灰霉病早期脅迫下花椰菜多酚氧化酶活性的高光譜研究

王 凱, 薛建新, 李堯迪, 張明月

山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)工程學院, 山西 晉中 030801

引 言

花椰菜(Brassicaoleraceavar. botrytis)又名菜花、 花菜、 椰菜花, 屬于十字花科蕓薹屬, 是一種具有獨特風味的兩年生蔬菜作物, 主要種植在我國沿海及高海拔地區(qū)[1-3]。 花椰菜包含硫代葡萄糖苷、 維生素和類胡蘿卜素等高水平抗氧化物, 具有很高的營養(yǎng)價值, 對于慢性疾病的預防有不錯的效果, 因此深受消費者的喜愛[4-5]。 然而花椰菜在生長過程中容易受到病害的侵襲, 灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers)感染后產(chǎn)生的灰霉病, 屬于花椰菜常見病害之一, 其會造成花椰菜產(chǎn)量的下降, 嚴重影響經(jīng)濟效益。

植物在自然界中會受到許多非生物和生物脅迫, 在這些壓力下進化出了復雜的防御系統(tǒng)來保護自己[6]。 當植物受到病害侵襲時, 自身的形態(tài)及生理指標會有一系列的改變, 病害會誘導植物產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS), 這些活性氧會調(diào)控植物自身的防御系統(tǒng), 對抵抗病菌的入侵具有重要的意義, 而過多的活性氧則會危害自身[7]。 多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)是一種存在于植物體內(nèi)的銅結(jié)合酶, 在植物受到侵襲時起到防止氧化損傷的作用, 因此可以用來評估植物對于環(huán)境的抗性[8]。 在分子氧的參與下, PPO會將花椰菜體內(nèi)的單酚羥基化為o-雙酚, 然后將o-雙酚氧化為o-醌, 醌繼續(xù)氧化形成黑色物質(zhì)使得組織產(chǎn)生褐變, 產(chǎn)生褐變的花椰菜會降低其本身的營養(yǎng)價值[9]。 目前測定花椰菜PPO活性方法包括毛細管電泳、 分光光度法、 化學發(fā)光法和色譜法, 這些方法能夠比較準確測量PPO活性, 但其過程繁瑣且會對樣本造成破壞[10]。 亟需尋找一種快速無損的檢測方法, 能夠?qū)崿F(xiàn)花椰菜灰霉病早期脅迫下的PPO活性檢測, 從而對花椰菜灰霉病進行早期診斷。

高光譜是一種快速無損的檢測方法, 已有學者將其成功的應用在植物酶活性檢測上。 Boshkovski等[11]利用高光譜對三種不同品種橄欖在干旱干擾下的抗氧化酶活性進行預測, 使用主成分回歸和偏最小二乘回歸, 確定高光譜光譜信息和抗氧化酶活性的相關(guān)性。 Shrestha等[12]采用7倍交叉驗證法建立偏最小二乘回歸模型對鮮切蘋果片的多酚氧化酶活性進行預測, 利用正交回歸對多酚氧化酶活性測量值與預測值分析, 其相關(guān)系數(shù)為0.800, 結(jié)果表明高光譜檢測技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)鮮切蘋果片多酚氧化酶活性的檢測。 程帆等[13]利用高光譜檢測技術(shù)對角斑病脅迫下的黃瓜葉片中過氧化物酶活性進行檢測, 建立了兩種特征波長下的偏最小二乘回歸預測模型, 發(fā)現(xiàn)采用RF-PLSR模型可以快速無損的檢測出病害早期脅迫下黃瓜葉片中過氧化物酶活性。 Li等[14]基于全波段和連續(xù)投影法提取特征波長, 建立線性偏最小二乘和非線性支持向量機的四個預測模型, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPA-SVM預測模型效果最好, 在其基礎(chǔ)上建立了五階動力學模型, 利用該模型能夠?qū)崿F(xiàn)馬鈴薯晚疫病葉片過氧化物酶活性預測。

以上學者均利用高光譜實現(xiàn)了酶活性的研究, 但是利用高光譜技術(shù)對灰霉病早期脅迫下花椰菜中PPO酶活性進行預測, 尚未有相關(guān)的研究。 本研究采用高光譜結(jié)合化學計量學算法對花椰菜中PPO酶活性建立預測模型, 為實現(xiàn)灰霉病早期脅迫下花椰菜多酚氧化酶活性檢測提供理論參考。

