熒光光譜法的鹵酸脫鹵酶活性全細(xì)胞檢測(cè)

陳 鵬, 陸 峰, 趙云麗

1. 沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110016 2. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200433

引 言

鹵代羧酸作為除草劑、 殺蟲(chóng)劑以及塑料制品的主要成分被廣泛應(yīng)用, 這類(lèi)頑固污染物造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生物體健康問(wèn)題[1]。 鹵酸脫鹵酶作為脫鹵酶家族中的一員, 可以低能耗、 高效率地催化鹵代羧酸脫鹵降解并產(chǎn)生質(zhì)子, 在環(huán)境治理方面存在潛在價(jià)值。 鹵酸脫鹵酶具有立體選擇性, 可從鹵代羧酸中拆分出純手性化合物[2-3]。 該類(lèi)純手性鹵代羧酸又可作為化學(xué)藥品的合成中間體, 如純手性的2-氯丙酸可用于合成心血管治療藥物左西孟旦[4], 故鹵酸脫鹵酶對(duì)于化學(xué)合成領(lǐng)域也具有應(yīng)用價(jià)值[5]。 建立鹵酸脫鹵酶活性的檢測(cè)方法具有重要意義。

傳統(tǒng)的鹵酸脫鹵酶活性檢測(cè)方法是采用色譜法檢測(cè)底物或產(chǎn)物的變化, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力; 隨著光譜學(xué)的發(fā)展, 也有采用比色法檢測(cè)鹵離子的生成, 檢測(cè)時(shí)間相對(duì)減少, 但仍較為耗時(shí), 并且靈敏度不高, 所用試劑具有毒性[5]。 熒光光譜法具有較高的靈敏度、 較低的檢測(cè)限[6]以及較強(qiáng)的抗干擾能力, 比較適合復(fù)雜樣品的直接分析檢測(cè), 在酶活性檢測(cè)和細(xì)胞分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[7-8], 目前已有采用熒光光譜法檢測(cè)鹵代烷脫鹵酶活性的相關(guān)報(bào)道[10]。

已知的鹵酸脫鹵酶絕大部分是2-鹵代羧酸脫鹵酶系, 本研究以該酶系中催化性能較好的鹵酸脫鹵酶(DehE)為研究對(duì)象, 以通用底物2-氯丙酸為實(shí)驗(yàn)底物。 DehE能催化2-氯丙酸脫鹵生成相應(yīng)的乳酸并改變?nèi)蹙彌_能力的反應(yīng)體系的pH[11], 某些熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度受溶液pH影響。 本研究建立了基于熒光光譜法的鹵酸脫鹵酶活性全細(xì)胞檢測(cè)方法, 并采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)驗(yàn)證了方法的專(zhuān)屬性。 該方法能夠簡(jiǎn)單、 快速、 靈敏地在全細(xì)胞水平上檢測(cè)鹵酸脫鹵酶活性, 為后續(xù)鹵酸脫鹵酶的分析研究以及從環(huán)境樣品中原位分析含有鹵酸脫鹵酶的微生物、 發(fā)現(xiàn)新型鹵酸脫鹵酶提供了方法及思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、 試劑與儀器

鹵酸脫鹵酶DehE的重組大腸桿菌E.coliBL21(Pet22b+DehE), 委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行全基因合成、 載體構(gòu)建并成功表達(dá), 由本實(shí)驗(yàn)室保藏; 正常大腸桿菌E.coliBL21, 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

2-萘酚-6,8-二磺酸二鉀(2-Naphthol-6,8-disulfonate dipotassium, NDSDP)、 8-羥基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonate sodium, HPTS), 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethane sulfonic acid, HEPES)、 氫氧化鈉、 2-氯丙酸(2-Chloropropionic acid, 2-CP)、 乳酸(Lactic acid, HL)、 磷酸二氫鉀、 氯化鈉均為分析純?cè)噭? 甲醇、 磷酸為色譜級(jí)試劑, 酵母提取物, 胰蛋白胨, 均購(gòu)于上海泰坦科技股份有限公司; 實(shí)驗(yàn)用水為自制去離子水。

