青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒的分子鑒定及相關(guān)序列分析

鐘靜 李婷婷 韓天華 李學(xué)衛(wèi) 尹躍艷 陳越 馬文廣 丁銘

摘要

番茄斑萎病毒（tomato?spotted?wilt?virus，?TSWV）和煙草花葉病毒（tobacco?mosaic?virus，?TMV）是2種重要的植物病原病毒，對(duì)多種經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)均造成嚴(yán)重影響。2021年-2022年，在云南省麗江市煙草種植區(qū)不同煙區(qū)采集葉片黃化、皺縮以及無(wú)癥狀的青蒿Artemisia?caruifolia樣品共計(jì)14份，利用免疫金標(biāo)速測(cè)卡和RTPCR對(duì)其病原病毒進(jìn)行檢測(cè)。利用免疫金標(biāo)速測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果顯示，在所檢樣品中有9份樣品檢測(cè)出TSWV，檢出率為64.28%，有3份樣品檢測(cè)出TMV，檢出率為21.43%，2種病毒復(fù)合侵染的檢出率同樣為21.43%;利用RTPCR對(duì)復(fù)合侵染的3份樣品進(jìn)行分子檢測(cè)，結(jié)果顯示，在3份復(fù)合侵染青蒿樣品中獲得3條TSWV?N基因序列、3條TMV?cp基因序列和2條TMV?RdRp部分序列。TSWV青蒿分離物與分離自云南的TSWV2分離物相似性最高，為99.6%;TMV青蒿分離物與分離自遼寧的TMVShenyang分離物和分離自云南的TMVYongren1相似性最高，均大于99.4%。這是首次發(fā)現(xiàn)TSWV和TMV?2種不同屬病毒復(fù)合侵染青蒿。

關(guān)鍵詞

番茄斑萎病毒;?煙草花葉病毒;?青蒿;?復(fù)合侵染

中圖分類號(hào)：

S?435.72

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2022728

Molecular?identification?and?sequence?analysis?of?tomato?spotted?wilt?virus?and?tobacco?mosaic?virus?on?Artemisia?caruifolia

ZHONG?Jing1#，?LI?Tingting1#，?HAN?Tianhua2，?LI?Xuewei2，?YIN?Yueyan3，?CHEN?Yue1，

MA?Wenguang2*，?DING?Ming1*

（1.?Institute?of?Biotechnology?and?Germplasm?Resources，?Yunnan?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Yunnan?Provincial?

Key?Laboratory?of?Agricultural?Biotechnology，?Key?Laboratory?of?the?Southwestern?Crop?Gene?Resources?and?

Germplasm?Innovation，?Ministry?of Agriculture?and?Rural?Affairs，?Kunming?650223，?China;?2.?Lijiang?Branch?

Company?of?Yunnan?Tobacco?Company，?Lijiang?674100，?China;?3.?Institute?of?Alpine?Economic?Plant，?Yunnan?

Academy?of?Agricultural?Sciences，?Lijiang?674199，?China）

Abstract

Tomato?spotted?wilt?virus?（TSWV）?and?tobacco?mosaic?virus?（TMV）?are?two?important?viral?pathogens?that?account?for?significant?yield?losses?and?quality?damage?in?many?economically?important?crops.?During?2021-2022，?14?sweet?wormwood?（Artemisia?caruifolia）?leaf?samples?with?leaf?yellowing?and?curling?symptoms?or?asymptomatic?were?collected?from?tobacco?fields?in?Lijiang?of?Yunnan?province.?The?colloidal?gold?antigen?rapid?screen?kits?and?RTPCR?were?used?to?identify?the?pathogens?of?diseased?plants.?Immunological?assays?using?colloidal?gold?antigen?rapid?screen?kits?showed?that?nine?leaf?samples?were?infected?with?TSWV?（64.28%?positive?rate），?three?infected?with?TMV?（21.43%?positive?rate），?and?three?infected?with?both?TSWV?and?TMV.?RTPCR?was?carried?out?to?obtain?viral?sequences?from?these?three?coinfected?sweet?wormwood?samples.?Then?three?N?gene?sequences?of?TSWV，?three?cp?sequences?and?two?partial?RdRp?sequences?of?TMV?were?obtained.?Sequence?alignment?showed?that?the?TSWV?isolates?were?most?closely?related?to?the?TSWV2?isolate?from?Yunnan?sharing?99.6%?sequence?identity，?and?the?TMV?isolates?shared?the?highest?sequence?identity?（>99.4%）?with?the?Shenyang?isolate?from?Liaoning?and?Yongren1?isolate?from?Yunnan.?It?is?the?first?report?that?sweet?wormwood?plants?were?coinfected?by?TSWV?and?TMV.