1 實驗部分

1.1 材料

為避免其他未知病害對實驗結(jié)果造成影響, 故選擇對染病樣本進行人工接菌處理。 試驗的花椰菜樣本在試驗當天采摘自太谷區(qū)田地, 運送至實驗室后進行挑選, 選擇表面無明顯損傷的完整花椰菜進行后續(xù)處理。 灰霉菌孢子懸浮液由山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院提供。 將灰霉菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)上培養(yǎng)10 d, 之后洗下孢子, 用無菌水調(diào)整孢子濃度, 得到濃度為1×106個·mL-1的灰霉菌孢子懸浮液用于后續(xù)研究。

將新鮮采摘的完整花椰菜切成大小均勻一致的樣本, 將其浸泡在1%的次氯酸鈉溶液中消毒處理, 取出后用無菌水清洗, 放入超凈工作臺晾干。 用接種針在樣本中上部且花球緊密的位置注入10孢子菌懸液, 之后放入滅菌處理的托盤中, 覆蓋保鮮膜密封, 放入相對濕度為90%, 溫度為21 ℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 24 h后獲取健康及染病花椰菜樣本的高光譜信息, 為了使結(jié)果更準確, 染病樣本的光譜信息應選擇接種位點附近。 圖1(a)為健康樣本, 花球緊密且表面無損傷; 圖1(b)為染病樣本, 接種位點附近出現(xiàn)輕微的變化, 無病斑。

圖1 健康及染病花椰菜樣本圖

1.2 儀器

本試驗的主要儀器有北京卓立漢光公司生產(chǎn)的GaiaSorter-NIR高光譜分選儀, 其工作光譜范圍為900～1 700 nm; 上海智城分析儀器公司生產(chǎn)的ZHJH-C1112C型超凈工作臺, 工作區(qū)下降氣流流速為0.35 m·s-1; 上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)的TGL-16G型離心機; 上海佑科儀器儀表公司制造的T2600型紫外可見分光光度計; 北京科偉永興儀器公司制造的HWS-150型恒溫恒濕培養(yǎng)箱, 其控溫范圍為5～50 ℃, 控濕范圍為50～90%RH; 青島海爾生物醫(yī)療公司生產(chǎn)的DW-86L416G型低溫保存箱, 箱內(nèi)溫度為-40～-80 ℃。

1.3 高光譜信息采集

高光譜儀主要部件有光譜相機、 光源、 移動平臺、 計算機、 暗箱, 該儀器的分辨率為5 nm, 采集系統(tǒng)全部位于暗箱中。 為了得到清晰的圖像, 需要進行多次調(diào)整, 經(jīng)過測試, 當鏡頭與菜花的距離為30 cm, 移動平臺的速度為2.5 cm·s-1, 數(shù)據(jù)的采集效果最好, 得到的圖像最清晰。 為消除暗電流的影響保證試驗的精度, 需要進行黑白板的校正。 其校正的過程為:

首先放入標準白板, 采集標準白板(反射率99.9%)的圖像為IW;

再將相機鏡頭遮蓋住, 采集黑板(反射率0%)的圖像為IB;

最后采集樣本的原始光譜圖像Io。

根據(jù)式(1)得到完成校正的圖像I

(1)

式(1)中:IW為白板光譜圖像;IB為黑板光譜圖像;Io為原始光譜圖像;I為校正后光譜圖像。

Boshkovski[11], Shrestha[12], 程帆[13], Li[14]等學者均使用光譜信息完成了酶活性的研究, 且經(jīng)過預試驗發(fā)現(xiàn)圖像信息對于PPO酶活性預測效果不太理想, 因此本次試驗利用高光譜光譜信息進行PPO酶活性的檢測研究。

光譜信息提取利用ENVI 5.3軟件實現(xiàn), 為保證光譜信息的準確性, 對單個樣本進行背景去除。 首先將樣本反射率極大值(1 074 nm)下圖像與反射率極小值(1 459 nm)下圖像相除, 得到灰度圖像[15]。 將灰度閾值設(shè)置為1.3, 圖像中大于1.3的像素被置為1, 小于1.3的像素被置為0, 得到轉(zhuǎn)化后的掩膜圖像。 在原始光譜圖像中去除掩膜圖像, 得到去除背景的光譜圖像, 在圖像花球緊密的位置選擇5×5的矩形感興趣區(qū)域, 計算所有像素點的平均反射率作為單個樣本的光譜信息。 圖2為單個樣本提取光譜信息的過程。