實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)FE20, 梅特勒-托利多儀器有限公司; 恒溫孵育搖床ES-60, 杭州米歐儀器有限公司; 電子天平ISO 9001, 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司; 高速離心機(jī)TG16-WS, 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司; 恒溫混勻儀VS-100C, 無(wú)錫沃信儀器制造有限公司; 立式高壓蒸汽滅菌器LDZF-50L-Ⅱ, 上海申安醫(yī)療器械廠; 超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop one, 賽默飛世爾科技有限公司; 熒光分光光度計(jì)FL6500, 珀金埃爾默股份有限公司; 高效液相色譜儀Agilent 1260 Infinity Ⅱ, 安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

HEPES緩沖液: 稱(chēng)取HEPES固體2.3831 g溶于5 mL去離子水中, 配制終濃度為2 mol·L-1的HEPES儲(chǔ)備液, 再取適量加入去離子水稀釋, 并用4 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH, 配制成不同pH(6.00～10.50)、 濃度為所需濃度的系列HEPES緩沖液。

2-CP溶液: 量取2-CP液體適量, 用HEPES緩沖液8 mL稀釋, 并用4 mol·L-1的NaOH溶液調(diào)pH, 配制成pH與稀釋用HEPES緩沖液的pH相同、 濃度為所需濃度的2-CP溶液。

LB培養(yǎng)基: 稱(chēng)取酵母提取物0.5 g, 氯化鈉1.0 g, 胰蛋白胨1.0 g, 溶解于100 mL去離子水中, 用4 mol·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性, 在立式高壓蒸汽滅菌器里以121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min后, 冷卻備用。

1.2.2 全細(xì)胞菌體的培養(yǎng)及制備

從凍存管中取DehE重組大腸桿菌的甘油菌液100 μL接種于含氨芐西林50 mg·L-1的5 mL LB培養(yǎng)基中, 置于恒溫孵育搖床中在37 ℃、 200 r·min-1條件下培養(yǎng)過(guò)夜。 取該培養(yǎng)液以體積分?jǐn)?shù)2%(v/v)接種于含氨芐西林50 mg·L-1的100 mL LB培養(yǎng)基, 在37 ℃、 200 r·min-1條件下培養(yǎng)至OD600(optical density at 600 nm)為0.6～1.0(大致培養(yǎng)2.5 h。OD600為細(xì)菌混懸液在600 nm處的光密度, 由超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定, 一般表示細(xì)菌混懸液的細(xì)胞濃度)。 向培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0.011 9 g(終濃度為0.5 mmol·L-1), 在27 ℃、 200 r·min-1條件下誘導(dǎo)過(guò)夜, 在高速離心機(jī)中5 000 g離心5 min, 收集菌體, 用生理鹽水重懸洗滌, 5 000 g離心5 min, 洗滌兩次, 收集菌體, 于-20 ℃儲(chǔ)存, 備用。

正常大腸桿菌E.coliBL21于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng), 除不加誘導(dǎo)劑外, 其余同法操作。

1.2.3 熒光-pH指示劑的pH敏感性測(cè)定

稱(chēng)取0.019 0 g的NDSDP固體(λex=365 nm,λem=460 nm)和0.026 2 g的HPTS固體(λex=375 nm,λem=512 nm)分別溶于10 mL去離子水中, 配制成終濃度均為5 mmol·L-1的儲(chǔ)備液。 再分別取適量NDSDP、 HPTS儲(chǔ)備液用不同pH的HEPES濃度為20 mmol·L-1的系列HEPES緩沖液稀釋成終濃度分別為10和1 μmol·L-1的pH梯度溶液。 取各自的pH梯度溶液60 μL, 用光路長(zhǎng)為1 mm的石英比色皿在熒光分光光度計(jì)中進(jìn)行熒光光譜掃描。

