TRIP13通過同源重組通路提高肺腺癌細胞的放射抗性

葛舒童 谷潤川 楊雄濤 許長丹 王詩杰 朱廣迎

惡性腫瘤是危害公共健康、造成機體傷亡的主要因素之一。據(jù)2020年全球癌癥數(shù)據(jù)[1]顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率分別位于第二位和第一位，占每年總死亡人數(shù)的18%。在肺癌所有病理分型中，肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）最為常見，約占肺癌總確診病例的50%[2]。手術(shù)、放療、化療以及免疫治療等是目前臨床治療肺癌的常用策略。近些年來，隨著立體定向放療（stereotactic body radiotherapy, SBRT）等放療技術(shù)的出現(xiàn)，極大程度提升了放療的精準度并進一步擴大了放療在臨床上的應(yīng)用[3]。目前，放療在肺癌早期已達到了能和手術(shù)相媲美的治療效果，為早期不可手術(shù)的肺癌患者帶來了福音；同時，放療也是肺癌各個階段治愈性或姑息性治療的重要策略之一[4-6]。然而，目前臨床上僅有一部分患者對放療敏感，并且許多患者在治療期間也出現(xiàn)了對放療耐受、治療后短時間內(nèi)復(fù)發(fā)等問題，降低了放療的療效[7]。因此，進一步地探索肺癌放療抵抗發(fā)生發(fā)展的潛在機制有助于改善肺癌放療的治療效果。

放射抗性的出現(xiàn)，是腫瘤細胞中多種因素和生理病理機制共同作用的結(jié)果。其中，腫瘤細胞在接受放射線刺激后，較強的DNA損傷修復(fù)能力是腫瘤放射抗性發(fā)生的重要機制之一[8]。真核生物的DNA損傷修復(fù)通路多種多樣，非同源末端鏈接（nonhomologous end-joining, NHEJ）和同源重組（homologous recombination, HR）是DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break, DSB）后最為重要的兩種修復(fù)方式[9-12]。腫瘤細胞內(nèi)任意一種修復(fù)能力的增強均能減弱腫瘤對放射線的敏感性，尋找與腫瘤放療抵抗相關(guān)的因素并施加干預(yù)，則有望解決臨床放射線耐受的難題。本研究首先通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)了TRIP13與LUAD的放射抗性之間可能存在密切關(guān)系，且查閱目前已發(fā)表的文獻[13,14]提示TRIP13與多種癌種的放射抗性以及DNA損傷后修復(fù)存在相關(guān)性。但TRIP13與LUAD的放射抗性之間的相關(guān)性尚不明確，目前未見報道。因此本研究旨在通過亞致死劑量照射法構(gòu)建具有放射抗性的人LUAD H292DR細胞系，并依托此細胞系探究TRIP13與LUAD放射抵抗之間的相關(guān)性，以期為臨床LUAD放療耐受提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及數(shù)據(jù)分析 使用R 4.1.3軟件從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus, GEO）下載4個非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的基因表達譜：GSE18842、GSE19188、GSE33532和GSE68465，共計809例樣本，其中NSCLC樣本660例，正常組織樣本149例。將GSE18842、GSE19188、GSE335323個數(shù)據(jù)集用于差異基因的篩選與分析，僅包含LUAD病理亞型和正常組織樣本信息的GSE68465數(shù)據(jù)集用于輔助驗證。使用R 4.1.2軟件進行基因名稱轉(zhuǎn)換后，利用Limma包篩選前3個數(shù)據(jù)集的差異表達基因，篩選標準為|log FC|＞1.5，P＜0.05。而后，使用Venn diagram在線工具（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）獲取3個數(shù)據(jù)集共同差異表達的基因。使用STRING在線網(wǎng)站（version-12-0.string-db.org/）分析基因之間的潛在關(guān)系，繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。隨后，通過使用Cytoscape軟件中的MCONE聚類算法功能獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中更為核心的模塊。使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（kmplot.com/analysis/）分析核心模塊中所涉及的相關(guān)基因與肺癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系。使用R 4.1.3軟件的Survival包在GSE68465數(shù)據(jù)集中驗證此前的分析結(jié)果，并使用enrichplot包進行基因富集分析。

