雙峰駝感染魏氏梭菌與溶血性曼氏桿菌的防治

張學(xué)虎，宋福超，蘭 喜，張 勇

（1.張掖市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，張掖 734000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

魏氏梭菌（Clostridium welchii）又稱產(chǎn)氣莢膜桿菌，可在一定條件下感染牛、綿羊、山羊、豬等多種家畜，引發(fā)腸毒血癥和壞死性腸炎［1］，臨床上常呈現(xiàn)發(fā)病較快、病程較短、死亡率高等特點(diǎn)［2］。溶血性曼氏桿菌（Mannheimia hoemolytic）舊名為溶血性巴氏桿菌，是引起牛、綿羊等反芻動(dòng)物發(fā)生肺炎及急性敗血癥的重要病原［1］，常與支原體、巴氏桿菌等病原共同感染而引發(fā)犢牛、綿羊的支氣管肺炎，或羔羊的急性敗血癥，嚴(yán)重時(shí)可引起動(dòng)物死亡，死亡率較高，在牛呼吸道綜合征中占30.5%［3］。

近年來，隨著國(guó)內(nèi)畜禽市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的日益繁榮和規(guī)模養(yǎng)殖的快速發(fā)展，該類病在消化系統(tǒng)類疾病和呼吸道類疾病中變得常見和多發(fā)，給養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重威脅。2017 年，甘肅酒泉地區(qū)報(bào)道了駱駝感染魏氏梭菌的病例［4］，但尚未見有駱駝感染曼氏桿菌的報(bào)道。本文以2022 年發(fā)生在甘肅省張掖市某養(yǎng)駝場(chǎng)的一起雙峰駝感染魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌為例，歸納整理了其發(fā)病過程、病原診斷及綜合防控等內(nèi)容，旨在為養(yǎng)駝同行及畜牧獸醫(yī)工作者提供參考。

1 發(fā)病情況

2022 年5—7 月份，甘肅省張掖市某養(yǎng)駝場(chǎng)，陸續(xù)出現(xiàn)駝羔死亡的病例。經(jīng)調(diào)查，該養(yǎng)駝場(chǎng)以駝羔繁育及駝奶生產(chǎn)為主，存欄雙峰駝440 峰，其中成年駝310峰，駝羔130 峰。發(fā)病及死亡病例均為2～3 月齡駝羔，先后死亡駝羔7 峰，其中5 月27 日、5 月28 日及6 月13日各死亡2 峰，7 月5 日死亡1 峰。發(fā)病及死亡病例以消化道和呼吸道癥狀為主，多表現(xiàn)為突然發(fā)病，8～10 h后死亡。

2 臨床癥狀及剖檢觀察

發(fā)病初期駝羔行走步態(tài)呈搖擺狀，后期臥地不起，多表現(xiàn)為精神不振、食欲減退，同時(shí)伴有干咳和腹瀉癥狀；病死時(shí)多表現(xiàn)為“醉酒”狀態(tài)。剖檢顯示，胃腸道及肺臟組織病變較為明顯，其中，皺胃有明顯潰瘍、胃黏膜脫落（圖1A），小腸有明顯的臌氣，腸壁菲薄且有出血（圖1B），腸系膜淋巴結(jié)有腫大可見（圖1C）；肺臟呈“大理石樣”病變（圖1D），剖面有膿性出血（圖1E）。胸腔及腹腔有少量積液可見，肝臟有輕微淤血，腎臟軟化且被膜易剝離（圖1F），剖面有輕微出血；心臟及脾臟未見明顯病變。

圖1 病死駝羔內(nèi)臟剖檢病變觀察

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 血常規(guī)檢測(cè)

采集癥狀明顯駝羔的血液，使用動(dòng)物生化分析儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，除血小板數(shù)量降低、中性粒細(xì)胞百分比升高、淋巴細(xì)胞百分比下降及白細(xì)胞總數(shù)略微升高外，其余指標(biāo)均表現(xiàn)基本正常。初步懷疑為細(xì)菌性病原感染。