圖2 單個樣本光譜信息提取流程圖

1.4 PPO活性測定

為防止PPO失活, 用液氮將采集完高光譜信息之后的菜花樣本冷凍處理, 放入編號的密封袋中, 立即移入-80 ℃低溫保存箱中進行保存。 PPO活性測定采用鄰苯二酚法, 其原理為PPO催化鄰苯二酚形成醌, 在分光光度計420 nm處使測量的OD值產(chǎn)生變化, 以每分鐘變化0.1為1個酶活力單位[16]。

具體試驗方法是根據(jù)吳詠等[17]方法作了一些改動。 (1)酶液的制備: 取花椰菜5 g冰浴研磨, 加入10 mL pH為6.4的磷酸緩沖液, 浸提5 h后在4 ℃離心10 min(13 000 r·min-1), 取上清液即酶液。 (2)酶活的測定: 取0.2 mL的酶液, 加入2.0 mL的磷酸緩沖液, 在35 ℃下水浴5 min, 取出后加入2 mL 1%的鄰苯二酚, 搖勻, 立即計時并記錄測定OD值, 之后每30 s記錄一次, 記錄總時長為3 min。 按式(2)計算PPO活性

(2)

式(2)中:U為每分鐘吸光度變化0.1為1個單位;A為樣品克數(shù)(g);B為樣品提取液的總毫升數(shù)(mL);b為測定時用的樣品液毫升數(shù)(mL)。

1.5 光譜數(shù)據(jù)處理

利用光譜-理化值共生距離(sample set partitioning based on joint x-y distances, SPXY)算法對樣本集進行劃分, 校正集的PPO活性值范圍覆蓋預測集PPO活性值有利于提高模型精度。 此次試驗所作預處理為: 卷積平滑算法(savitzky-golay smoothing, SG), 多次取光譜平均值完成數(shù)據(jù)的加權(quán)平均來提高信噪比; 去趨勢算法(de-trending, DT), 將光譜吸光度與波長擬合出的趨勢線去除使光譜特征更加明顯; 中值濾波(median filtering, MF), 利用鄰域窗口的中值代替原始數(shù)據(jù)來減少邊緣模糊; 歸一化處理(normalize, OOR), 在光譜反射率有一定分布規(guī)律時, 對其中一組光譜數(shù)據(jù)進行標準化處理來消除固體顆粒對光譜的影響; 標準正態(tài)變量變換(standard normal variate transformation, SNV), 對單條光譜數(shù)據(jù)進行處理來消除表面散射帶來的影響; 基線校正(baseline), 對被儀器背景等因素所影響的光譜曲線完成修正, 提高模型的穩(wěn)定性。

為了縮短建模時間, 采用兩種方式提取有效波長: 連續(xù)投影算法(successive projection algorithm, SPA)與回歸系數(shù)法(regression coefficient, RC)。 利用偏最小二乘回歸(partial least squares regression, PLSR)、 偏最小二乘支持向量機(least squares support vector machines, LS-SVM)和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)三種方式建模。 模型的質(zhì)量通過相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient,R)與均方根誤差(root mean square error, RMSE)來評估,R越接近1說明模型的精度越高, RMSE越接近0說明模型越穩(wěn)定[18]。

利用ENVI 5.3(Exelis Visual Information Solutions, USA)提取光譜信息; The Unscrambler X(CAMO, Process, AS, Norway)對光譜信息進行預處理并建立PLSR模型; MATLAB 2016 b(The MathWorks, USA)實現(xiàn)特征波長的提取及模型的建立; Origin 2018(OriginLab, USA)進行圖形的繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPO活性結(jié)果分析

在建模前需要進行校正預測集的劃分, 以便于更好的評估建立的模型。 利用SPXY算法進行校正預測集的劃分, 其原理為利用光譜和理化值對樣本間的距離進行計算。 其中健康樣本中校正集劃分193個, 預測集劃分60個; 染病樣本中校正集劃分197個, 預測集同樣劃分60個, 具體劃分的結(jié)果如表1所示。

