赫氏真厚螺的檢疫鑒定

王沛 胡美玲 姜嬌 張衛(wèi)紅 陳宇 林金成 林陽武 周衛(wèi)川

摘要

赫氏真厚螺Euhadra?herklotsi是一種重要的園藝有害生物。本文采用貝殼形態(tài)、生殖系統(tǒng)解剖和分子生物學相結(jié)合的方法對福建口岸截獲的一種蝸牛進行檢疫鑒定，結(jié)果表明，該蝸牛為赫氏真厚螺，并與近似種的形態(tài)鑒別特征進行了比較，討論了蝸牛序列比對鑒定方法的適用性，為國境口岸防御該蝸牛的入侵提供了科學依據(jù)。

關鍵詞

赫氏真厚螺;?貝殼形態(tài);?生殖系統(tǒng)解剖;?分子特征;?植物檢疫

中圖分類號：

S?41

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022726

Quarantine?and?identification?of?Euhadra?herklotsi

WANG?Pei1，2，?HU?Meiling1，2，?JIANG?Jiao3，?ZHANG?Weihong4，?CHEN?Yu1，2，?LIN?Jincheng5，

LIN?Yangwu1，?ZHOU?Weichuan1，2*

（1.?Technology?Center?of?Fuzhou?Customs?District，?Fuzhou?350001，?China;?2.?Fujian?Key?Laboratory?of?

Inspection?and?Quarantine?Technology?Reserach，?Fuzhou?350001，?China;?3.?Zhejiang?Natural?Nature?Museum，?

Hangzhou?310014，?China;?4.?College?of?Life?Science?and?Technology，?Xinjiang?University，?Urumqi?830000，?

China;?5.?Fuzhou?Customs?District，?Fuzhou?350015，?China）

Abstract

Euhadra?herklotsi?is?an?important?horticultural?pest.?In?this?paper，?a?snail?intercepted?at?Fujian?port?was?quarantined?and?identified?by?the?methods?of?shell?morphology，?reproductive?system?anatomy?and?molecular?biology.?The?results?showed?that?the?snail?was?E.herklotsi，?and?the?morphological?identification?characteristics?among?E.herklotsi?and?its?sibling?species?were?compared.?In?addition，?the?applicability?of?the?sequence?alignment?identification?method?was?discussed.?This?paper?provided?scientific?basis?for?preventing?the?invasion?of?this?snail?at?the?border?port.

Key?words

Euhadra?herklotsi;?shell?morphology;?reproductive?system?anatomy;?molecular?characteristic;?plant?quarantine

赫氏真厚螺Euhadra?herklotsi?（Martens，?1861）隸屬于軟體動物門Mollusca，腹足綱Gastropoda，柄眼目Stylommatophora，巴蝸?？艬radybaenidae，真厚螺屬Euhadra［1］，是國際植物檢疫中備受關注的一種危險性有害生物。該蝸牛主要分布于日本和韓國，不但嚴重為害各種蔬菜、瓜果、花卉和農(nóng)作物，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要有害生物，而且是許多人畜共患寄生蟲的中間宿主，影響人畜健康［25］。此外，該螺爬行后可留下銀灰色的黏液痕跡，嚴重降低水果蔬菜等作物的商品價值，影響居民區(qū)和風景區(qū)的環(huán)境衛(wèi)生。

赫氏真厚螺常生活在山區(qū)、丘陵地帶潮濕的灌木叢、草叢、石塊或落葉下，喜食植物多汁的嫩葉及嫩芽部分［24］，故對園藝作物危害最大。該蝸牛晝伏夜出，常藏匿于陰暗潮濕處，通常以休眠方式隨貨物和木質(zhì)包裝材料遠距離傳播。2016年福建口岸從日本進境旅客攜帶物中首次截獲赫氏真厚螺，該蝸牛在中國大陸尚無分布記錄［67］，因此必須加強檢疫，嚴防其入侵和為害。目前真厚螺屬的分類與鑒定仍以貝殼形態(tài)為主，但貝殼形態(tài)常因地理環(huán)境的變化而變異，對一些貝殼特征不典型的標本容易造成誤定［89］。本文采用貝殼形態(tài)、軟體解剖和分子生物學相結(jié)合的方法研究了該蝸牛的鑒定技術，并與近似種的形態(tài)鑒別特征進行了比較，討論了蝸牛序列比對鑒定方法的適用性，主要結(jié)果報道如下。