表1 發(fā)病駝羔血常規(guī)檢查結(jié)果

3.2 可疑菌染色鏡檢

將無菌采集的鼻拭子、內(nèi)臟組織及腸內(nèi)容物在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行預(yù)處理，使用劉心等［6］和楊志剛等［7］報(bào)道的方法進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。將預(yù)處理后的病料分別涂抹于普通瓊脂平板和血瓊脂平板（購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司），分別置于有氧和厭氧條件下37 ℃培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，厭氧條件下血瓊脂平板上的菌落生長(zhǎng)良好，可見半透明、表面光滑、中間凸起的菌落，且有溶血環(huán)；在有氧條件下，在兩種平板上均有菌落生長(zhǎng)，多數(shù)為表面光滑的露珠狀菌落。挑取生長(zhǎng)良好的菌落涂片，分別進(jìn)行瑞氏染色、革蘭染色。鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，瑞氏染色后可見藍(lán)紫色球桿菌，革蘭染色后可見部分藍(lán)紫色粗大短桿菌，無芽孢。

3.3 病原核酸檢測(cè)

挑取3.2中的可疑菌斑，接種于液體培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，收集菌體使用核酸提取試劑盒（購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司）提取全基因組DNA，以16S RNA為目的基因，參照石遠(yuǎn)菊等［8］和王晨驍?shù)龋?］報(bào)道的檢測(cè)方法，進(jìn)行疑似病原的核酸檢測(cè)。結(jié)果顯示，鼻拭子和肺組織中所分離的細(xì)菌，溶血性曼氏桿菌核酸呈陽性；腸內(nèi)容物及淋巴結(jié)樣品中所分離的細(xì)菌，魏氏梭菌呈核酸陽性。

3.4 動(dòng)物試驗(yàn)

為確定毒素對(duì)本次發(fā)病是否有致死作用，收集腸內(nèi)容物進(jìn)行毒素檢查。選擇4 只健康小鼠隨機(jī)分為2組。取所采集的腸內(nèi)容物5 mL，加等量的滅菌生理鹽水稀釋，4 000 r/min 離心15 min，在無菌條件下取上清液分為A、B 兩個(gè)組份；A 組份置于60℃條件下處理30 min，B 組份不做處理；后分別取A、B 組份各0.2 mL靜脈注射于小鼠體內(nèi)，A 組份和B 組份各注射2 只小鼠，觀察記錄小鼠健康狀況。結(jié)果顯示，注射A組份的小鼠一直存活，而注射B組份的小鼠在8 h左右時(shí)開始死亡。

4 診斷結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀及內(nèi)臟剖檢病理變化，初步確定為呼吸系統(tǒng)及消化系統(tǒng)相關(guān)病原感染；經(jīng)血常規(guī)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)為細(xì)菌性病原感染；進(jìn)一步使用細(xì)菌培養(yǎng)及染色鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌同時(shí)存在；最后使用PCR 法進(jìn)行可疑病原基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有魏氏梭菌及溶血性曼氏桿菌目標(biāo)條帶；結(jié)合毒素試驗(yàn)進(jìn)一步確定了本次發(fā)病與魏氏梭菌的關(guān)聯(lián)性。最終診斷本次發(fā)病是由感染了魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌所引起的。

5 防治措施

臨床檢查及解剖病理觀察后，立即指導(dǎo)場(chǎng)主按照“控制傳染源、切斷傳播途徑、保護(hù)易感畜”的原則，采取了病健分離、消毒滅源、緊急免疫和增強(qiáng)抵抗力等綜合性防控措施。