Key?words

tomato?spotted?wilt?virus;?tobacco?mosaic?virus;?Artemisia?caruifolia;?mixed?infection

番茄斑萎病毒（tomato?spotted?wilt?virus，?TSWV）屬于布尼亞病毒目Bunyavirales番茄斑萎病毒科Tospoviridae正番茄斑萎病毒屬Orthotospovirus，病毒粒子為球狀，大小為80～120?nm［1］。TSWV基因組包含L?RNA（9.8?kb）、M?RNA（4.8?kb）和S?RNA（2.9?kb）3條鏈，共編碼5個(gè)蛋白。L鏈編碼331.5?kD的RNA聚合酶蛋白（RNA?polymerase），M鏈編碼33.6?kD的非結(jié)構(gòu)蛋白NSm和127.4?kD的糖蛋白GnGc，S鏈編碼52.4?kD的非結(jié)構(gòu)蛋白NSs和28.8?kD的核殼體蛋白（uncleocapsid?protein，?N），其中核殼體蛋白N為TSWV分類的重要依據(jù)［2］。TSWV侵染后植株表現(xiàn)出枯萎、環(huán)斑以及頂梢枯死等癥狀。目前至少有9種薊馬能夠傳播番茄斑萎病毒，其中西花薊馬Frankliniella?occidentalis是最重要的一種，傳播方式為持久性循回增殖傳播，由于TSWV可以在薊馬體內(nèi)復(fù)制增殖，所以薊馬不僅是番茄斑萎病毒的傳播介體，還是番茄斑萎病毒的天然宿主［3］。自1915年在澳大利亞發(fā)現(xiàn)至今，TSWV已在中國(guó)、伊朗、土耳其、意大利、美國(guó)、孟加拉、韓國(guó)等幾十個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生，在世界范圍內(nèi)對(duì)各地農(nóng)作物造成嚴(yán)重危害，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［46］。在我國(guó)，TSWV也對(duì)不同地區(qū)的作物造成了嚴(yán)重危害，且分布范圍廣，從北京、山東到寧夏再到云南均有TSWV發(fā)生;而在云南省辣椒Capsicum?annuum、萵苣Lactuca?sativa、生菜L.sativa?var.?romosa、番茄Solanum?lycopersicum等作物均不同程度地受到TSWV危害［712］。

煙草花葉病毒（tobacco?mosaic?virus，?TMV）屬于馬泰利病毒目Martellivirales植物桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬Tobamovirus，病毒粒子為桿狀，大小為18?nm×300?nm。TMV為正義單鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)為6?395?bp，有3個(gè)開(kāi)放閱讀框，至少編碼4個(gè)蛋白，分別為126?kD和?183?kD?的復(fù)制蛋白（replication?protein，?Rep）、30?kD?的運(yùn)動(dòng)蛋白（movement?protein，?MP）以及17.5?kD的外殼蛋白（coat?protein，?CP），其中外殼蛋白是TMV分類的重要依據(jù)［2］。在自然界中TMV主要通過(guò)汁液摩擦傳播，同時(shí)也通過(guò)蚜蟲、土壤以及種子傳播，不同寄主被侵染后表現(xiàn)出不同的癥狀，侵染煙草時(shí)表現(xiàn)出黃綠相間的花葉癥狀，嚴(yán)重時(shí)形成皰斑。TMV的分布范圍十分廣泛，在巴西、韓國(guó)、美國(guó)、中國(guó)、德國(guó)等國(guó)家均有發(fā)生［1315］。2011年TMV被列為世界十大植物病毒之首［16］。

青蒿Artemisia?caruifolia為菊科Compositae蒿屬Artemisia一年生草本植物，具有清熱、涼血以及解暑等藥用價(jià)值［17］，在我國(guó)各地均有分布，是田間重要雜草，同時(shí)也是多種植物病原病毒的重要中間寄主。麗江市金沙江流域煙草產(chǎn)區(qū)是云南省特色煙草產(chǎn)區(qū)，本研究利用免疫金標(biāo)速測(cè)卡和RTPCR?2種檢測(cè)方法對(duì)云南省麗江市煙草種植區(qū)表現(xiàn)黃化、皺縮以及無(wú)癥的青蒿樣品進(jìn)行病原鑒定，并對(duì)感病青蒿樣品中的TSWV的N基因和TMV的部分基因進(jìn)行了克隆和序列分析，以期為麗江市金沙江流域煙草種植區(qū)內(nèi)病毒病害的防治提供理論基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗(yàn)材料：2022年對(duì)云南省麗江市煙草種植區(qū)進(jìn)行病毒病害調(diào)查時(shí)，采集不同煙區(qū)表現(xiàn)葉片黃化、皺縮以及無(wú)癥狀的青蒿樣品（圖1，表2），新鮮樣品帶回實(shí)驗(yàn)室編號(hào)后立即利用免疫金標(biāo)速測(cè)卡進(jìn)行病毒檢測(cè)并進(jìn)行植物總RNA提取。