1.2 細胞培養(yǎng)和相關(guān)試劑 人LUAD細胞系H292購于國家實驗細胞資源共享平臺——北京協(xié)和細胞資源中心。H292細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中。RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號：SH30809.01）和胎牛血清（貨號：SH30406.05）購于美國HyClone公司；青鏈霉素混合液（貨號：15140122）和胰酶（貨號：25200056）購于美國Gibco公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000（貨號：L3000015）購于美國Thermo Fisher公司；Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基（貨號：31985-070）購于美國Invitrogen公司。細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8, CCK-8）（貨號：BS350B）購于Biosharp公司；Transwell小室（貨號：353097）購于美國BD公司（Becton, Dickinson and Company）。GAPDH（貨號：sc-47724，1:1000）、TRIP13（貨號：sc-514285，1:1000）、p-ATM（貨號：sc-47739，1:1000）、ATM（貨號：sc-377293，1:1000）和REV7（貨號：sc-135977，1:1000）抗體購于Santa cruz公司；RAD51（貨號：A00088，1:1000）購于武漢Boster生物公司，HRP標記的山羊抗鼠（貨號：ab6789，1:10,000）、兔IgG二抗（貨號:ab6721，1:10,000）購于美國Abcam公司。

1.3 人LUAD H292細胞系放射抗性表型構(gòu)建方法 取生長狀態(tài)良好的H292細胞，使用160 kV X線生物輻照儀（RAD SOURCE 2000pro）分別對細胞給予0、2、4、6、8和10 Gy不同的放射線劑量照射。將照射后的細胞重新放于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此后每隔2-3 d進行傳代培養(yǎng)并確定H292細胞的亞致死性劑量為6 Gy。每照射一次細胞后需待細胞逐漸恢復(fù)至正常的生長速度后再給予下一次放射線照射，亞致死性照射劑量重復(fù)照射6次以上，大約3個月完成照射后停止照射并穩(wěn)定傳代5代以上即視為具有放射抗性表型，并將其稱之為H292DR細胞系。

1.4 CCK-8細胞增殖實驗驗證放射抗性表型 取對數(shù)生長期的H292細胞和H292DR細胞，以每孔2000個/100 μL的細胞密度接種于96孔板中，測量0 h時間點的450 nm波長處的吸光度值并記錄。翌日，待細胞貼壁24 h后，對孔板給予單次6 Gy的X射線照射。此后，依次測量24、48、72和96 h時間點的450 nm波長處吸光度值，繪制折線圖并進行計算。1.5 克隆形成實驗驗證放射抗性表型 取對數(shù)生長期的H292細胞和H292DR細胞，按計劃照射的0、2、4、6、8 Gy放射線劑量分別鋪300、600、900、1200和1500個細胞于12孔板中，每個劑量每組設(shè)置3個復(fù)孔。翌日，不同組分別接受不同劑量的放射線照射。此后，放回培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)8-10 d直至形成肉眼可見的克隆。結(jié)晶紫室溫染色15 min后洗凈并拍照計數(shù)。

1.6 Western blot檢測蛋白表達 取對數(shù)生長期的H292細胞和H292DR細胞，使用RIPA裂解液提總蛋白并進行BCA蛋白濃度定量，加入5×Loading buffer煮沸使蛋白變性，而后采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以分離目標蛋白，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，一抗4oC孵育過夜，翌日TBST洗3次后室溫孵育二抗1 h，而后曝光顯影。

1.7 小干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）轉(zhuǎn)染細胞 轉(zhuǎn)染前一天，將H292DR細胞按2×105個/mL鋪于12孔板中，次日細胞密度約為70%。將細胞分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染siRNA-negative control，即NC）、si1組（轉(zhuǎn)染靶向TRIP13的第1條siRNA）和si2（轉(zhuǎn)染靶向TRIP13的第2條siRNA）3組。按照Lipofectamine 3000說明書將siRNA轉(zhuǎn)染至H292DR細胞中。轉(zhuǎn)染6-8 h后更換成完全培養(yǎng)基。此后收取24、48、72 h時間點的細胞，進行Western blot驗證轉(zhuǎn)染效果。靶向TRIP13的siRNA及對照siRNA的序列由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司合成。TRIP13的2條有效干擾靶點序列（5’-3’）分別為AGCTACTCAACAGACATAATATT和CTCGATTATGTGATGACAACTTT。