5.1 隔離治療

立即將有癥狀駝羔轉(zhuǎn)移至隔離圈舍，參考已報(bào)道的治療方法［6，8］和陳萌等［9-10］報(bào)道的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇針對(duì)性藥物進(jìn)行緊急治療。其中對(duì)于呼吸道癥狀明顯的駝羔，使用硫酸頭孢喹污粉劑（10 mg/kg體重）及氟尼辛甲胺（2 mL/100 kg 體重）進(jìn)行肌肉注射，連續(xù)給藥3～5 d；對(duì)于有呼吸道癥狀并伴有腹瀉的駝羔，在上述給藥的基礎(chǔ)上，肌肉注射硫酸阿米卡星（2 mL/100 kg體重），并口服諾氟沙星（6～8 粒/峰），每日1 次，連續(xù)3～5 d。

5.2 緊急免疫

對(duì)隔離的健康駝群，采取緊急免疫和增強(qiáng)抵抗力等措施。一方面，使用羊三聯(lián)四防滅活苗（購(gòu)自山東綠都生物科技有限公司）及牛曼氏桿菌病滅活疫苗（購(gòu)自北京生泰爾科技股份有限公司）進(jìn)行免疫接種，其中，羊三聯(lián)四防滅活苗每峰接種8 mL（駝羔減半）；牛曼氏桿菌疫苗每峰4 mL（駝羔減半）。為確保安全，在免疫前先選擇2～3 峰成年雙峰駝進(jìn)行小范圍免疫試驗(yàn)，待觀察24 h 無免疫副反應(yīng)后再進(jìn)行全群免疫。另一方面，使用雙黃連等清熱解毒類中藥制劑，通過精料拌服或飲水給藥，進(jìn)一步提高駝群抵抗力，以防被傳染。同時(shí)，在飼料中添加適量微生態(tài)制劑，用來調(diào)節(jié)胃腸道菌群，以促進(jìn)反芻和增加采食，進(jìn)一步增強(qiáng)消化及吸收功能。

5.3 無害化處理和消毒滅源

及時(shí)將病死駝羔尸體、不潔墊料、污染飼料及舍內(nèi)糞便，采取焚燒或深埋等方法進(jìn)行無害化處理，避免病原擴(kuò)散。同時(shí)，為徹底殺滅養(yǎng)殖環(huán)境中的病原，鞏固防治效果，避免二次感染，參考韓小麗等［11］和王麗娟［12］報(bào)道的方法，對(duì)圈舍、外環(huán)境及食槽水槽等進(jìn)行徹底消毒。其中，隔離駝舍使用0.3%的過氧乙酸溶液或用聚維酮碘配成3%的碘溶液進(jìn)行消毒；健康駝舍及外環(huán)境使用0.05%的次氯酸鈉及20%漂白粉溶液進(jìn)行交替消毒；水槽、食槽及飼喂器具等使用20%漂白粉溶液進(jìn)行消毒；每日1次，連續(xù)消毒1周。

6 討論

駱駝是戈壁、沙漠等荒漠地區(qū)的主要畜種，它既是荒漠地帶的主要運(yùn)輸工具，也是當(dāng)?shù)赜文撩褡宓闹饕淘春腿庠?，其乳因富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分而被美稱為“沙漠白金”［13］。近年來，隨著人們對(duì)駝乳及其他駝制品需求的增加，加之荒漠旅游的逐步發(fā)展，舍飼養(yǎng)駝的比例也在逐步上升。受此影響，駱駝所感染的疫病也呈現(xiàn)為復(fù)雜性和多發(fā)性，給養(yǎng)駝業(yè)帶來了一定的威脅。據(jù)國(guó)內(nèi)現(xiàn)有報(bào)道，駱駝所感染的重大疫病及人畜共患病主要有口蹄疫、布魯氏菌病、結(jié)核病、炭疽［14］及魏氏梭菌?。?］。此外，長(zhǎng)期以來駱駝采取自由放牧方式，因而體外常寄生蜱蟲、原蟲等［15-16］，這些寄生蟲群體龐大、繁殖力強(qiáng)、宿主譜廣、攜帶病原復(fù)雜，進(jìn)一步增加了駱駝感染疫病的風(fēng)險(xiǎn)。