1.2?方法

1.2.1?總RNA提取

取約0.1?g青蒿葉片，在液氮中迅速研磨成粉末，按照Trizol總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）說(shuō)明書提取青蒿葉片總RNA。

1.2.2?免疫金標(biāo)速測(cè)卡檢測(cè)

按照煙草花葉病毒（TMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）免疫金標(biāo)速測(cè)卡（上海佑隆生物科技有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行樣品檢測(cè)，具體檢測(cè)原理與檢測(cè)步驟如下：

檢測(cè)原理：煙草花葉病毒（TMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）免疫金標(biāo)速測(cè)卡應(yīng)用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動(dòng)的過(guò)程中與膠體金標(biāo)記的特異性單克隆抗體1結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，繼續(xù)向前方流動(dòng)和NC膜檢測(cè)線上特異性單克隆抗體2結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物。如果樣本中抗原含量大于檢測(cè)限，檢測(cè)線顯紅色，結(jié)果為陽(yáng)性;反之，檢測(cè)線不顯色，結(jié)果為陰性（圖2）。

檢測(cè)步驟：將采集的青蒿葉片按照編號(hào)分別放置于小號(hào)自封袋中并封口，利用研磨器將自封袋中樣本研磨出大量汁液，加入2?mL?磷酸鹽緩沖液（phosphate?buffer?solution?tween，?PBST），繼續(xù)研磨使緩沖液與樣品汁液充分混勻，用移液槍加200?μL待檢樣品混合液至加樣口，加樣后開(kāi)始計(jì)時(shí)，5～8?min后讀取結(jié)果。

1.2.3?RTPCR檢測(cè)

采用一步法對(duì)不同青蒿樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系（20?μL）：20×Enzyme?Mix（Invitrogen公司）1?μL、2×RT?Buffer?Mix?10?μL、RNA?5?μL，加DEPC水定容至20?μL;

反應(yīng)條件：42℃?30?min，95℃?5?min，保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板，分別利用番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒特異性引物TSWVNF/TSWVNR、TMVF/TMVR和TMVCPF/TMVCPR對(duì)青蒿樣品進(jìn)行檢測(cè)（表1）。PCR反應(yīng)體系（50?μL）：10×PCR?反應(yīng)緩沖液（含?Mg2+）?5?μL，2.5?μmol/L

dNTPs?4?μL，20?μmol/L上、下游引物各?1?μL，5?U/μL?Taq?Plus?DNA?聚合酶（上海申能博彩生物

科技有限公司）1?μL、cDNA?2?μL，加DEPC水定容至50?μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2?min;94℃變性45?s，50℃退火45?s，72℃延伸60?s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸10?min。將PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，選擇目標(biāo)條帶切膠，利用Axygen?DNA凝膠回收試劑盒（Axygen公司）進(jìn)行純化回收，將回收產(chǎn)物與pEASYT5?Blunt?zero載體（北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）進(jìn)行連接，通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TransT1中后進(jìn)行涂板，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4?數(shù)據(jù)分析

利用NCBI中BLAST（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.）進(jìn)行基因序列同源性初步比較分析。利用DNAMAN（Lynnon?Biosoft，?Quebec，?Canada）和DNASTAR.?Lasergene.v7.1軟件進(jìn)行開(kāi)放閱讀框的查找;利用DNASTAR.?Lasergene.v?7.1軟件進(jìn)行核苷酸序列比對(duì);利用MEGA?6軟件中的鄰接法（neighborjoining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，自展值設(shè)置為1?000。