1.8 Transwell細胞遷移實驗 取24孔板，孔板內(nèi)加入完全培養(yǎng)基，將Transwell小室輕柔放入。取siRNA處理后的H292DR細胞，使用無血清培養(yǎng)基清洗3次并重懸后種至小室中。隨后將放有Transwell小室的孔板置于孵箱中。48 h后，取出小室，使用結(jié)晶紫染液進行室溫染色20 min，清洗晾干后置于顯微鏡下拍照計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8.0進行本研究的數(shù)據(jù)分析及繪圖。采用Kaplan-Meier方法分析TRIP13與患者的總生存期（overall survival, OS）的關(guān)系，采用Spearman相關(guān)分析檢測TRIP13基因與其他基因之間的相關(guān)性。單因素和多因素Cox回歸分析評估多個因素對LUAD患者OS的影響。兩組間計量資料的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選3個GEO數(shù)據(jù)集以獲得共同差異表達基因 本次使用的所有GEO數(shù)據(jù)集的信息如表1所顯示。使用Limma包分析GSE18842、GSE19188、GSE335323個數(shù)據(jù)集分別得到418、203和371個表達上調(diào)的基因，以及775、564和689個表達下調(diào)的基因。使用Venn diagram繪制Venn圖后獲得了521個共同差異表達的基因，其中有164個共同表達上調(diào)的基因，357個共同表達下調(diào)的基因（圖1）。

圖1 3個數(shù)據(jù)集共同表達上調(diào)的164個基因和共同表達下調(diào)的357個基因。A：3個數(shù)據(jù)集共同表達的上調(diào)基因的數(shù)量；B：3個數(shù)據(jù)集共同表達的下調(diào)基因的數(shù)量。Fig 1 164 genes co-expressed up-regulated and 357 genes coexpressed down-regulated in the three datasets. A: The amount of upregulated genes co-expressed in the three datasets; B: The amount of down-regulated genes co-expressed in the three datasets.

表1 本研究所用的GEO數(shù)據(jù)集信息Tab 1 Information on the GEO dataset used in this study

2.2 差異基因的初步生存分析發(fā)現(xiàn)TRIP13與LUAD患者的不良預(yù)后有關(guān) 將上述獲得的521個差異表達的基因上傳至STRING在線網(wǎng)站，繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，聯(lián)合使用Cytoscape軟件，進一步可視化基因間的相關(guān)性，并使用MCONE功能進一步獲得了一個包含85個基因的核心模塊（圖2），這85個基本全部為表達上調(diào)的差異基因。隨后，使用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站對該85個基因進行生存分析，對某一基因進行數(shù)據(jù)分析過程中，均以該基因表達量的中位值為界，將患者分為高表達組和低表達組。結(jié)果顯示，該85個基因中84個基因均與NSCLC患者的OS有關(guān)，其中75個基因與LUAD患者的OS有關(guān)（表2）。在該條件下進一步將條件限制在接受放療的肺癌患者人群中，發(fā)現(xiàn)TRIP13的表達仍與接受放療的肺癌患者的生存預(yù)后有關(guān)（圖3A）。

圖2 Cytospace分析后所得的85個核心基因Fig 2 85 core genes from Cytospace analysis

圖3 TRIP13的表達和肺癌患者生存預(yù)后之間的關(guān)系。A：Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫顯示的TRIP13的表達與接受放療的肺癌患者（n=65）的生存預(yù)后有關(guān)；B、C：Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（n=524）和GSE37745數(shù)據(jù)集（n=66）雙重證明TRIP13與LUSC患者的生存預(yù)后無明顯的關(guān)聯(lián)。Fig 3 Relationship between TRIP13 expression and survival prognosis of lung cancer patients. A: Significant correlation between TRIP13 expression and survival prognosis of lung cancer patients (n=65) treated with radiotherapy as shown in the Kaplan-Meier Plotter database; B,C: Dual demonstration of no significant correlation between TRIP13 and survival prognosis of patients with LUSC as shown in the Kaplan-Meier Plotter database (n=524) and the GSE37745 dataset (n=66). HR: hazard ratio; LUSC: lung squamous cell carcinoma.