1?材料和方法

1.1?試驗材料

2016年福建口岸從日本進境旅客攜帶物中截獲的蝸牛12只，其中4只活體標本先按照《軟體動物常規(guī)檢疫規(guī)范（SN/T?30672011）》［10］中方法進行滅活和脫水處理，然后-40℃冷凍保存?zhèn)溆??？諝吮鞠磧艉娓珊蟪乇４妗?/p>

1.2?試驗方法

1.2.1?形態(tài)學鑒定

用電子游標卡尺測量成螺貝殼的殼高和殼寬，精度為0.1?mm。用放大鏡觀察貝殼的形態(tài)特征，生殖系統(tǒng)解剖在體視顯微鏡（ZEISS?Stemi?2000）下操作，根據(jù)檢驗檢疫行業(yè)標準《軟體動物常規(guī)檢疫規(guī)范（SN/T?30672011）》［10］和Dillon［11］的報道進行貝殼形態(tài)的觀察、測量和描述。按照Gómez［12］的方法進行生殖系統(tǒng)的解剖、繪圖和描述。

用單反相機（CANON?550D），分別拍攝貝殼標本的正側(cè)面、背面和腹面，以電子影像文件儲存。

1.2.2?分子生物學鑒定

1.2.2.1?基因組DNA提取及PCR擴增

取赫氏真厚螺腹足肌肉0.02?g，按照天根生化科技（北京）有限公司的TIANamp?Genomic?DNA提取試劑盒說明書提取基因組總DNA。利用線粒體COⅠ基因通用引物（LCO1490：?5′GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG3′;?HCO2198：?5′

TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA3′）進行PCR擴增［13］。

PCR反應體系：DNA模板（100?ng/μL）2?μL，?LCO1490（10?μmol/L）和?HCO2198（10?μmol/L）各0.5?μL，2×Master?Mix?10?μL，用超純水定容至?20?μL。PCR反應程序為：94℃預變性?5?min;94℃?變性?50?s，45℃退火?30?s，72℃延伸?50?s，30?個循環(huán);72℃延伸?10?min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，目標片段送生工生物工程（上海）有限公司進行雙向測序。

1.2.2.2?序列拼接與比對

將雙向測序結(jié)果用序列分析軟件?BioEdit?V.7.0［14］進行序列的拼接和人工校對，并與GenBank已公布的赫氏真厚螺的?COⅠ基因序列進行比對。

2?結(jié)果與分析

2.1?形態(tài)學鑒定

2.1.1?貝殼形態(tài)

材料檢查：來自日本南部，成螺活體4個（QRB75～QRB78），空殼8個，其中成螺6個（QRB79～QRB84），幼螺2個（QRB85～QRB86）。

測量結(jié)果：成螺，殼高11.5～25.0?mm，?殼寬20.5～36.1?mm。

貝殼形態(tài)：貝殼大，殼質(zhì)厚，堅實，呈矮圓錐形。有5～6個螺層，前幾個螺層緩慢增長，略膨脹，螺旋部低矮。體螺層近圓形，膨大，其高度約為殼高的2/3，在殼口處向右下方傾斜。殼頂鈍，縫合線深。殼面顏色多變，乳白色、淺黃色、紫褐色，有稠密而較粗的生長線和刻紋。體螺層周緣有一條螺旋狀的紫褐色條帶，并向螺旋部延伸，逐漸靠近縫合線，最終與縫合線完全重疊。殼口馬蹄形，向下傾斜?？诖酵庹郏?，淺紫色。軸唇在臍孔處略外折，內(nèi)唇貼覆于體螺層上，形成稍厚的胼胝部。臍孔大而深，呈洞穴狀，周圍紫褐色。

