黃 晨,李春陽,臧榮鑫,楊具田,石笑迪,高田莉,蔡 元
(西北民族大學,蘭州 730030)
純種的杜泊綿羊可常年發(fā)情配種,有較好的繁殖性能,但是從國外引進的純種數(shù)量不多,必須依靠人工授精技術來雜交改良本地綿羊。雜交改良技術常用于國家之間引進優(yōu)良種質資源進行新品種培育,但是對原有優(yōu)質種質資源保存最直接的方法就是對精液進行保存。精液保存主要有常溫、低溫和超低溫冷凍保存3 種,冷凍保存是最直接有效的方法。綿羊精子對低溫非常敏感,目前為止,綿羊精液冷凍保存技術尚不能在生產中大面積推廣應用。常溫保存則僅適用于短時間保存,相對來說低溫保存的成本較低、效果較佳。
液態(tài)低溫保存下精子代謝減弱,可延長精子的存活時間,在溫度恢復正常后代謝也隨之恢復并且仍具有受精能力[1],然而在降溫和升溫過程中會對精子造成不可逆的傷害,需要在稀釋液中添加保護劑。在低溫保存中常用的保護劑主要為動物源性保護劑,如卵黃,它們可使精子在降溫過程中免受傷害[2],然而在近年來的研究中發(fā)現(xiàn),動物源性保護劑會導致疾病的傳播[3],母雞的營養(yǎng)水平和健康狀況也會導致每個批次所生產的卵黃質量不一,并且在運輸過程中也存在疾病傳播的風險,因此促使人們去尋找可代替卵黃的物質[4]。其中大豆卵磷脂的成分更加容易標準化和易獲得,而且不會有細菌污染[5],因而已成為卵黃的有效代替物,它可以有效減少膽固醇和磷脂外流,從而在低溫狀態(tài)下保護精子膜。因此,本試驗在無動物源性稀釋液中添加不同含量的大豆卵磷脂,探究其在低溫狀態(tài)下對精子的保護效果,從而為大豆卵磷脂能否代替卵黃并應用于生產實踐提供參考。
選擇稼鴻養(yǎng)殖專業(yè)合作社體況良好,具有正常繁殖能力的成年杜泊綿羊4只作為試驗動物。
葡萄糖:煙臺市雙化工有限公司生產;蔗糖:天津市光復精細化工研究所生產;檸檬酸鈉:天津市光復精細化工研究所生產;大豆卵磷脂:浙江道格凱特實業(yè)有限公司生產;卵黃:浙江道格凱特實業(yè)有限公司生產;硫酸鏈霉素:浙江道格凱特實業(yè)有限公司生產;青霉素:哈藥集團制藥總廠生產。
集精杯、假陰道、玻璃棒、試管、冰箱、移液槍、100 mL 容量瓶、溫度計、水浴鍋、顯微鏡、干燥箱、冰袋、載玻片、蓋玻片、電子天平、漏斗、濾紙、冷暖箱,均來自西北民族大學生命科學與工程學院動物生產與管理實驗室。
將稀釋液按表1配制后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
表1 100 mL精液稀釋液的配方
采用假陰道法采集精液,將安裝好的假陰道用75%的酒精棉球擦拭消毒,從注水孔處灌入48~55℃溫水調節(jié)假陰道內腔的壓力,使其陰莖插入端呈飽滿的三角形、松緊適度并富有彈性為宜。同時插入端的1/3處由外向里、由厚及薄地涂抹凡士林,最后測量假陰道內測的溫度,在38~42℃范圍內就可采精。
采精結束后,通過肉眼觀察精液色澤是否為乳白色或淺黃色,并且產生上下翻滾的云霧狀現(xiàn)象,檢查合格后放入預溫的集精杯中用毛巾包裹放入泡沫箱帶回實驗室,在15 min 內完成精液品質的檢測,選擇活力在0.8 以上、密度為2.5×109左右的精液進行稀釋,將稀釋液與精液放在37℃水浴鍋中進行等溫處理,按4∶1 的比例將稀釋液緩慢地沿杯壁加入精液中,防止精子受到損傷。精液稀釋后,先在暗處靜置平衡0.5 h,然后裹上8 層紗布放入4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。每間隔12 h 鏡檢精子活率,直至精子全部死亡,統(tǒng)計精子的有效存活時間、總存活時間和生存指數(shù),在第48 小時對精子進行染色,測定頂體完整率和畸形率。