表2 Kaplan-Meier Plotter分析84個基因與與LUAD生存預(yù)后之間的關(guān)系Tab 2 Correlation between 84 genes and survival prognosis in LUAD analyzed by Kaplan-Meier Plotter

而據(jù)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析顯示，TRIP13表達量與肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）患者的生存預(yù)后無關(guān)（P=0.820，圖3B）；使用含有66例LUSC的GSE37745數(shù)據(jù)集再次進行驗證，結(jié)果同樣顯示TRIP13的表達量與LUSC患者的生存預(yù)后無關(guān)（P=0.610，圖3C）。這種在肺癌不同病理亞型中的差異可能是因為腫瘤異質(zhì)性所導(dǎo)致的，故此后將研究重點放在了TRIP13與LUAD之間的關(guān)系上。

為驗證TRIP13表達量與LUAD以及接受放療的LUAD患者生存預(yù)后之間的關(guān)系，又選擇在含有443例LUAD樣本和19例正常組織樣本表達數(shù)據(jù)的GSE68465數(shù)據(jù)集進行了生存分析。此外，由于R軟件在進行生存分析過程中自動將TRIP13表達量的中位值舍棄，并將剩余數(shù)據(jù)分為TRIP13表達量高和表達量低的兩組，故圖中顯示的總病例數(shù)比實際病例數(shù)少1例（圖4）。結(jié)果顯示，TRIP13表達水平與LUAD患者的OS率有關(guān)（P＜0.001），TRIP13表達量越高的患者，OS率越低。為進一步觀察TRIP13基因的表達是否與接受過放療的LUAD患者的生存預(yù)后相關(guān)，篩選了該數(shù)據(jù)集中65例接受過放療的LUAD患者，對這一部分人群再次進行生存分析，發(fā)現(xiàn)TRIP13的基因表達量與這65例患者的OS率有關(guān)（P=0.037）。這些結(jié)果表明，TRIP13或許可作為LUAD患者（包含既往接受過放療）預(yù)后的分子標志物。

圖4 GSE68465數(shù)據(jù)集驗證TRIP13與LUAD（n=442）（A）以及其中接受放療的LUAD患者（n=64）（B）的生存預(yù)后之間的關(guān)系。因R軟件在進行生存分析過程中，自動將TRIP13表達量的中位值舍棄，再將剩余數(shù)據(jù)分為TRIP13表達量高和表達量低的兩組，故圖中顯示的總病例數(shù)比實際病例數(shù)少1例。Fig 4 GSE68465 dataset validation of the association between TRIP13 and survival prognosis in LUAD (n=442) (A) and in those of LUAD patients treated with radiotherapy (n=64) (B). Because the R software automatically discarded the median value of TRIP13 expression during survival analysis, and then the remaining data were divided into two groups with high and low TRIP13 expression, the total number of cases shown in the figure is one less than the actual number of cases.

2.3 TRIP13可能參與DSB后的重組修復(fù) 為進一步觀察TRIP13基因可能參與的信號通路，在僅含有正常肺組織和LUAD組織的mRNA數(shù)據(jù)的GSE68465數(shù)據(jù)集中，通過使用R軟件的enrichplot包對TRIP13基因進行了基因富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRIP13基因與細胞周期檢查點信號通路、DNA復(fù)制以及DSB的HR修復(fù)有密切關(guān)系（圖5）。其中，HR修復(fù)是放射線作用于癌細胞并引起癌細胞發(fā)生DSB事件后最主要的修復(fù)方式之一，也與腫瘤的放射抵抗有密切關(guān)系。由此可見，TRIP13可能與LUAD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且很大程度上可能與LUAD的放療抗性有關(guān)，或可成為臨床上LUAD治療的潛在靶點和預(yù)后標志物。

圖5 使用GSE68465數(shù)據(jù)集對TRIP13進行單基因的GSEA分析Fig 5 GSEA analysis of TRIP13 as a single gene using the GSE68465 dataset

根據(jù)以上分析提示的TR IP13與DNA損傷修復(fù)之間可能存在的聯(lián)系，通過T I M ER在線數(shù)據(jù)庫分析了TRIP13基因與HR信號通路的多個基因之間的相關(guān)性，結(jié)果（Spearman相關(guān)分析）發(fā)現(xiàn)，在LUAD中TRIP13與HR通路的多個基因之間存在明顯的正相關(guān)，例如重組酶RAD51（RAD51 recombinase,RAD51）基因（r=0.780,P＜0.001）、乳腺癌1號（breast cancer 1,BRCA1）基因（r=0.782,P＜0.001）、核酸外切酶I（exonuclease 1,EXO1）基因（r=0.803,P＜0.001）以及乳腺癌2號（breast cancer 2,BRCA2）基因（r=0.591,P＜0.001）等，提示在LUAD中，TRIP13可能會促進放療后的HR，與腫瘤的放療抵抗、患者的不良預(yù)后有關(guān)。