表1 SPXY算法劃分結(jié)果

由表1可知, 花椰菜PPO活性的均值與類型存在一定的關(guān)系: 染病花椰菜PPO活性均值(12.324 U·g-1)大于健康花椰菜PPO活性均值(10.257 U·g-1), 對兩種不同類型花椰菜的PPO活性進行獨立樣本t檢驗, 結(jié)果如表2所示, 其酶活性存在極顯著性差異(p<0.01)。 表明PPO作為花椰菜防御系統(tǒng)的一部分, 在其感染灰霉病后開始發(fā)揮作用, 增強抗病性來保護自身。

表2 獨立樣本檢驗分析結(jié)果

2.2 光譜曲線分析

感染灰霉病后, 花椰菜的形態(tài)及生理指標都會發(fā)生變化, 反射率也會產(chǎn)生一系列的變化。 為直觀了解這種變化, 計算健康及染病花椰菜樣本的平均光譜并繪制曲線圖, 圖3為健康及染病花椰菜的平均光譜曲線。

圖3 健康及染病花椰菜的平均光譜曲線

2.3 預處理結(jié)果分析

由于獲得的高光譜數(shù)據(jù)可能包含探測器的噪音及固體樣品的光散射等無關(guān)的信息, 預處理可以有效地剔除這些信息, 增加模型的穩(wěn)定性[19]。 采用SG, DT, MF, NOR, SNV及Baseline六種不同方式對光譜數(shù)據(jù)進行單一預處理, 將預處理后的光譜數(shù)據(jù)與PPO值構(gòu)建PLSR模型。 以模型評價參數(shù)R與RMSE的值作為具體的評判標準, 選擇最優(yōu)預處理作后續(xù)研究。 表3為光譜不同預處理后的建模結(jié)果。

表3 不同預處理結(jié)果

由表3可知, 對于健康樣本, NOR預處理后的模型精度較原始光譜有所上升, 模型的穩(wěn)定性也較好, 其預測相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of prediction,Rp)為0.854, 預測均方根誤差(root mean square error of prediction, RMSEP)為1.558, 其余模型的預測精度相比較原始光譜均有所下降; 對于染病樣本, 經(jīng)SG和DT預處理模型的預測精度相比較原始光譜均有所上升, 經(jīng)DT預處理后的模型精度和穩(wěn)定性最好, 其Rp為0.851, RMSEP為1.144, 經(jīng)NOR和SNV預處理效果較差, 可能是預處理后剔除掉了關(guān)鍵信息。 健康樣本經(jīng)DT預處理后建模效果最差, 染病樣本經(jīng)過DT預處理建模效果最好, 可能是樣本染病后光譜的基線漂移現(xiàn)象較嚴重, 而經(jīng)過DT預處理可以消除這種現(xiàn)象, 表明健康與染病樣本分別建模進行預測PPO活性是有必要的。 因此健康樣本選擇經(jīng)過NOR預處理后的光譜進行后續(xù)研究; 染病樣本選擇經(jīng)過DT預處理后的光譜進行后續(xù)研究。

2.4 特征波長的選擇

預處理后的光譜數(shù)據(jù)剔除了其中無關(guān)的信息, 但其全波段光譜數(shù)據(jù)依舊復雜, 進行特征波長的篩選可以減少模型變量數(shù), 提升建模速度, 因此采用變量篩選方式挑出與PPO活性值相關(guān)的波長。 采用SPA和RC兩種方法對經(jīng)過預處理后的光譜數(shù)據(jù)進行特征波長的選擇。

SPA是一種前向算法, 它劃分一個波長個數(shù)范圍, 從第一個波長開始, 計算每個波段在剩余波段下的投影, 按照投影值從大到小排列, 選擇冗余度最小的變量組合[20]。 以健康樣本為例: 圖4為SPA算法提取特征波長的過程, 其中圖4(a)橫軸表示模型包含的變量個數(shù), 縱軸表示均方根誤差的變化, 當變量的個數(shù)為9個時, RMSE值為1.822; 圖4(b)表示提取到的9個波長所在位置。

圖4 SPA提取的特征波長

RC提取特征波長是在建立偏最小二乘回歸模型之后, 在生成的回歸系數(shù)選取極值點, 極值點所對應的波長則為特征波長。 以健康樣本為例: 圖5為通過RC法提取到的特征波長, 分別為915、 953、 994、 1 144、 1 189、 1 249、 1 338、 1 380、 1 434、 1 602、 1 631和1 656 nm。