2?結(jié)果與分析

2.1?青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒檢測(cè)結(jié)果

2021年7月-2022年7月對(duì)麗江市不同煙區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查，發(fā)現(xiàn)麗江不同煙草種植區(qū)的煙田周邊均有大量青蒿雜草，采集不同煙區(qū)青蒿樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)。通過(guò)煙草花葉病毒（TMV）和番茄斑萎病毒（TSWV）免疫金標(biāo)速測(cè)卡對(duì)所采集的14份青蒿樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示：YN550、YN551、YN693、YN571、YN583、YN682、YN832、YN833和YN839等9個(gè)青蒿樣品TSWV檢測(cè)均呈陽(yáng)性，其中YN693、YN682和YN833等3份青蒿樣品TMV檢測(cè)呈陽(yáng)性，其他樣品病毒檢測(cè)均呈陰性（表2）。分別可以從不同癥狀表現(xiàn)的青蒿樣品中檢測(cè)到TSWV和TMV，如表現(xiàn)黃化、卷曲、皺縮的青蒿葉片樣品YN550，表現(xiàn)黃化、卷曲的青蒿葉片樣品YN551和YN583，僅表現(xiàn)黃化的青蒿葉片樣品YN571，葉片無(wú)癥狀的青蒿樣品YN839均可檢測(cè)出TSWV;葉片表現(xiàn)黃化的青蒿樣品YN693和YN682，葉片無(wú)癥狀的青蒿樣品YN833，均可檢測(cè)出TSWV和TMV;而葉片無(wú)癥狀的青蒿樣品YN786、YN830、YN831、YN989和葉片表現(xiàn)褪綠的青蒿樣品YN797均未檢測(cè)出TSWV和TMV。

根據(jù)免疫金標(biāo)速測(cè)卡檢測(cè)的結(jié)果，對(duì)3個(gè)復(fù)合侵染的青蒿樣品YN693、YN682和YN833的病毒種類進(jìn)行分子鑒定。利用TSWVNF/TSWVNR（N基因序列）引物對(duì)樣品進(jìn)行RTPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：3個(gè)樣品均能擴(kuò)增出777?bp的目的片段，陰性對(duì)照無(wú)條帶，將目的片段進(jìn)行切膠回收、連接轉(zhuǎn)化及測(cè)序，共獲得3條序列，分別命名為YN83351、YN6821和YN6935。利用TMVF/TMVR（RdRp部分序列）引物進(jìn)行擴(kuò)增，僅在YN693和YN833樣品中擴(kuò)增出1?549?bp的目的片段，陰性對(duì)照無(wú)條帶，將目的片段進(jìn)行切膠回收、連接轉(zhuǎn)化及測(cè)序，共獲得2條序列，分別命名為YN6934和YN83393;利用TMVCPF/TMVCPR（cp基因序列）引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果在3個(gè)樣品中均能擴(kuò)增出約500?bp的目的片段，陰性對(duì)照無(wú)條帶，將目的片段進(jìn)行切膠回收、連接轉(zhuǎn)化及測(cè)序，共獲得3條序列，分別命名為YN68210、YN6932和YN8334（表2和表3）。

2.2?青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒分離物的相似性分析

利用TSWVNF/NR對(duì)青蒿樣品進(jìn)行病毒擴(kuò)增，共獲得3條序列分別為YN83351、YN6821和YN6935，3條序列均為完整的TSWV?N基因。通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3條序列均與TSWV的不同分離物相似性較高，故認(rèn)為該3條序均為TSWV的不同分離物，將序列YN83351、YN6821和YN6935在NCBI上進(jìn)行登錄，并獲得了登錄號(hào)（表3），3條序列之間的相似性均高于99.4%，選取TSWVYN83351進(jìn)行下一步分析。將YN83351分離物N基因序列與國(guó)內(nèi)外同屬的其他種或分離物N基因序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：YN83351分離物N基因核苷酸序列與TSWV的各個(gè)分離物的N基因核苷酸序列相似性在98.3%～99.7%之間，與云南省番茄分離物TSWV2（GenBank登錄號(hào)：MK628736.1）的相似性最高，為99.7%;而與正番茄斑萎病毒屬其他種病毒相似性在78.0%以下（表4），故認(rèn)為該分離物為TSWV的一個(gè)分離物，命名為TSWVYN83351。

利用TMVF/R對(duì)青蒿樣品進(jìn)行病毒擴(kuò)增，共獲得2條序列，分別為YN83393和YN6934，2條序列為部分TMV?RNA依賴的RNA復(fù)制酶基因。通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2條序列均與TMV的不同分離物相似性較高，因此它們均為TMV的分離物，將2條序列YN83393和YN6934在NCBI上進(jìn)行登錄，并獲得了登錄號(hào)（表3），2條序列之間的相似性高于99.7%，選取YN83393進(jìn)行下一步分析。將YN83393分離物RdRp基因序列與國(guó)內(nèi)外其他種或分離物RdRp基因序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：YN83393分離物RdRp基因核苷酸序列與TMV各分離物的RdRp基因核苷酸序列相似性在95.5%～99.6%之間，與TMV遼寧分離物Shenyang（GenBank登錄號(hào)：MG516107.1）的核苷酸序列相似性最高，為99.6%;而與煙草花葉病毒屬其他種病毒相似性在81.8%以下（表5），因此，該分離物為TMV的一個(gè)分離物，命名為TMVYN83393。