2.4 TRIP13表達量與接受放療的LUAD患者臨床預(yù)后有關(guān)Kaplan-Meier生存分析的結(jié)果顯示，TRIP13高表達組的患者預(yù)后較差，提示TRIP13可作為LUAD患者臨床預(yù)后的潛在指標。GSE68465數(shù)據(jù)集中包含65例既往接受過輔助放療的NSCLC患者的臨床數(shù)據(jù)，對這些臨床數(shù)據(jù)進行單因素和多因素Cox回歸分析（表3），以更好地了解TRIP13與既往接受過放療的LUAD患者的生存預(yù)后之間的關(guān)系，結(jié)果表明TRIP13表達量、腫瘤原發(fā)灶-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumornode-metastasis, TNM）分期、是否接受過輔助化療和腫瘤組織分化程度對LUAD患者的OS有影響（P＜0.05），其中TRIP13高表達、較晚的TNM分期（III期）和較差的腫瘤組織分化程度是影響患者預(yù)后的危險因素［風險比（hazard ratio, HR）＞1，P＜0.05］，患者的OS較短；而接受過輔助化療顯示是患者的保護性因素（HR=0.510, 95%CI:0.280-0.932），患者的OS較長。然而，將單因素分析顯示的與患者預(yù)后有關(guān)的因素納入多因素Cox分析，僅TNM分期對患者的預(yù)后有影響（HR=2.112,P=0.014）；TRIP13的表達量雖不再對患者的OS有影響（P=0.068），但仍在一定程度上是LUAD患者的危險因素，TRIP13高表達患者的死亡風險是低表達患者的1.714倍。

表3 GSE68465數(shù)據(jù)集中65例接受過放療的LUAD患者預(yù)后因素的單因素和多因素Cox回歸分析Tab 3 Univariate and multivariate Cox regression analyses of prognostic factors in 65 patients with LUAD who had received radiotherapy in the GSE68465 dataset

2.5 構(gòu)建具有放射抗性的人LUAD細胞系 為確定TRIP13分子與LUAD放療抵抗之間的相關(guān)性，首先構(gòu)建了具有放射抗性表型的人LUAD細胞系H292DR。此后為了驗證放射抗性表型的成功構(gòu)建，對H292DR細胞和H292細胞進行了CCK-8細胞增殖實驗和克隆形成實驗驗證。相較于H292細胞而言，H292DR細胞形成的克隆更大更多；由于高劑量組在開始時所接種的細胞多，雖6和8 Gy等高劑量組相較于低劑量組而言形成的克隆數(shù)較多，但存活分數(shù)隨著放射劑量的升高而逐漸降低；并且隨著X射線劑量的增加，相較于H292細胞而言，H292DR的克隆形成率更高，兩組具有統(tǒng)計學差異（圖6A、6B）。CCK-8實驗結(jié)果同樣表明，H292DR在不同劑量的X射線照射下具有更強的細胞增殖能力（圖6C），表明放射抗性細胞系構(gòu)建成功。顯微鏡明場下觀察，H292DR細胞在形態(tài)上也發(fā)生了些許改變，體積稍變大（圖6D）。隨后，為了觀察在具有放射抗性的細胞中TRIP13蛋白的表達情況，Western blot檢測H292細胞和H292DR細胞中TRIP13的蛋白含量，發(fā)現(xiàn)H292-IR細胞中TRIP13蛋白水平相較于H292細胞而言有輕微升高的趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異（圖6E）。

圖6 構(gòu)建放射抗性的LUAD細胞系并加以驗證，檢測TRIP13蛋白的表達情況。A、B：克隆形成實驗驗證H292DR的放射抗性表型，并繪制存活曲線；C：CCK-8細胞增殖實驗驗證H292DR的放射抗性表型；D: 顯微鏡明場視野下觀察H292和H292DR細胞（×40）；E：Western blot檢測H292和H292DR細胞中TRIP13蛋白的表達情況。**P＜0.01, ****P＜0.0001。Fig 6 Construction and validation of radioresistant LUAD cell lines and detection of TRIP13 protein expression. A, B: Clone formation assay was used to verify the radioresistant phenotype of H292DR, and survival curves were plotted; C: CCK-8 cell proliferation assay was performed to verify the radioresistant phenotype of H292DR; D: Observation of H292 and H292DR cells under bright-field of view of microscope (×40); E: Western blot was used to detect the TRIP13 protein expression in H292 and H292DR cells. OD: optical density; IR: radiation resistance; CCK-8: cell counting Kit-8. **P＜0.01, ****P＜0.0001.