6.1 疫病流行情況

魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌作為一類條件致病菌，常共棲于健康動(dòng)物體內(nèi)，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體受到外源感染或氣候、運(yùn)輸、飼喂等環(huán)境改變致使機(jī)體抵抗力下降時(shí)，它們常會(huì)迅速繁殖而破壞體內(nèi)正常菌群而使機(jī)體發(fā)病。根據(jù)國(guó)內(nèi)現(xiàn)有研究報(bào)道，魏氏梭菌感染牛、羊等家畜的病例較為常見。近年來，也有報(bào)道其感染東北虎［17］、小熊貓［18］及赤猴［7］等野生動(dòng)物的病例，但關(guān)于雙峰駝感染魏氏梭菌的病例卻很少見。另外，近幾年河南省、新疆地區(qū)、西藏地區(qū)報(bào)道了牛、羊感染溶血性曼氏桿菌的病例。2021 年，甘肅省肅南沿山地區(qū)出現(xiàn)了牦牛感染溶血性曼氏桿菌的病例［19］，但目前尚未見有雙峰駝等荒漠類牲畜同時(shí)感染魏氏梭菌病和溶血性曼氏桿菌病的報(bào)道。在本病例中，首次確診了雙峰駝感染魏氏梭菌及溶血性曼氏桿菌，這提示該類病原在本地區(qū)的流行和發(fā)生呈復(fù)雜性和多樣性的趨勢(shì)，但對(duì)于其流行的主要血清型，有待于通過深入研究來確定。

6.2 病因分析

魏氏梭菌在自然界中分布廣泛。研究表明，氣溫驟變、飼養(yǎng)管理差或更換飼料等均可誘發(fā)魏氏梭菌病，污染的糞便是其主要的傳染源［12］。對(duì)于溶血性曼氏桿菌病而言，運(yùn)輸應(yīng)激、飼養(yǎng)管理差、氣候變化或外源感染等是其發(fā)病的主要誘因［11］。在本病例中，發(fā)病死亡駝羔以呼吸道和消化道癥狀為主。經(jīng)詢問場(chǎng)主，該場(chǎng)周邊50 km 范圍內(nèi)無其他養(yǎng)殖場(chǎng)，且養(yǎng)殖場(chǎng)周邊草場(chǎng)無放牧牲畜；場(chǎng)內(nèi)近一年內(nèi)無雙峰駝?wù){(diào)入，且駝羔均為本場(chǎng)母駝所產(chǎn)；故排除外源傳染及長(zhǎng)途運(yùn)輸而發(fā)病的可能性。經(jīng)與飼養(yǎng)員交談得知，曾在駝羔2 月齡以后，開始補(bǔ)飼以玉米為主的精料；現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，駝舍內(nèi)飲水槽為廢舊鐵皮桶改造而來，且槽中飲水多日未更換，水槽衛(wèi)生較差。經(jīng)后續(xù)詢問得知，該養(yǎng)駝場(chǎng)由養(yǎng)羊場(chǎng)改造而來，場(chǎng)內(nèi)設(shè)施及飼喂工具均沿用養(yǎng)羊場(chǎng)的，整體表現(xiàn)為舍內(nèi)陰冷、通風(fēng)不良及過于潮濕。綜合分析，引起本次發(fā)病的主觀原因是給幼駝補(bǔ)飼精料過早，加之飲水不潔，而使駝羔消化不良而發(fā)??；潛在原因是因消毒滅源不徹底，養(yǎng)殖環(huán)境中可能存在前羊場(chǎng)遺留的病原或芽孢；客觀原因是養(yǎng)殖環(huán)境差、飼養(yǎng)管理粗放。但是否是由于感染了魏氏梭菌而繼發(fā)產(chǎn)生了曼氏桿菌病，尚有待于通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)來確定。