利用TMVCPF/CPR對(duì)青蒿樣品進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得3條序列分別為YN8334、YN6932和YN68210，3條序列均為完整的TMV?cp基因。通過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)：3條序列均與TMV的不同分離物相似性較高，因此該3條序列均為TMV的分離物，將序列YN8334、YN68210和YN6932在NCBI上進(jìn)行登錄，并獲得了登錄號(hào)（表3），3條序列之間的核苷酸相似性均高于99.2%，選取YN8334進(jìn)行下一步分析。將YN8334分離物cp基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外其他種或分離物cp基因序列進(jìn)行相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：YN8334分離物cp基因核苷酸序列與TMV各分離物的cp基因核苷酸序列相似性在95.4%～99.4%之間，與TMV遼寧分離物Shenyang（GenBank登錄號(hào)：MG516107.1）和云南分離物Yongren1（GenBank登錄號(hào)：HE818457.1）的核苷酸相似性最高，均為99.4%;而與煙草花葉病毒屬其他病毒相似性在74.8%以下（表5），因此，該分離物為TMV的一個(gè)分離物，命名為TMVYN8334。

2.3?青蒿中番茄斑萎病毒和煙草花葉病毒系統(tǒng)進(jìn)化分析

由于YN833、YN682和YN693等3個(gè)樣品中均能擴(kuò)增到TSWV和TMV的特異片段，且所獲核苷酸序列相似性較高，故隨機(jī)選取YN833樣品中獲得的各分離物核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。將TSWVYN83351的N基因與番茄斑萎病毒不同分離物及同屬病毒N基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示：TSWVYN83351青蒿分離物與TSWV各個(gè)分離物聚于一個(gè)大的分支，且與云南和山東TSWV分離物聚于一個(gè)小的分支，說(shuō)明TSWVYN83351青蒿分離物與云南和山東TSWV分離物親緣關(guān)系最近（圖3）。

將TMVYN83393的RdRp部分序列與煙草花葉病毒其他分離物及同屬病毒相同片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示：TMVYN83393青蒿分離物與TMV各分離物聚于一個(gè)大的分支，與TMV云南和遼寧分離物聚于一個(gè)小的分支，說(shuō)明TMVYN83393青蒿分離物與TMV云南和遼寧分離物的親緣關(guān)系最近（圖4）。

將TMVYN8334的cp基因與煙草花葉病毒其他分離物及同屬病毒相同片段構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示：TMVYN8334青蒿分離物與TMV各分離物聚于一個(gè)大的分支，與TMV山東分離物聚于一個(gè)小的分支，說(shuō)明TMVYN8334青蒿分離物與TMV山東分離物的親緣關(guān)系最近（圖5）。

3?結(jié)論與討論

本研究利用免疫金標(biāo)速測(cè)卡和分子檢測(cè)方法，從云南省麗江市煙草種植區(qū)田間雜草青蒿中檢測(cè)出正番茄斑萎病毒屬病毒TSWV和煙草花葉病毒屬病毒TMV，屬于不同屬病毒復(fù)合侵染，此2種病毒為麗江市煙草種植區(qū)內(nèi)造成煙草減產(chǎn)甚至絕產(chǎn)的主要病原，在無(wú)癥狀的田間雜草青蒿中也可檢測(cè)出2種病毒復(fù)合侵染，進(jìn)一步證明田間雜草青蒿為重要中間寄主。