2.6 沉默TRIP13后能夠減弱H292DR細胞的克隆形成和遷移能力 為了觀察TRIP13在放射抵抗的LUAD細胞中的作用，使用2條siRNA沉默H292DR細胞中的TRIP13。Western blot檢測siRNA作用24、48和72 h后TRIP13的表達情況，發(fā)現(xiàn)在3個時間點，相較于NC組而言，2條siRNA均能明顯降低H292DR細胞中TRIP13蛋白水平的表達（圖7A）。隨后，再次重復(fù)對TRIP13分子的敲減，并收取siRNA作用24 h后的H292DR細胞進行克隆形成實驗和Transwell細胞遷移實驗。

圖7 沉默TRIP13的表達后對LUAD細胞的克隆形成和遷移能力的影響。A：Western blot檢測siRNA沉默TRIP13蛋白表達的效率，圖中展示的是siRNA作用24 h后收取蛋白進行的檢測；B、C：siRNA處理后的H292DR細胞進行克隆形成實驗，上面一行不給予放射線處理，下面一行給予單次6 Gy放射線處理，并對克隆形成結(jié)果進行統(tǒng)計學分析；D：siRNA處理H292DR細胞后進行Transwell細胞遷移實驗，并對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。*P＜0.05, **P＜0.01，***P＜0.001。Fig 7 Effect on clone formation and migration ability of LUAD cells after silencing TRIP13 expression. A: Western blot was used to detect the efficiency of siRNA silencing of TRIP13 protein expression, and the figure showed the assay performed by charging the protein after 24 h of siRNA action; B,C: Clone formation experiments were performed on siRNA-treated H292DR cells, with no radioactivity given in the upper row and a single 6 Gy radioactivity given in the lower row, and the results of the clone formation were statistically analysed; D: After siRNA treatment of H292DR cells,Transwell cell migration assay was performed and the results were statistically analysed. NC: negative control. *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

克隆形成實驗分成兩組，一組不接受放射線處理，每孔鋪300個細胞至12孔板中；另一組，每孔鋪500個細胞至12孔板中，次日在細胞貼壁24 h后給予單次6 Gy的放射線處理。此后，兩組繼續(xù)培養(yǎng)直至形成肉眼可見的克隆。實驗結(jié)果表明，沉默TRIP13后，不論是否有放射線的干預(yù)，均能降低放射抗性H292DR細胞的克隆形成能力，對照組和siRNA敲減組之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖7B、7C）。細胞遷移實驗結(jié)果顯示，沉默H292DR細胞中TRIP13表達后，能夠明顯削弱H292DR細胞的遷移能力（P＜0.05，圖7D），這一結(jié)果與平板克隆的實驗結(jié)果相吻合。以上結(jié)果表明，沉默TRIP13不僅可以增加具有放射抗性的H292DR細胞對放射線的敏感性，還可抑制其遷移能力。

2.7 沉默TRIP13后削弱放射抗性LUAD細胞的HR修復(fù)能力 由于此前對TRIP13在LUAD中的單基因富集分析的結(jié)果提示，TRIP13很有可能與HR修復(fù)有密切關(guān)系。為進一步地觀察沉默TRIP13后具有放射抗性表型的LUAD細胞的DNA損傷修復(fù)能力是否會受到影響。于是，在使用siRNA成功敲低TRIP13后，同步檢測ATM、p-ATM、RAD51以及REV7這4個HR修復(fù)通路關(guān)鍵分子的蛋白表達變化，結(jié)果（圖8）顯示，沉默TRIP13的表達后總ATM的表達沒有明顯變化，而p-ATM（S1981）的磷酸化水平、RAD51和REV7的表達水平均出現(xiàn)了明顯的降低。該結(jié)果提示，TRIP13可能與HR修復(fù)密切相關(guān)，沉默TRIP13后或可通過削弱LUAD細胞的DNA修復(fù)能力來增加放射抗性細胞對放射線的敏感性。