2.4.1 精子活率
用平板壓片法測定精子的活率,取等溫生理鹽水與精液按3∶1 稀釋,將載玻片置于400 倍下鏡檢,每次計數(shù)至少200 個精子,測定直線運動的精子占總精子數(shù)的百分比,每個試驗組做5 個生物學重復。
2.4.2 存活時間
有效存活時間是指精子活率在0.3 以上的保存時間??偞婊顣r間是指精子全部死亡的時間。
2.4.3 頂體完整率
采用姬姆薩染色法測定頂體完整率,將保存24 h的精液置于37℃水浴鍋中孵育,充分混勻后取一滴中層精液制作抹片,在自然條件下進行風干,之后用福爾馬林磷酸鹽固定液固定15 min,用蒸餾水洗去固定液后進行風干。最后Giemsa 染色液染色15 min,用蒸餾水洗凈后風干,等待鏡檢。每張片子計數(shù)300 個精子,觀察精子頂體形態(tài),計算其完整率,每個試驗組做5 個生物學重復。
2.4.4 精子畸形率
采用酸性復紅美藍法測定精子畸形率,將保存24 h的精液置于37℃水浴鍋中孵育,充分混勻后取一滴中層精液制作抹片,在自然條件下進行風干,之后無水乙醇固定2~3 min 后風干。將其全部浸入0.5%的氯胺T中1~2 min,水洗后迅速通過96%的乙醇,風干后放入石碳酸復紅染色液中,在清水中蘸2 次,之后迅速通過美藍染色液,最后水洗風干,等待鏡檢。每張片子計數(shù)300 個精子,觀察精子形態(tài),計算其畸形率,每個試驗組做5個生物學重復。
試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2010 整理后,利用SPSS 25.0的One-way ANOVE 進行單因素方差分析,結果用平均數(shù)±標準誤差表示,P<0.05為差異顯著。
由表2可知,1.875 g/L組精子的有效存活時間顯著高于其他各組(P<0.05),7.500 g/L 組和15.000 g/L 組的有效存活時間顯著低于對照組(P<0.05),3.750 g/L組的有效存活時間顯著高于15.000 g/L 組(P<0.05),其余各組之間差異均不顯著(P>0.05);1.875 g/L 組的總存活時間顯著高于其他各組(P<0.05),7.500 g/L 組和15.000 g/L 組的總存活時間顯著低于對照組(P<0.05)和3.750 g/L 組(P<0.05),其余各組之間差異均不顯著(P>0.05);1.875 g/L 組精子的生存指數(shù)顯著高于其他各組(P<0.05),3.750 g/L 組、7.500 g/L 組和15.000 g/L組的生存指數(shù)均顯著低于對照組(P<0.05),而3.750 g/L 組的生存指數(shù)顯著高于7.500 g/L 組(P<0.05)和15.000 g/L組(P<0.05),7.500 g/L組與15.000 g/L組之間差異不顯著(P>0.05)。由此說明,大豆卵磷脂的含量為1.875 g/L 時最有利于綿羊精液的低溫保存,并且隨著含量的增加會顯著降低綿羊精子低溫保存的總存活時間、有效存活時間和生存指數(shù)。
表2 精子的有效存活時間、總存活時間和生存指數(shù)
由表3 可知,1.875 g/L 組的精子頂體完整率最高,高于對照組(P>0.05)和15.000 g/L 組(P<0.05),其余各組之間差異均不顯著(P>0.05);1.875 g/L 組的精子頂體畸形率最低,顯著低于7.500 g/L 組(P<0.05)和15.000 g/L 組(P<0.05),對照組的畸形率也顯著低于15.000 g/L 組(P<0.05),其余各組之間差異均不顯著(P>0.05)。由此說明,大豆卵磷脂含量為1.875 g/L時能夠提升精子的頂體完整率,降低精子的畸形率,但是隨著含量的增加會使精子的頂體完整率降低、畸形率增加。