田間雜草是病毒的重要中間寄主，對(duì)病害流行有重要作用。鏟除田間雜草是一項(xiàng)有效的防控措施，能有效地防治TSWV［18］。目前TSWV能侵染1?000多種植物，包括凹頭莧Amaranthus?blitum、馬兜鈴Aristolochia?debilis、勝紅薊Ageratum?conyzoides、蒲公英Taraxacum?mongolicum、歐洲千里光Senecio?vulgaris、水飛薊Silybum?marianum、龍葵Solanum?nigrum、刺蒼耳Xanthium?spinosum等田間雜草，其中菊科植物就有247種，說(shuō)明菊科植物為TSWV的易感寄主［1920］，本研究首次報(bào)道TSWV侵染菊科植物青蒿。TSWV青蒿分離物與云南分離物相似性較高，系統(tǒng)進(jìn)化上也與云南TSWV分離物親緣關(guān)系較近。TMV是世界上發(fā)現(xiàn)和研究最早的病毒，也是第一個(gè)完成完整測(cè)序的植物病毒，可侵染番茄、煙草Nicotiana?tabacum、車前Plantago?asiatica、辣椒、茄子Solanum?melongena、姜Zingiber?officinale、蘭花Cymbidium以及豆類等350多種植物［2122］，但TMV的雜草寄主報(bào)道不多，這也是首次發(fā)現(xiàn)TMV能侵染田間雜草青蒿，TMV青蒿分離物與云南和遼寧TMV分離物相似性較高，在系統(tǒng)進(jìn)化上也是與云南和遼寧TMV分離物親緣性較近。青蒿常生于煙田及周邊區(qū)域，并且青蒿受病毒侵染后會(huì)不表現(xiàn)出癥狀，因此其很可能成為作物病毒病的潛在初侵染源傳播至煙草等農(nóng)作物寄主，造成病害發(fā)生流行，引起煙草等作物病毒病害。

2種病毒復(fù)合侵染往往造成更為嚴(yán)重的危害，例如在非洲，甘薯羽狀斑駁病毒（sweet?potato?feathery?mottle?virus，?SPFMV）和甘薯褪綠矮化病毒（sweet?potato?chlorotic?stunt?virus，?SPCSV）單獨(dú)侵染甘薯時(shí)并不造成危害，但當(dāng)SPFMV和SPCSV復(fù)合侵染時(shí)對(duì)當(dāng)?shù)馗适懋a(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重危害，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2324］。長(zhǎng)期以來(lái)，在病毒的研究上常常關(guān)注的是單一病毒或株系，隨著測(cè)序技術(shù)不斷的革新，發(fā)現(xiàn)2種或2種以上病毒復(fù)合侵染同一寄主植物的現(xiàn)象越來(lái)越多，2種或2種以上病毒之間可能表現(xiàn)協(xié)同作用、拮抗作用或者中性作用。在2種或2種以上病毒感染的寄主植物上常常觀察到病害癥狀更加嚴(yán)重，其中的原因主要是1種或者2種病毒的病毒積累量增加，病毒之間表現(xiàn)出協(xié)同作用［2529］。ChávezCalvillo等在研究木瓜環(huán)斑病毒（papaya?ringspot?virus，PRSV）和木瓜花葉病毒（papaya?mosaic?virus，PapMV）互作時(shí)發(fā)現(xiàn)，在先接種PRSV或PRSV和PapMV一起接種時(shí)，兩種病毒發(fā)生協(xié)同作用;在先接種PapMV后接種PRSV時(shí)，2種病毒發(fā)生拮抗作用，說(shuō)明2種病毒之間的相互作用與病毒感染先后順序有關(guān)［29］。趙麗玲等在雜草凹頭莧中檢測(cè)到中國(guó)勝紅薊黃脈病毒（ageratum?yellow?vein?China?virus，AYVCNV）和云南番茄黃化曲葉病毒（tomato?yellow?leaf?curl?Yunan?virus，TYLCYnV），并通過(guò)重組分析發(fā)現(xiàn)AYVCNV凹頭莧分離物是一個(gè)重組病毒［30］。由此可見(jiàn)，雜草不但作為病毒侵染寄主的初侵染源，還成為病毒進(jìn)化變異的重要場(chǎng)所。前期研究發(fā)現(xiàn)，在雜草中雖然病毒復(fù)合侵染情況較多，病毒種類也較多，但很多雜草寄主感染病毒后表現(xiàn)出的卻是無(wú)癥狀或有輕微癥狀，與該病毒在經(jīng)濟(jì)作物上所表現(xiàn)癥狀并不盡相同［3133］，本文同樣在無(wú)癥狀的青蒿樣品中鑒定出2種病毒，與前人研究結(jié)果相符。雖然在雜草中2種病毒復(fù)合侵染并不會(huì)造成更嚴(yán)重的危害，但當(dāng)雜草中的多種病毒傳播到經(jīng)濟(jì)作物上則可能對(duì)經(jīng)濟(jì)作物造成嚴(yán)重危害，因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)麗江煙草種植區(qū)田間雜草中病毒監(jiān)測(cè)和病原種類鑒定，以期為麗江煙草種植區(qū)煙草病毒病防控提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］?MAES?P，?ALKHOVSKY?S?V，?BAO?Yiming，?et?al.?Taxonomy?of?the?family?Arenaviridae?and?the?order?Bunyavirales：?update?2018?［J］.?Archives?of?Virology，?2018，?163（8）：?22952310.