1.2.4 方法的可行性分析

根據(jù)DehE能催化2-氯丙酸脫鹵生成相應(yīng)的乳酸并改變反應(yīng)體系pH(圖1)這一催化原理, 進(jìn)行熒光檢測(cè)。

圖1 DehE催化2-氯丙酸轉(zhuǎn)化為乳酸

分別取足量的DehE重組大腸桿菌和BL21正常大腸桿菌濕菌體, 用pH 8.25[9]、 20 mmol·L-1的HEPES緩沖液稀釋至菌液OD600=2.0。 按表1添加試劑構(gòu)建反應(yīng)體系, 進(jìn)行催化反應(yīng)活性檢測(cè)(菌體反應(yīng)液OD600為1.0, NDSDP和2-CP的終濃度分別為10 μmol·L-1和30 mmol·L-1), 在恒溫混勻儀中進(jìn)行, 在30 ℃[4]、 800 r·min-1條件下反應(yīng), 按時(shí)取樣60 μL, 用光路長(zhǎng)為1 mm的石英比色皿進(jìn)行熒光光譜掃描(λex=365 nm,λem=460 nm)。

表1 反應(yīng)體系中的試劑用量

1.2.5 熒光檢測(cè)方法的條件優(yōu)化

采用正交實(shí)驗(yàn)法, 根據(jù)可能影響熒光強(qiáng)度變化的條件, 選取反應(yīng)體系中的HEPES濃度(A)、 pH(B)、 溫度(C)、 2-CP濃度(D)為考察因素, 每因素4水平(表2)。 菌體反應(yīng)液OD600恒定為1.0, 以15 min時(shí)DehE組與BL21組的熒光變化率ω之差Δω為考察指標(biāo), 以15 min時(shí)的BL21菌反應(yīng)液的熒光變化率ω為假陽(yáng)性控制指標(biāo)。 計(jì)算公式如式(1)和式(2)

表2 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

ω=(I0-It)/I0×100%

(1)

Δω=ωBL21-ωDehE

(2)

式(1)和式(2)中,I0為0 min時(shí)熒光強(qiáng)度,It為15 min時(shí)的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 方法的專(zhuān)屬性驗(yàn)證

根據(jù)反應(yīng)前后底物2-CP以及產(chǎn)物HL量的變化, 采用HPLC對(duì)所建鹵酸脫鹵酶活性全細(xì)胞熒光檢測(cè)方法的專(zhuān)屬性進(jìn)行驗(yàn)證。

色譜條件[11]: 色譜柱喆分Acutfex PW-C18(250×4.6 mm, 5 μm); 流動(dòng)相0.04 mol·L-1KH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 2.4)∶甲醇=95∶5; 流速0.8 mL·min-1; 柱溫30 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

對(duì)照品溶液的制備與檢測(cè): 吸取10 μL的 HEPES儲(chǔ)備液、 4.13 μL的2-CP、 3.35 μL的HL分別溶于1 mL的0.04 mol·L-1KH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 2.40), 制成各自的對(duì)照品溶液。 再取10 μL的 HEPES儲(chǔ)備液、 4.13 μL的2-CP、 3.35 μL的HL溶于1 mL的0.04 mol·L-1KH2PO4-H3PO4緩沖一(pH 2.40), 制備混合對(duì)照品溶液。 均取適量溶液過(guò)0.22 μm的尼龍濾膜后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

菌體反應(yīng)液的檢測(cè): 在反應(yīng)體系中菌體OD600為1.0、 HEPES濃度20 mmol·L-1、 pH 8.50、 45 ℃、 2-CP濃度45 mmol·L-1條件下, 不加NDSDP反應(yīng)1 h后以5 000 r·min-1離心5 min, 取上清液500 μL, 加入甲醇500 μL, 混合均勻后以5 010 r·min-1離心5 min, 取適量上清液過(guò)0.22 μm的尼龍濾膜后進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光-pH指示劑的pH敏感性測(cè)定

某些熒光物質(zhì)分子、 離子間的平衡狀態(tài)隨溶液pH值發(fā)生改變, 進(jìn)而導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度亦發(fā)生變化, 可用作pH指示劑。 Nevolova等[9]篩選出了具有較強(qiáng)pH敏感性的熒光-pH指示劑HPTS。 本研究根據(jù)HPTS的化學(xué)結(jié)構(gòu), 選擇了一種結(jié)構(gòu)相似的熒光物質(zhì)NDSDP。 二者的pH梯度熒光光譜如圖2(a, b)所示, pH敏感性測(cè)定結(jié)果如圖3所示。 NDSDP在鹵酸脫鹵酶活性良好的弱堿性范圍(pH 8.0～9.5)內(nèi)具有更強(qiáng)的pH敏感性, 并且容易獲取, 成本低, 故選擇NDSDP作為熒光-pH指示劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 (a) NDSDP的pH梯度熒光光譜(n=3);

