SNP芯片評估歐拉藏羊群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

王志武，孫銳鋒，趙 鵬，郭宏宇，王 婷

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，太原 030032）

歐拉藏羊產(chǎn)于四川、青海、甘肅三省交界處，是青藏高原特有的品種，以放牧為主，具有較強的抗逆性。歐拉藏羊體格高，體重大，肉質(zhì)性能好，對高寒草原的低氣壓、嚴(yán)寒、潮濕等自然條件和四季放牧、常年露營的放牧管理方式能夠很好地適應(yīng)。歐拉藏羊頭稍長，呈銳三角形，鼻梁隆起，公母羊大多數(shù)都有角，角形呈微螺旋狀向左右平伸或略向前，尖端向外。四肢高而端正，腰背寬平，胸、臀部發(fā)育良好，尾呈扁錐形，尾長13～20 cm，公羊前胸多著生粗硬的黃褐色“胸毛”。歐拉藏羊生長發(fā)育快，育肥性能較好，屠宰率和凈肉率高，肉質(zhì)好，膻味輕，能量、蛋白質(zhì)含量高，脂肪和膽固醇含量低［1］。6 月齡歐拉藏羊公羔體重在35 kg 以上，母羔體重在31 kg 以上；1.5 歲公羊體重在55 kg 以上，母羊體重在42 kg以上。繁殖率為100%。歐拉藏羊具有較好的產(chǎn)肉性能和抗病能力，是肉羊雜交組合中較好的父本品種，在生產(chǎn)實踐中值得應(yīng)用和推廣。

為了解決山西省飼養(yǎng)肉羊生產(chǎn)性能低、核心競爭力弱的問題，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)團隊根據(jù)國內(nèi)外羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢和山西省自然生態(tài)條件，通過查閱資料和實地調(diào)研，選擇產(chǎn)于甘肅瑪曲縣的采食能力強、肉質(zhì)好、適應(yīng)性強的肉用綿羊品種——歐拉藏羊（被稱藏羊之王），與山西省大量養(yǎng)殖的小尾寒羊進行二元雜交，生產(chǎn)出繁殖率高、適應(yīng)性強、尾巴小的雜交二代。為了評估引進歐拉藏羊的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，本研究利用SNP 芯片技術(shù)檢測了從甘肅省瑪曲縣引進的45 只歐拉藏羊群體的遺傳多樣性、親緣關(guān)系及家系結(jié)構(gòu)，為充分利用歐拉藏羊遺傳資源，建立適應(yīng)山西省飼養(yǎng)的肉羊雜交模式，培育生長發(fā)育快、繁殖率高、適應(yīng)性強的肉羊新品系奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗中歐拉藏羊來源于甘肅省瑪曲縣歐拉鄉(xiāng)畜合隆國家級農(nóng)牧民專業(yè)合作社。在同等飼養(yǎng)條件下，共選擇1 歲左右的種羊45 只，其中20 只公羊、25 只母羊，采集靜脈血液于EDTA抗凝管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 歐拉藏羊DNA提取和檢測

在北京康普森生物技術(shù)有限公司采用磁珠法進行DNA 的提取，使用康為世紀(jì)的CWE9600 Magbead Blood DNA Kit 試劑盒，基于硅基磁珠特異性吸附DNA的原理，用酶解法釋放血液基因組，在特定高效裂解緩沖體系中結(jié)合DNA 分子，改變環(huán)境離子強度，從而實現(xiàn)基因組DNA 分離純化。在2.0 mL 的裂解管中加入適量的血液樣本，并加入ProteinaseK 和BufferWL，放入渦旋混勻振蕩器振蕩30 s，56℃恒溫水浴鍋裂解40 min，每隔20 min 振蕩1 次，裂解完成后放入離心機進行瞬時離心，加入Lysate、BufferKL、MagbeadsPN 溶液，將SpintipsPack（磁棒套）插入96DW 深孔板中，運行DNA提取程序，進行g(shù)DNA 提取。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，判定DNA是否有降解。

1.3 歐拉藏羊DNA基因組分型

在北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司采用Infinium TM Ovine SNP50K Genotyping Array V3 芯片進行歐拉藏羊DNA基因組的測序和分型。