表3 精子的頂體完整率及畸形率
精液在保存時受溫度、精子濃度、稀釋液pH值、滲透壓等環(huán)境的影響[6]。2004 年毛鳳顯等[7]提出,綿羊精液的抗凍能力差,對溫度較為敏感,所以溫度對其保存效果的影響備受關注。在精液的低溫保存過程中,會因為溫度變化而出現(xiàn)冷應激,造成精子的不可逆死亡,同時精子在低溫保存過程中會產生活性氧(Reactive oxygen species,ROS)[8],使膜發(fā)生脂質過氧化,進而影響新陳代謝,最終誘發(fā)精子的損傷及凋亡[9]。因此,在精液低溫保存時一般需要外源性保護劑來防止低溫打擊并提供精子代謝所需的營養(yǎng),卵黃為最常用的外源性保護劑,已被廣泛應用于精液保存稀釋液中。但是因為其生產批次不同,對精液保存的效果也會不同,所以國內外研究人員都在尋找可代替卵黃的保護劑。目前研究較多的是植物源性的大豆卵磷脂,卵黃和大豆卵磷脂中可作為保護劑的成分均為卵磷脂,但大豆卵磷脂性能穩(wěn)定,且不存在潛在傳播疫病的風險,可為大規(guī)模商業(yè)化生產稀釋液提供便利。
在本次試驗中,在低溫條件下用含有大豆卵磷脂的稀釋液保存綿羊精液,發(fā)現(xiàn)大豆卵磷脂對黑頭杜泊綿羊精子的存活時間有一定的影響。通過數(shù)據(jù)分析可知,不同含量的大豆卵磷脂對精子的總存活時間、有效存活時間均有比較顯著的影響,其中大豆卵磷脂的添加量為1.875 g/L 時綿羊精子的生存指數(shù)最高,因為該組中的總存活時間和有效存活時間比對照組高。但是隨著其含量的進一步增加,精子的存活時間顯著下降甚至低于對照組,因此大豆卵磷脂含量的增加與存活時間呈負相關,說明高含量的大豆卵磷脂并不適合精子的存活,可能是因為大豆卵磷脂難溶于水,濃度過高達到飽和時,溶解能力變小,使稀釋液變得粘稠,精子運動時會消耗大量的能量,從而對精子的生存性能產生不利的影響。
精子的頂體完整率與精子穿過卵膜的能力相關。在受精過程中當精子到達卵丘細胞表面時,精子頂體通過釋放蛋白分解酶,溶解卵子外部的透明帶以及放射冠,當精子頂體缺失時,精子頭部不能進入卵丘,從而受精失?。?0]。而透明質酸是卵子和透明帶粘液基質的主要成分,只有成熟的精子才可以與透明質酸結合,而精子畸形率會使精子成熟的可能性降低,因此過高的畸形率也會導致受精失?。?1]。在本試驗中1.875 g/L 大豆卵磷脂組的精子頂體完整率最高,高于對照組,且顯著高于15.000 g/L 大豆卵磷脂組,說明大豆卵磷脂對精子的頂體具有一定的保護功能,其可增加細胞膜的通透性,從而修補因為氧化應激功能造成的膜損傷,但是當大豆卵磷脂濃度為15.000 g/L 時,精子的頂體完整率顯著下降,說明在精液稀釋液中大豆卵磷脂的添加量有一定的范圍限制,超過這一范圍會對精子保護產生負作用。通過對精子畸形率的分析可知,大豆卵磷脂的添加量為1.875 g/L時畸形率最低,但是隨著濃度的增加大豆卵磷脂會使畸形率升高,低濃度的大豆卵磷脂有降低精子畸形率的趨勢,可能是其他成分與大豆卵磷脂的抗氧化性綜合作用的結果,這一結果與孟娜娜[12]的研究結果一致。
卵黃對精子細胞膜的保護作用主要依靠卵磷脂,磷脂是細胞膜的主要組成部分[13],可在降溫過程中保護精子膜。卵黃作為動物源性的保護劑存在潛在傳播疫病的風險,同時母雞的營養(yǎng)水平和健康狀況的不同會導致卵黃質量不穩(wěn)定,進而影響精液的應用和保存效果,所以用植物源性的大豆卵磷脂可避免這些不確定因素。大豆卵磷脂中磷脂含量低于卵黃,但不飽和脂肪酸含量卻遠高于卵黃,不飽和脂肪酸對生物膜也起著保護作用[14]。
在稀釋液中添加1.875 g/L的大豆卵磷脂可以延長精子的存活時間,提高綿羊精液低溫保存的質量,說明該含量的大豆卵磷脂可代替卵黃。