圖8 沉默TRIP13的表達對H292DR細胞中與同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白表達的影響Fig 8 Effect of silencing TRIP13 expression on the expression of proteins associated with homologous recombinant repair in H292DR cells

3 討論

腫瘤細胞是一個異質(zhì)性很強的群體，部分腫瘤細胞對放射線不敏感，在反復(fù)放射線照射的刺激下獲得生存優(yōu)勢，放射抗性的相關(guān)基因組突變得以積累，是導(dǎo)致臨床上惡性腫瘤患者放療療效不佳、生存預(yù)后差的一個重要原因。近年來，國內(nèi)外也已有大量的基礎(chǔ)研究[15,16]圍繞著惡性腫瘤的放療抵抗問題開展。在本研究中，我們首先通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中與肺癌有關(guān)的數(shù)據(jù)，經(jīng)篩選以及外部數(shù)據(jù)集驗證，發(fā)現(xiàn)TRIP13基因在NSCLC中表達上調(diào)，并與患者的不良預(yù)后有關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，TRIP13基因與NSCLC中的LUAD亞型關(guān)系更為密切；并且在接受過放療的LUAD人群中，TRIP13基因的高表達患者的總生存率亦有顯著的降低（P＜0.05）。對TRIP13進行GSEA分析發(fā)現(xiàn)，TRIP13可能參與DSB后的HR修復(fù)，提示這可能是接受放療后TRIP13高表達的LUAD人群預(yù)后不良的原因。

TRIP13是ATP酶中AAA(+) ATP酶家族成員之一，參與減數(shù)分裂和有絲分裂，在細胞分裂過程中發(fā)揮了重要作用[17,18]。在減數(shù)分裂的G2前期，大量DSB的積累引發(fā)了染色體重組檢查點的激活，TRIP13參與調(diào)控同源染色體重組并促進了DSB修復(fù)，以保證細胞分裂的順利進行；而在有絲分裂期間，TRIP13則主要參與了檢查點信號通路、DSB修復(fù)等，此外，TRIP13還通過改變有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（closed-mitotic arrest deficient protein 2, C-MAD2）構(gòu)象，釋放細胞分裂周期蛋白20（cell division cycle 20,CDC20），以激活有絲分裂后期促進復(fù)合物/細胞周期體（anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C）來推動細胞分裂進入后期[17,19]。然而，近些年來，越來越多的研究[20-22]發(fā)現(xiàn)TRIP13也參與到癌癥發(fā)生發(fā)展中。TRIP13的表達量與惡性腫瘤患者的不良預(yù)后以及與放療、化療敏感性之間的關(guān)系也已在文獻[13]中得到了初步的報道與證實。多項研究[13,14,20-22]表明TRIP13在不同的癌癥類型（如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、骨髓瘤、頭頸癌等）中存在過表達或異常擴增，提示它可能具有致癌特性。例如，Kang等[23]通過在36例NSCLC患者的樣本中進行高分辨率微陣列比較基因組雜交技術(shù)，以期發(fā)現(xiàn)早期NSCLC遺傳學事件，結(jié)果顯示50%的NSCLC患者存在TRIP13拷貝數(shù)異常，而此比例在I期NSCLC患者中則更高（68%）。Clairmont等[14]的研究表明，TRIP13通過催化前NEHJ因子——REV7發(fā)生失活構(gòu)象改變，可抑制NHEJ并促進HR的發(fā)生；并發(fā)現(xiàn)TRIP13的高表達促進了HR、介導(dǎo)了聚（腺苷二磷酸）-核糖聚合酶［poly ADP (adenosine diphosphate)-ribose polymerase,PARP］抑制劑的耐藥性，與BRCA1缺陷型乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。Banerjee等[13]的研究則是發(fā)現(xiàn)TRIP13在頭頸癌中過表達，促進癌癥的發(fā)生發(fā)展，并通過促進NHEJ來介導(dǎo)癌細胞對順鉑以及放射線的耐受性，造成癌細胞對放化療的抗性。而Wang的研究團隊[24]則通過晶體結(jié)構(gòu)鑒定，預(yù)測并驗證了靶向TRIP13分子抑制劑——DCZ0415的存在，該抑制劑通過抑制NEHJ過程和核因子κB（nuclear factor kappa-B, NF-κB）活性，發(fā)揮了良好的抗骨髓瘤治療活性。