1.4 SNP芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控

為了保證分析的準(zhǔn)確性，首先使用Plink（V1.90）軟件檢查重復(fù)樣本，重復(fù)樣本判定標(biāo)準(zhǔn)如下：當(dāng)樣本間DST≥0.99 時，判斷為重復(fù)樣本。DST 為兩個個體在基因組水平上體現(xiàn)同態(tài)的概率。本次分析未發(fā)現(xiàn)重復(fù)樣本。其次對樣本的檢出率進行質(zhì)控，其質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)與李隱俠等［2］報道一致。本次分析未發(fā)現(xiàn)檢出率低于90%的樣本，質(zhì)控后剩余20 只公羊和25 只母羊進行后續(xù)分析。

1.5 歐拉藏羊群體的PCA分析

利用Plink（V1.90）進行PCA分析［3］，從聚類情況圖可以了解藏羊群體的遺傳結(jié)構(gòu)。個體羊的遺傳關(guān)系越近，在PCA 圖上顯示的直線距離就越近；反之，個體羊的遺傳關(guān)系越遠(yuǎn)，顯示的直線距離就越遠(yuǎn)。公羊樣本用較大的紅色圓點標(biāo)注出來。

1.6 歐拉藏羊群體的近交系數(shù)分析

通過計算歐拉藏羊群體基因組上的純合片段長度來進行近交系數(shù)分析，一般純合片段長度越長，表明群體家系內(nèi)可能存在近交，純合片段長度越短，表明家系內(nèi)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，近交的可能性就越小。

1.7 歐拉藏羊群體遺傳距離與親緣關(guān)系分析

歐拉藏羊群體的遺傳距離和親緣關(guān)系分析與李隱俠等［2］報道的方法相同。本試驗使用GCTA（V1.94）軟件，計算個體間的親緣關(guān)系系數(shù)。

1.8 歐拉藏羊群體的聚類分析

主要使用對接法和參考遺傳距離矩陣對個體進行聚類分析，聚合為關(guān)系密切的和關(guān)系相對疏遠(yuǎn)的2 個分類單元，最后把分類后的個體組成系譜圖，就能看到歐拉藏羊個體間的親疏關(guān)系［3］。

1.9 歐拉藏羊群體的家系構(gòu)建分析

采用MegaX（V10.0）軟件對質(zhì)控后的SNP 位點進行分析，采用鄰接法構(gòu)建群體進化樹，分析歐拉藏羊群體的種公羊家系結(jié)構(gòu)，計算種公羊在不同家系中的分布［4］。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐拉藏羊DNA提取

歐拉藏羊群體的DNA 樣品提取后，經(jīng)檢測可知平均濃度≥50 ng/μL。同時經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，發(fā)現(xiàn)其基因組DNA 條帶清晰，滿足芯片檢測要求，符合后期的試驗研究條件。

2.2 基因組DNA的基因分型和質(zhì)控檢測

基因組DNA 的SNA 基因分型和質(zhì)控檢測結(jié)果表明（表1 和圖1），歐拉藏羊群體的標(biāo)記總數(shù)為64 734個，說明歐拉藏羊的SNP位點分析可以用50K 芯片；質(zhì)控后標(biāo)記總數(shù)變?yōu)?7 066個，其中最多的6 170個位點分布在1 號染色體上，最少的830 個位點分布在24 號染色體上。

圖1 質(zhì)控前后的SNP在各染色體上的分布

表1 SNP質(zhì)量控制結(jié)果

2.3 歐拉藏羊群體的PCA分析

利用Plink（V1.90）進行成分分析，以圖的形式展示個體的聚類情況，公羊樣本用較大的紅色圓點標(biāo)注出來。從圖2 可知，25 只母羊與15 只公羊的直線距離較遠(yuǎn)，個體間遺傳關(guān)系也較遠(yuǎn)；25只母羊與5只公羊的直線距離較近，個體的遺傳關(guān)系也較近。20 只公羊可以分為5 個聚類。其中8 只公羊的遺傳關(guān)系較近，為1個聚類；5 只公羊的遺傳關(guān)系較近，為1 個聚類；3 只公羊的遺傳關(guān)系較近，為1 個聚類；2 只公羊的遺傳關(guān)系較近，為1個聚類；另外2只公羊的遺傳關(guān)系也較近，為1個聚類。

圖2 PCA可視化結(jié)果

2.4 歐拉藏羊群體的近交系數(shù)分析

個體中ROH 片段的總長度占常染色體基因組總長的比例為ROH 的近交系數(shù)。個體中ROH 的總長越長或數(shù)量越多，該個體的近交系數(shù)就越高。從歐拉藏羊群體基于ROH 的近交系數(shù)FROH的分布圖3 可知，近交系數(shù)在0～0.05 之間的個體數(shù)目較多，且群體的平均近交系數(shù)值為0.034，說明群體的近交程度較低。