圖5 RC提取的特征波長

由于SPA提取的數(shù)據(jù)為變量所在位置, 并不是實際的波長, 因此SPA與RC提取的兩種類型的特征波長結(jié)果如表4所示。 健康樣本采用SPA與RC方法提取的特征波長個數(shù)分別為9和12, 比全波段變量數(shù)少了96.46%和95.28%; 染病樣本采用SPA與RC方法提取特征波長個數(shù)分別為7和11, 比全波段變量數(shù)少了97.24%和95.67%, 能夠有效的提升建模速度。

表4 健康與染病樣本的特征波長

2.5 模型分析

為了探究不同特征波長提取方法對模型精度的影響, 比較不同建模方式對花椰菜PPO活性預測的準確度, 將SPA與RC法提取到的特征波段的光譜值作為模型的輸入值, 采用PLSR, LS-SVM和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與PPO活性建立預測模型, 三種模型結(jié)果如表5所示。

表5 三種模型預測結(jié)果

由表5可知, 健康樣本的光譜數(shù)據(jù)經(jīng)SPA優(yōu)化后與PPO活性所建立的PLSR及LS-SVM模型效果優(yōu)于經(jīng)RC優(yōu)化后所建立的兩種模型, 表明SPA算法既提高了建模速度也提高模型的精度。 染病樣本經(jīng)RC方法提取后的光譜數(shù)據(jù)與PPO活性所建立的三種模型效果均優(yōu)于經(jīng)SPA法優(yōu)化后建立的三種模型, 可能是由于SPA提取特征使得關(guān)鍵信息丟失, 造成其模型精度的下降。 對于兩種樣本而言, LS-SVM模型均能夠有很好的預測效果, 證明LS-SVM模型能夠使光譜數(shù)據(jù)與PPO活性產(chǎn)生很好的擬合效果; 而兩種方法提取波長后建立的BP模型精度差距很小, 可能是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的訓練結(jié)果陷入了局部最優(yōu)解。 結(jié)果表明SPA-LS-SVM模型對健康樣本PPO活性預測效果最好, 其Rp為0.832, RMSEP為1.676; RC-LS-SVM模型對染病樣本PPO活性效果預測最好, 其Rp為0.848, RMSEP為1.156, 可以實現(xiàn)花椰菜PPO活性的無損檢測。 模型預測散點圖如圖6所示, 其中圖6(a)為健康花椰菜最優(yōu)模型預測散點圖; 圖6(b)為染病花椰菜最優(yōu)模型預測散點圖。

圖6 最優(yōu)模型預測散點圖

3 結(jié) 論

以花椰菜為研究對象, 分別建立了健康和感染灰霉病花椰菜PPO活性預測模型, 得到如下結(jié)論:

(1)染病花椰菜PPO活性相比健康花椰菜PPO活性有所增加, 表明PPO作為花椰菜防御系統(tǒng)的一環(huán), 在花椰菜感染灰霉病后被激活, 以增強其抗病性保護自身;

(2)兩種樣本采用同一種預處理, 其PLSR模型精度結(jié)果截然相反: 健康樣本經(jīng)NOR預處理后預測精度最高, 而染病樣本經(jīng)NOR處理后預測精度最低, 表明花椰菜染病后其光譜信息基線漂移現(xiàn)象變嚴重;

(3)對比分析三種模型的預測結(jié)果, 發(fā)現(xiàn)LS-SVM模型能夠使光譜數(shù)據(jù)與PPO活性產(chǎn)生很好的擬合效果, 其中SPA-LS-SVM模型對于健康花椰菜PPO活性預測效果較好, 其Rp為0.832, RMSEP為1.676; RC-LS-SVM模型對于染病花椰菜PPO活性預測效果較好, 其Rp為0.848, RMSEP為1.156。

研究表明高光譜檢測技術(shù)可以有效實現(xiàn)灰霉病早期脅迫下花椰菜PPO活性檢測, 然而花椰菜防御系統(tǒng)不只有單一的多酚氧化酶, 之后的研究將立足于酶活性的聯(lián)系, 通過光譜實現(xiàn)花椰菜酶活性的快速檢測。