圖1?赫氏真厚螺貝殼形態(tài)

Fig.1?Shell?morphology?of?Euhadra?herklotsi

2.1.2?生殖系統(tǒng)

在蠟盤上解剖軟體并分離出生殖系統(tǒng)后，按Gómez［12］的方法將生殖系統(tǒng)特征描述如下：矢囊大，副矢囊中等大小，似長柱形。黏液腺約13枝，呈放射狀排列。受精囊橢圓形，受精囊柄長。輸卵管中等粗細。輸精管細，長度約為輸卵管的2.5倍。鞭狀體末端細小。陰莖牽引肌略粗，短。陰莖長，中等粗細。本文描述的生殖系統(tǒng)特征（圖2）與前人的記述基本一致［4］，但后者沒將黏液腺進行分離和統(tǒng)計。

圖2?赫氏真厚螺生殖系統(tǒng)

Fig.2?Reproductive?system?of?Euhadra?herklotsi

2.2?分子生物學鑒定

活體標本（實驗室冷凍標本編號：QRB75），經(jīng)DNA提取、PCR擴增、雙向測序、序列拼接和人工校對后，得到682?bp長度序列，經(jīng)與GenBank已發(fā)表的赫氏真厚螺（登錄號：AB852699.1）線粒體COⅠ基因片段序列（533?bp）比對，覆蓋率為100%，序列一致性為97.75%。根據(jù)已有的陸生軟體動物分子系統(tǒng)學文獻分析，有的物種同源性大于98%才確認為同種［1517］，也有的學者認為同源性大于94%即可認為是同一物種［18］，這與某些學者描述的其他動物一致性大于98%可認為是同種差別較大［1920］，不同的物種判定標準不同。對于陸生軟體動物可能的原因是移動能力弱，容易形成地理種群隔離，種群間的基因交流遠不及飛翔的昆蟲等動物［2122］。

3?結(jié)論和討論

赫氏真厚螺在日本和韓國廣泛分布，本文對其進行了貝殼形態(tài)、軟體解剖和分子生物學研究，以期為相關人員提供鑒定技術資料。該蝸?？呻S苗木、花卉、運輸工具、木質(zhì)包裝材料、未經(jīng)加工的其他植物性材料等遠距離傳播。我國迄今為止尚無該蝸牛分布，但從該蝸牛目前分布的緯度來看，我國大部分地區(qū)的生態(tài)環(huán)境和氣候條件適合該蝸牛生棲繁殖，且其為雜食性，寄主廣泛。因此，建議有關部門加強對其檢疫，警惕其傳入國內(nèi)。

赫氏真厚螺、阿瑪麗真厚螺E.amaliae?和亞頦真厚螺E.subnimbosa都是右旋真厚螺，形態(tài)上較為相似，且在日本均有分布［1，6］，容易誤定。三者的主要鑒別特征列于表1，供檢疫鑒定時參考。

在具體的檢疫實踐中，往往難以獲得典型的標本，如送鑒的標本為幼螺或不成熟時，形態(tài)鑒定就十分困難，由于檢測周期的限制，飼養(yǎng)為成螺再鑒定則

更不可能［23］，成螺貝殼也會因環(huán)境影響而形成不典型的貝殼特征，需要用其他鑒定方法進行輔助鑒定［2122］。本文測定的COⅠ序列為赫氏真厚螺的分子比對鑒定提供了新的技術方法，PCR技術在國境口岸基層檢驗檢疫部門已經(jīng)普及，該項技術以生物基因組DNA序列比對為基本依據(jù)，具有檢測周期短、特異性強、靈敏度高等特點。目前，無脊椎動物已有公認的線粒體COⅠ基因通用引物，技術成熟，受檢測目標的形態(tài)變異、成熟度等方面影響較?。?4］，特別適合于卵粒、幼螺等不具備形態(tài)鑒定條件樣品的快速檢測鑒定。

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