圖3 基于ROH的近交系數(shù)FROH的分布

2.5 歐拉藏羊群體親緣關(guān)系分析

2.5.1 基于G矩陣的親緣關(guān)系分析

使用全基因組標(biāo)記構(gòu)建的基因組關(guān)系矩陣能更真實地反映個體間的親緣關(guān)系，它比單純根據(jù)系譜信息計算的親緣關(guān)系更加準(zhǔn)確，且更接近實際情況。基因組親緣關(guān)系分析可視化結(jié)果圖能夠展示兩兩個體間基因的血緣關(guān)系，顏色越接近紫色表示親緣關(guān)系越近。從歐拉藏羊群體親緣關(guān)系圖4 可以看出，歐拉藏羊群體的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

圖4 基因組親緣關(guān)系分析可視化結(jié)果

2.5.2 遺傳距離分析

從圖5 可知，45 只歐拉藏羊之間的IBS 遺傳距離在0.211 1～0.309 7之間，平均遺傳距離為0.278 9；20只公羊間的遺傳距離在0.211 1～0.307 5 之間，平均遺傳距離0.261 6。說明歐拉藏羊群體的遺傳距離較遠(yuǎn)，近交風(fēng)險較低。

圖5 遺傳距離分析可視化結(jié)果

2.6 聚類分析

通過對歐拉藏羊個體進行系譜圖分析，可知歐拉藏羊群體共有8 個家系。歐拉藏羊群體公羊樣本聚類分析結(jié)果見圖6。

圖6 公羊樣本聚類分析結(jié)果

2.7 家系構(gòu)建分析

由圖7 可知，歐拉藏羊種公羊可以劃分為8 個家系，家系1 包含9 只公羊，家系2 包含2 只公羊，家系7包含4只公羊，其余家系均為1只公羊。根據(jù)現(xiàn)有母羊與公羊之間的親緣關(guān)系劃分為8 個不同家系，其中25只母羊與公羊的血緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，分類為其他，育種時可以作為參考。

圖7 所有公母羊樣本聚類分析結(jié)果

3 討論

在育種工作中，遺傳距離可以表示不同種群或個體間的基因差異程度，具有指導(dǎo)親本選育的重要作用。本試驗通過對歐拉藏羊之間的IBS 遺傳距離的分析，揭示了個體間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，歐拉藏羊群體的遺傳距離在0.211 1～0.309 7 之間，平均遺傳距離為0.278 9；20 只公羊間的遺傳距離在0.211 1～0.307 5 之間，平均遺傳距離為0.261 6。說明歐拉藏羊種公羊和母羊之間具有適中的遺傳距離［5-6］。根據(jù)親緣關(guān)系小于0.1的標(biāo)準(zhǔn)，將種公羊劃分為8個家系，其中有5個家系分別只有1 只公羊，需要進行擴繁選育，維持血統(tǒng)的完整。25 只母羊與所有公羊的親緣關(guān)系系數(shù)均小于0.1，可與任何1只公羊進行配種。

群體的近交系數(shù)是表示動物群體近交程度的一個指數(shù)。從本試驗可知，歐拉藏羊群體的平均近交系數(shù)為0.034，近交程度較低。因此，為降低群體的近交增量，避免歐拉藏羊生產(chǎn)性能的下降，建議在同一家系內(nèi)公母羊盡量不要互相配種，參考?xì)W拉藏羊的家系構(gòu)建和親緣關(guān)系分析結(jié)果，確認(rèn)親緣系數(shù)后，進行合理的配種。在生產(chǎn)管理中要做好配種記錄，完善系譜檔案，避免因配種計劃的錯誤而導(dǎo)致近親交配，同時加強對歐拉藏羊的選育提高，進一步保障藏羊群體的遺傳多樣性，從而提高其品種資源利用率。

4 結(jié)論

本試驗利用SNP 50K 芯片對歐拉藏羊群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進行了分析，發(fā)現(xiàn)歐拉藏羊群體的遺傳多樣性較豐富，群體內(nèi)近交程度較低，共有8 個家系，其中有5 個家系種公羊數(shù)量少。需要加強后代的選育和擴繁，防止血統(tǒng)流失，從而提高歐拉藏羊品種資源的有效利用。