［2］?KING?A?M?Q，?ADAMS?M?J，?CARSTCNS?E?B，?et?al.?Virus?taxonomy：?ninth?report?of?the?international?committee?on?taxonomy?of?viruses?［M］.?San?Diego：?Elsevier/Academic?Press，?2012：?351373.

［3］?GUPTA?R，?KWON?S?Y，?KIM?S?T.?An?insight?into?the?tomato?spotted?wilt?virus?（TSWV），?tomato?and?thrips?interaction?［J］.?Plant?Biotechnology?Reports，?2018，?12（3）：?157163.

［4］?FERRAND?L，?ALMEIDA?M?M?S，?ORLIO?A?F，?et?al.?Biological?and?molecular?characterization?of?tomato?spotted?wilt?virus?（TSWV）?resistancebreaking?isolates?from?Argentina?［J］.?Plant?Pathology，?2019，?68（9）：?15871601.

［5］?GUNES?N，?GUMUS?M.?Detection?and?characterization?of?tomato?spotted?wilt?virus?and?cucumber?mosaic?virus?on?pepper?growing?areas?in?Antalya?［J］.?Journal?of?Agricultural?Sciences，?2019，?25（3）：?259271.

［6］?ABADKHAH?M，?KOOLIVAND?D，?EINI?O.?A?new?distinct?clade?for?Iranian?tomato?spotted?wilt?virus?isolates?based?on?the?polymerase，?nucleocapsid，?and?nonstructural?genes?［J/OL］.?The?Plant?Pathology?Journal，?2018，?34（6）：?514.?DOI：?10.5423/PPJ.OA.04.2018.0062.

［7］?鄭寬瑜，?吳闊，?董家紅，?等.?番茄斑萎病毒對(duì)云南萵苣類蔬菜的侵染危害［J］.?植物保護(hù)，?2015，?41（5）：?174178.

［8］?毛蓮珍，?趙凱，?鄧明華，?等.?云南省昆明地區(qū)番茄斑萎病毒核衣殼蛋白和運(yùn)動(dòng)蛋白變異分析［J］.?西北植物學(xué)報(bào)，?2019，?39（11）：?19291934.

［9］?劉佳，?陳東亮，?梁玉鐲，?等.?北京辣椒和番茄上番茄斑萎病毒的鑒定［J］.?植物檢疫，?2021，?35（2）：?4448.

［10］張萬(wàn)紅，?馮佳，?KAMRAN?A，?等.?山東煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)番茄斑萎病毒侵染［J］.?中國(guó)煙草科學(xué)，?2020，?41（5）：?8791.

［11］康華軍，?李建設(shè)，?高艷明，?等.?寧夏銀川地區(qū)番茄斑萎病毒和南方番茄病毒復(fù)合侵染分子鑒定［J］.?中國(guó)蔬菜，?2022（4）：?2934.

［12］桂敏，?高雪，?賈志強(qiáng)，?等.?云南辣椒正番茄斑萎病毒屬病毒的分子鑒定［J］.?植物保護(hù)，?2022，?48（4）：?286292.

［13］JUNG?H?W，?YUN?W?S，?HAHM?Y?I，?et?al.?Characterization?of?tobacco?mosaic?virus?isolated?from?potato?showing?yellow?leaf?mosaic?and?stunting?symptoms?in?Korea?［J］.?Plant?Disease，?2002，?86（2）：?112117.

［14］KIM?B?S，?RUHL?G，?CRESWELL?T，?et?al.?Molecular?identification?of?a?tobacco?mosaic?virus?isolate?from?imported?petunias?［J］.?Plant?Health?Progress，?2014，?15（4）：?153154.

［15］YANG?Jinguang，?WANG?Fenglong，?CHEN?Dexin，?et?al.?Development?of?a?onestep?immunocapture?realtime?RTPCR?assay?for?detection?of?tobacco?mosaic?virus?in?soil?［J］.?Sensors，?2012，?12（12）：?1668516694.

［16］SCHOLTHOF?K?B?G，?ADKINS?S，?CZOSNEK?H，?et?al.?Top?10?plant?viruses?in?molecular?plant?pathology?［J］.?Molecular?Plant?Pathology，?2011，?12（9）：?938954.

［17］中國(guó)醫(yī)藥信息查詢平臺(tái)［DB/OL］.?［20221117］.?https：∥www.dayi.org.cn/cmedical/1008545.

