, Tn, Tem and PD-1 expression, which were differentiated between the different tissues. Tcm: central memory cells; Tn:naive T cells; Tm: memory T cells; Tem: effector memory T cells; Te: effector T cells.

圖5 肺癌組織t-SNE分析。圖5A呈現(xiàn)了6例肺癌組織的整體分布，可將其分為多各細(xì)胞亞群，包括CD8+ T細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC等細(xì)胞亞群，圖5B展現(xiàn)了除CD45和L/D外的其余抗體標(biāo)記在整體的分布情況。Fig 5 Analysis of lung cancer tissues by t-SNE. Fig 5A presents the overall distribution of the lung cancer tissues of the six cases, which can be classified into multiple various cellular subpopulations, including CD8+ T cells, CD4+ T cells, NK cells, DC and other cellular subpopulations, and Fig 5B demonstrates the distribution of the rest of the antibody markers in the overall distribution of the antibody markers except CD45 and L/D.

表2 外周血PBMCs和NSCLC組織免疫細(xì)胞主要細(xì)胞亞群占比Tab 2 The percentage of major cell subsets of immune cells in PBMCs and NSCLC tissues

3 討論

多色流式細(xì)胞術(shù)具有便捷、準(zhǔn)確、易于標(biāo)準(zhǔn)化的特點(diǎn)，其因能高通量分析細(xì)胞水平而被臨床和科研廣泛應(yīng)用。多色流式細(xì)胞術(shù)可使用多個標(biāo)志物進(jìn)行單細(xì)胞研究，并通過多個分析參數(shù)解析細(xì)胞，最終獲得更準(zhǔn)確界定的細(xì)胞群和更豐富的生物學(xué)信息，且具有樣本使用量少、成本較低等優(yōu)勢[13,14]。例如，Keyel等[15]通過多色流式來鑒定混合群體（腫瘤、骨髓或血液）中的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，操作簡單、準(zhǔn)確、快速。宋洋子等[16]通過十色流式檢測外周血中T細(xì)胞亞群及活化狀態(tài)，方案簡單可靠，研究證實(shí)了多色流式的可行性，但并未加入外周血中其他亞群的分析。楊敏等[17]和Kathryn等[18]都曾設(shè)計(jì)了多色流式方案對腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等進(jìn)行更細(xì)致的分型，從而獲得影響腫瘤細(xì)胞進(jìn)展相關(guān)的研究手段，卻未納入細(xì)胞分化等指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)建立了一個21色流式方案，以檢測人NSCLC組織樣本的免疫細(xì)胞亞群。Treg細(xì)胞表達(dá)CD45、CD3、CD4、CD25、FoxP3、CCR8，低或不表達(dá)CD127，其中FoxP3為核轉(zhuǎn)錄因子，染色前需進(jìn)行細(xì)胞固定破膜，操作復(fù)雜且易損失細(xì)胞，CD127為表面標(biāo)記抗原，因此本方案選擇CD25+CD127-/low來定義Treg細(xì)胞[19]。有研究[20]表明CCR8是一種腫瘤浸潤Treg細(xì)胞，且高表達(dá)的CCR8與多種癌癥相關(guān)。在胸腺、脾臟和外周血的Treg細(xì)胞中表達(dá)量較低，本實(shí)驗(yàn)加入CCR8來驗(yàn)證外周血Treg是否浸潤。CD45RA、CCR7和CD62L為細(xì)胞分化的標(biāo)志，可表示細(xì)胞的分化情況。CD39和CD103作為細(xì)胞功能的標(biāo)志，有報(bào)道[21,22]稱，CD39+CD103+為腫瘤特異性及耗竭性T細(xì)胞并可識別實(shí)體瘤中的腫瘤反應(yīng)性CD8+T細(xì)胞，而針對PD-1的治療策略已被開發(fā)為包括NSCLC在內(nèi)的各種癌癥類型的腫瘤進(jìn)展的免疫療法[23]。

通過對抗體濃度和電壓的優(yōu)化以及多色方案的改進(jìn)，本研究建立了穩(wěn)定可靠的可于單管中分析人PBMCs和肺癌組織中主要細(xì)胞亞群占比的方法，PBMCs中各主要細(xì)胞亞群的比例的均值與文獻(xiàn)[24]報(bào)道接近。而肺癌組織中具有個體差異性，表2為本實(shí)驗(yàn)所用腫瘤樣本比例統(tǒng)計(jì)，且能清晰地看到T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及DC等主要細(xì)胞亞群的分布，同時充分展現(xiàn)了這些細(xì)胞亞群之間的關(guān)聯(lián)。實(shí)驗(yàn)操作簡單，耗時較短，一定程度上節(jié)約了時間和費(fèi)用。另外還可進(jìn)行方案的優(yōu)化或根據(jù)條件補(bǔ)充方案，例如將DC細(xì)胞亞群細(xì)分，如傳統(tǒng)DCs（conventional DCs,cDCs）、血漿DCs（plasmacytoid DCs, pDCs）、朗格漢斯細(xì)胞（Langerhans cells, LCs）等納入分析，以及其他腫瘤組織適用性驗(yàn)證。

綜上，本實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的檢測人NSCLC組織樣本免疫細(xì)胞亞群的21色流式方案，方案適用于PBMCs與肺癌組織樣本，可系統(tǒng)性地檢測PBMCs與肺癌組織中細(xì)胞亞群含量以及亞群的功能與活化情況，細(xì)胞分群清晰，且能清楚地展現(xiàn)PBMCs與肺癌樣本中細(xì)胞分群的差異性，為流式監(jiān)測疾病的進(jìn)展等提供了一種可靠的新方案。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Guo TT and Xie HG conceived and designed the study. GuoTT performed the experiments, analysed the data and wrote the article, and Xie HG was responsible for article revisions. Both the authors read and approved the final manuscript as submitted.