圖3 NDSDP、 HPTS的pH敏感性對(duì)比(n=3)

2.2 可行性分析

選擇2-鹵代羧酸脫鹵酶中研究較為廣泛的DehE脫鹵酶作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 以通用底物2-CP為實(shí)驗(yàn)底物, 以無(wú)細(xì)胞毒性的HEPES溶液為緩沖體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 由于2-CP為羧酸類(lèi)化合物, 顯酸性, 直接投入反應(yīng)液中會(huì)影響反應(yīng), 所以在反應(yīng)前先將2-CP經(jīng)HEPES緩沖液稀釋并調(diào)節(jié)pH。 將等pH值的HEPES緩沖液和2-CP溶液等量混合后pH值無(wú)變化, 故采取等量混合的方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

熒光檢測(cè)結(jié)果如圖4所示, 當(dāng)反應(yīng)體系僅有底物2-CP、 HEPES緩沖液以及NDSDP存在時(shí), NDSDP的熒光值無(wú)明顯變化, 表明底物自發(fā)反應(yīng)引起的指示劑熒光強(qiáng)度減小可忽略不計(jì), 反應(yīng)體系保持穩(wěn)定; 當(dāng)反應(yīng)體系僅有菌體、 HEPES緩沖液以及NDSDP存在時(shí), NDSDP的熒光值無(wú)明顯變化, 表明只有菌體存在時(shí)反應(yīng)體系保持穩(wěn)定; 當(dāng)BL21菌體、 底物2-CP、 HEPES緩沖液以及NDSDP都存在時(shí)(BL21組), NDSDP的熒光值無(wú)明顯變化, 表明沒(méi)有DehE時(shí), 該方法在此反應(yīng)條件下不易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾; 當(dāng)DehE菌體、 底物2-CP、 HEPES緩沖液以及NDSDP都存在時(shí)(DehE組), NDSDP的熒光值出現(xiàn)顯著下降, 表明反應(yīng)體系的pH降低, 發(fā)生了由鹵酸脫鹵酶DehE催化的2-CP脫鹵反應(yīng)。 因此, 建立的鹵酸脫鹵酶酶活性全細(xì)胞熒光檢測(cè)方法是可行的。

圖4 熒光光譜法檢測(cè)DehE活性(n=3)

2.3 條件優(yōu)化的正交

由圖4可知, 反應(yīng)進(jìn)行15 min時(shí)的DehE組的熒光強(qiáng)度降低了20%, 發(fā)生了明顯變化, 因此以15 min時(shí)的DehE組和BL21組的熒光變化率ω之差Δω為考察指標(biāo); 同時(shí)為防止假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn), 設(shè)置15 min時(shí)的BL21組的熒光變化率ω為假陽(yáng)性控制指標(biāo)。

正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果見(jiàn)表3。 Δω的直觀分析表明, 各因素作用的主次順序?yàn)锳>C>B>D, 即HEPES濃度為主要影響因素。 根據(jù)16組實(shí)驗(yàn)中ωBL21的計(jì)算結(jié)果, 并考慮到測(cè)量誤差, 規(guī)定ωBL21高于5%±1%, 即高于6%時(shí), 為假陽(yáng)性結(jié)果。 又因?yàn)?6組實(shí)驗(yàn)中ωBL21>6%的頻率為25%, 所以規(guī)定某一水平下ωBL21>6%的頻率超過(guò)25%時(shí), 認(rèn)定為易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果, 須舍棄該水平。 在HEPES濃度因素里, k1>k2>k3>k4, 表明HEPES濃度越高, 緩沖能力越強(qiáng), pH變化也就越困難, 但在A1水平下ωBL21>6%的頻率為75%, 即在A1水平下, 反應(yīng)體系弱緩沖能力過(guò)弱, 易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果, 而在A2水平下ωBL21>6%的頻率為25%, 故舍棄A1, 最優(yōu)水平為A2。 同理, pH最優(yōu)水平為B3, 溫度最優(yōu)水平為C4, 2-CP濃度最優(yōu)水平為D3。 綜上所述, 所建方法最優(yōu)條件為反應(yīng)體系中HEPES濃度20 mmol·L-1、 pH 8.50、 2-CP濃度45 mmol·L-1, 溫度有待進(jìn)一步優(yōu)化。