目前已發(fā)表的研究[20,25]結(jié)果，也與我們通過生存分析所顯示的TRIP13的高表達與LUAD患者的不良預(yù)后有關(guān)相吻合，額外的生存分析以及針對TRIP13的單基因富集分析結(jié)果提示TRIP13的異常擴增可能通過促進放療后的DNA損傷修復(fù)，導(dǎo)致接受放療的LUAD患者預(yù)后不良。但目前TRIP13與LUAD的放療抗性之間的關(guān)系尚無報道。

為了明確TRIP13分子和LUAD放療抗性之間的關(guān)系，我們首先通過亞致死劑量照射法構(gòu)建了具有放射抗性的人LUAD細胞系，并將其稱之為H292DR。通過檢測H292細胞和H292DR細胞中TRIP13蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)TRIP13蛋白的表達水平在H292DR有輕微的升高趨勢。隨后，通過設(shè)計siRNA靶向敲低H292DR細胞中TRIP13的表達，觀察到，敲減TRIP13的表達后能顯著降低H292DR細胞的克隆形成能力和遷移能力（P＜0.05）。由于前期數(shù)據(jù)分析結(jié)果提示TRIP13可能參與促進DSB后的HR修復(fù)，而ATM、REV7、BRCA2和RAD51等是參與DSB后HR修復(fù)的重要分子。其中，ATM存在多個自磷酸化位點，如絲氨酸367位點（ser-367）、絲氨酸1893位點（ser-1893）、絲氨酸1981位點（ser-1981）、絲氨酸2996位點（ser-2996）和蘇氨酸1885（thr-1885）位點，前4個位點在DSB作用下均會發(fā)生自磷酸化，而ser-1981位點的磷酸化是最為特異的，常被用作ATM激活的標志，反映DSB后HR修復(fù)信號通路的激活[10,26]。我們將H292DR細胞中的TRIP13分子敲低后，檢測了與HR密切相關(guān)的分子的蛋白表達水平，觀察到TRIP13敲減后細胞中的總ATM 水平?jīng)]有發(fā)生變化，而p-ATM（ser-1981）、RAD51和REV7的表達水平均發(fā)生了降低，表明TRIP13的敲減可能使得具有放射抗性的人LUAD細胞的HR修復(fù)能力降低，進而提升LUAD細胞對放射線的敏感性。但本研究所進行的驗證較少，僅圍繞著敲減TRIP13后H292DR細胞的增殖能力和遷移能力減弱以及HR信號通路相關(guān)蛋白表達降低進行論述，而免疫熒光觀察γH2AX和中性彗星實驗等驗證細胞DSB后修復(fù)能力的實驗暫未進行。其中，γH2AX是細胞發(fā)生DSB后快速響應(yīng)的蛋白之一，表現(xiàn)為在胞核內(nèi)的聚集，免疫熒光觀察γH2AX數(shù)量的多少可用于衡量DNA發(fā)生雙鏈斷裂的程度[27]，而中性彗星實驗通過衡量彗星尾矩的長短亦可反映細胞的DSB程度。此外，本研究的數(shù)據(jù)來源僅局限于GEO公共數(shù)據(jù)庫，未結(jié)合臨床病例及臨床組織樣本進行分析，未實現(xiàn)由基礎(chǔ)實驗到臨床的銜接，此部分有待進一步完善。本研究后續(xù)將繼續(xù)增加實驗驗證以明確TRIP13和LUAD放療抵抗之間的相關(guān)性。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)了T R I P13 在具有放射抗性的人LUAD細胞中發(fā)揮重要作用，可能通過影響DSB后的HR修復(fù)進而導(dǎo)致LUAD細胞對放射線的不敏感，并與臨床上LUAD患者的不良預(yù)后有關(guān)聯(lián)。因此，對于接受放療的LUAD患者而言，TRIP13表達水平較高可能與患者放療療效不佳、預(yù)后不良有關(guān)聯(lián)。TRIP13或可作為臨床上判斷LUAD患者，尤其是接受放療患者的預(yù)后的一個潛在生物標志物。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

Author contributions

Ge ST and Zhu GY conceived and designed the study. Ge ST performed the experiments. Ge ST and Gu RC analyzed the data. Ge ST, Gu RC, Yang XT, Xu CD and Wang SJ provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study. All the authors had access to the data. All authors read and approved the final manuscript as submitted.