［18］MARCHOUX?G，?HOSTACHY?B，?GEBRE?S?K，?et?al.?Tomato?spotted?wilt?virus：?htes?et?méthodes?delutte?［J］.PHMRevue?Horticole，?2000，?418：?4652.

［19］PARRELLA?G，?GOGNALONS?P，?GEBRE?S?K，?et?al.?An?update?of?the?host?range?of?tomato?spotted?wilt?virus?［J］.?Journal?of?Plant?Pathology，?2003，?85（4）：?227264.

［20］MORCA?A?F，?ELIK?A，?COSKAN?S，?et?al.?Population?analysis?on?tomato?spotted?wilt?virus?isolates?inducing?various?symptoms?on?tomato，?pepper，?and?Chenopodium?album?in?Turkey?［J/OL］.?Physiological?and?Molecular?Plant?Pathology，?2022，?118：?101786.?DOI：?10.1016/j.pmpp.2022.101786.

［21］OSHIMA?N，?OHASHI?Y，?UMEKAWA?M.?Studies?on?some?strains?of?tobacco?mosaic?virus?pathogenic?to?crucifer?plants?2.?Host?range?［J］.?Japanese?Journal?of?Phytopathology，?1974，?40（3）：?243251.

［22］ALISHIRI?A，?RAKHSHANDEHROO?F，?ZAMANIZADEH?H?R，?et?al.?Prevalence?of?tobacco?mosaic?virus?in?Iran?and?evolutionary?analyses?of?the?coat?protein?gene?［J］.?Plant?Pathology?Journal，?2013，?29（3）：?260273.

［23］SCHAEFERS?G?A，?TERRY?E?R.?Insect?transmission?of?sweet?potato?disease?agents?in?Nigeria?［J］.?Phytopathology，?1976，?66（5）：?642645.

［24］KARYEIJA?R?F，?KREUZE?J?F，?GIBSON?R?W，?et?al.?Synergistic?interactions?of?a?potyvirus?and?a?phloemlimited?crinivirus?in?sweet?potato?plants?［J］.?Virology，?2000，?269（1）：?2636.

［25］SYLLER?J.?Facilitative?and?antagonistic?interactions?between?plant?viruses?in?mixed?infections?［J］.?Molecular?Plant?Pathology，?2012，?13（2）：?204216.

［26］UNTIVEROS?M，?FUENTES?S，?SALAZAR?L?F.?Synergistic?interaction?of?sweet?potato?chlorotic?stunt?virus?（Crinivirus）?with?carla，?cucumo，?ipomo，?and?potyviruses?infecting?sweet?potato?［J］.?Plant?Disease，?2007，?91（6）：?669676.

［27］MASCIA?T，?GALLITELLI?D.?Synergies?and?antagonisms?in?virus?interactions?［J］.?Plant?Science，?2016，?252：?176192.

［28］TATINENI?S，?ALEXANDER?J，?GUPTA?A?K，?et?al.?Asymmetry?in?synergistic?interaction?between?wheat?streak?mosaic?virus?and?triticum?mosaic?virus?in?wheat?［J］.?Molecular?PlantMicrobe?Interactions，?2019，?32（3）：?336350.

［29］CHAVEZCALVILLO?G，?CONTRERAS?P?C?A，?MORA?M?J，?et?al.?Antagonism?or?synergism?between?papaya?ringspot?virus?and?papaya?mosaic?virus?in?Carica?papaya?is?determined?by?their?order?of?infection?［J］.?Virology，?2016，?489（9）：?179191.

［30］趙麗玲，?鐘靜，?尹躍艷，?等.?云南凹頭莧上分離到的2種菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組結(jié)構(gòu)特征［J］.?植物病理學(xué)報(bào)，?2017，?47（6）：?738746.

［31］SAMPANGI?R?K，?MOHAN?S?K，?PAPPU?H?R.?Identification?of?new?alternative?weed?hosts?for?iris?yellow?spot?virus?in?the?Pacific?Northwest?［J］.?Plant?Disease，?2007，?91（12）：?1683.

［32］PAPAYIANNIS?L?C，?KATIS?N?I，?IDRIS?A?M，?et?al.?Identification?of?weed?hosts?of?tomato?yellow?leaf?curl?virus?in?Cyprus?［J］.?Plant?disease，?2011，?95（2）：?120125.

［33］HOSSEINI?S?A，?SALARI?K.?Detection?and?molecular?characterisation?of?potato?virus?S?of?weed?reservoirs?in?Iran?［J］.?Archives?of?Phytopathology?and?Plant?Protection，?2017，?50（15/16）：?828838.

（責(zé)任編輯：田?喆）