表3 條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n=3)

在反應(yīng)體系中菌體OD600=1.0、 20 mmol·L-1HEPES、 pH 8.50、 45 mmol·L-12-CP條件下反應(yīng), 對(duì)溫度因素設(shè)置40、 45和50 ℃三個(gè)水平分別進(jìn)行熒光檢測(cè)。 結(jié)果見(jiàn)表4, 表明溫度越高, Δω值越大, 但在50 ℃條件下ωBL21>6%, 即易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果, 而45 ℃條件下ωBL21=6%, 故最優(yōu)溫度為45 ℃。

表4 溫度因素優(yōu)化結(jié)果(n=3)

按照篩選出的最優(yōu)條件, 在稀釋菌液OD600=2.0(反應(yīng)體系中菌體OD600=1.0)的條件下進(jìn)行反應(yīng)后檢測(cè), 結(jié)果如圖5。 可以看出15 min時(shí)DehE組的熒光強(qiáng)度就下降了50%, 且BL21組的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化。

2.4 專(zhuān)屬性驗(yàn)證

按照優(yōu)化后的條件反應(yīng), 取樣進(jìn)行HPLC檢測(cè), 結(jié)果如圖6所示。 可以看出: BL21組中, 由于底物自發(fā)的脫鹵反應(yīng), 有極少量HL生成; DehE組中, 經(jīng)DehE的催化, 有大量的HL生成, 同時(shí)對(duì)比BL21組, 也可以看出2-CP的減少。 因此, 經(jīng)過(guò)HPLC的驗(yàn)證, 采用熒光光譜法的鹵酸脫鹵酶活性全細(xì)胞檢測(cè)方法是可行的。

圖6 HPLC驗(yàn)證色譜圖

2.5 方法檢測(cè)限的測(cè)定

在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行熒光檢測(cè), 設(shè)置稀釋菌液OD600值為2.0、 1.0、 0.5、 0.4、 0.3分別進(jìn)行反應(yīng), 以15 min時(shí)的熒光變化率ω為考察指標(biāo), 結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 檢測(cè)限的測(cè)定結(jié)果(n=3)

將ωDehE作為檢測(cè)信號(hào),ωBL21作為噪音, 按照信噪比為3∶1計(jì)算檢測(cè)限。 雖然OD600=0.3時(shí)信噪比為3.7, 仍大于3, 但考慮到檢測(cè)誤差, 將檢測(cè)限設(shè)定偏高, 即該方法對(duì)DehE菌體檢測(cè)限為菌液OD600=0.3。 由此可以推出結(jié)論: 當(dāng)微生物含有的鹵酸脫鹵酶活性與DehE相當(dāng)時(shí), 所建立的方法對(duì)該微生物的檢測(cè)限為菌液OD600=0.3。

3 結(jié) 論

研究建立的熒光分析法可快速、 簡(jiǎn)單、 靈敏地在全細(xì)胞水平上檢測(cè)鹵酸脫鹵酶活性, 不僅可以定性評(píng)估酶活性, 在一定基礎(chǔ)上還可以定量評(píng)估, 具有高通量篩選的潛力。 該方法在反應(yīng)體系中HEPES濃度20 mmol·L-1、 pH 8.50、 45℃、 2-CP濃度45 mmol·L-1這一條件下檢測(cè)效果最好, 可在15 min內(nèi)完成檢測(cè), 并且能避免假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)。 同時(shí), 該方法還可用于含有鹵酸脫鹵酶的微生物的發(fā)現(xiàn)及鑒定, 對(duì)于含有活性與DehE相當(dāng)?shù)柠u酸脫鹵酶的微生物, 該方法對(duì)其的檢測(cè)限為菌液OD600=0.3, 可利用此方法開(kāi)發(fā)出鹵酸脫鹵酶的原位分析方法, 直接從環(huán)境樣品中原位篩查含鹵酸脫鹵酶的微生物。 該方法的研究思路也適用于在催化反應(yīng)中引起質(zhì)子形成或消耗的其他生物酶的活性分析。