6.3 病原診斷

快速而準(zhǔn)確地找出病原，是臨床上實(shí)施針對(duì)性防治的前提。家畜血液中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等白細(xì)胞，對(duì)外來細(xì)菌具有吞噬、分解作用［20］，在機(jī)體的特異性免疫和非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用［21］。因此，可依據(jù)白細(xì)胞等血液生化指標(biāo)的變化，對(duì)機(jī)體感染微生物的情況進(jìn)行初步判斷。在本病例中，駝羔血液中的中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞百分比在發(fā)病初期表現(xiàn)為升高，發(fā)病后期有呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，這可能與溶血性慢性桿菌可特異性溶解反芻動(dòng)物的白細(xì)胞和血小板有關(guān)［1］。病原菌的分離培養(yǎng)是確診病原的常用方法，通過對(duì)培養(yǎng)后的可疑菌進(jìn)行菌落觀察和菌體染色觀察，可進(jìn)一步縮小病原菌的范圍。在本病例中革蘭陽性菌和革蘭陰性菌同時(shí)存在。為盡快確定病原，筆者使用普通PCR 檢測(cè)方法對(duì)可疑菌進(jìn)行了16S RNA 核酸檢測(cè)，將病原鎖定為魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌。但也有研究報(bào)道，非魏氏梭菌致死的家畜也容易在死后被魏氏梭菌侵染［1，2，22］。因此，檢出本菌也并不能說明它就是病原［1，22］。隨后，筆者通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行了腸內(nèi)容物毒素檢查，進(jìn)一步驗(yàn)證了毒素與本次駝羔死亡的關(guān)聯(lián)性。但對(duì)于所感染魏氏梭菌的型別和毒素的類別，由于試驗(yàn)條件有限，未進(jìn)行深入的毒素中和保護(hù)試驗(yàn)。

6.4 綜合防治

魏氏梭菌和溶血性曼氏桿菌病都具有超急性、病程短、死亡率高等特點(diǎn)［23-24］，犢牛、羔羊等幼畜是主要發(fā)病群體。目前，由魏氏梭菌引起的腸毒血癥，和由溶血性曼氏桿菌引起的肺炎及急性敗血癥，已呈全球性分布［25-26］。由于這類病發(fā)病急、死亡快，發(fā)病后常來不及治療，因此，“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、防重于治”仍是當(dāng)前控制該類病的主要措施。研究表明，該類病原作為一類條件治病菌，易受飼養(yǎng)環(huán)境差或氣候因素變化而發(fā)病，因此，提供良好的飼養(yǎng)環(huán)境并根據(jù)病原的流行特點(diǎn)及時(shí)進(jìn)行疫苗接種，對(duì)于預(yù)防該類病具有重要意義。在本病例中，由于場(chǎng)區(qū)環(huán)境差、飲水不潔，加之補(bǔ)飼精料過早而導(dǎo)致發(fā)病。發(fā)病后，立即組織實(shí)施了“病健分離、緊急免疫、消毒滅源、改善環(huán)境”等綜合防治措施，在第一時(shí)間內(nèi)無害化處理了病死駝羔及其污染物；并使用不同消毒劑對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境及飼喂工具進(jìn)行了更替消毒；更換為精料補(bǔ)充料進(jìn)行飼喂，同時(shí)將飲水槽更換為橡膠材質(zhì)的或陶瓷材質(zhì)的，定期清潔水槽做到飲水干凈衛(wèi)生；最后，對(duì)健康駝群接種疫苗進(jìn)行緊急免疫，逐步控制了病情。

7 結(jié)論

經(jīng)過現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢查及剖檢觀察，同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，確定了本次發(fā)病是由于感染了魏氏梭菌及溶血性曼氏桿菌引起的；發(fā)病誘因與飼養(yǎng)管理不當(dāng)存在很大的關(guān)聯(lián)性。通過實(shí)施病健分離、隔離治療、緊急免疫及消毒滅源等綜合性防治措施后，該養(yǎng)駝場(chǎng)駱駝的病情逐步得到控制并恢復(fù)了生產(chǎn)。