羅伊氏乳桿菌富集有機硒轉(zhuǎn)化條件的研究

陳永旭，孔慶輝，窮達卓瑪，田發(fā)益

（西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，林芝 860000）

硒元素在自然界中以有機態(tài)和無機態(tài)的形式存在，是機體所必需的微量元素［1］，硒能夠增強機體的免疫力，并具有抗癌、抗氧化作用［2］。其中無機硒有毒性作用且難以吸收，而有機硒或零價態(tài)的單質(zhì)硒相對于無機硒來說有著較高的吸收利用率［3-5］。目前有兩種途徑合成有機硒，一種是人工合成，另一種是生物轉(zhuǎn)化。但由于人工合成的成本高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜，且吸收利用率低，在實際生產(chǎn)中容易受到限制，而生物轉(zhuǎn)化法合成工藝簡單、成本低廉且轉(zhuǎn)化率相對較高。運用生物轉(zhuǎn)化法把無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒后，可使其毒性降低并能顯著激發(fā)免疫反應(yīng)，是一條安全有效的途徑［6］。因此，很多研究者選擇利用微生物的富集作用來合成有機硒。

動物機體攝入無機硒后，能被組織吸收利用轉(zhuǎn)化為多種不同功能形式的有機硒。王菲［7］的研究表明，吸收利用的硒主要以硒蛋白的形式存在于機體內(nèi)，而多數(shù)硒蛋白是由硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸組成的。Verma 等［8］從動物的組織和器官中檢測出13 種含硒蛋白，其中硒蛋白M 可參與調(diào)節(jié)體重和能量代謝。硒蛋白P還原能力很強，能夠清除機體內(nèi)的自由基，保護肝臟免受壞死和脂質(zhì)過氧化［9］。在細菌培養(yǎng)物中也發(fā)現(xiàn)了多種含硒酶：硫解酶、甘氨酸還原酶和黃嘌呤脫氫酶等，其中谷胱甘肽過氧化物酶能降低細胞中的H2O2，減少血液及腸道中的過氧化物［10-13］。由此可見，硒蛋白對機體調(diào)節(jié)有一定的幫助。目前，在微生物富集轉(zhuǎn)化無機硒的研究中，酵母通常作為首選載體［14］。但研究表明，用酵母富集轉(zhuǎn)化硒時，主要產(chǎn)生硒代蛋氨酸（SeMet），其會非特異性地結(jié)合到蛋白質(zhì)中。多種研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌能將硒轉(zhuǎn)化為硒代半胱氨酸，可作為一種有機硒源用于富有機硒動物飼料添加劑使用。

羅伊氏乳桿菌屬于厚壁菌門（Firmicutes），芽孢桿菌綱（Bacilli），乳桿菌目（Lactobacillales），乳桿菌科（Lactobacillaceae），乳桿菌屬（Lactobacillus），是革蘭陽性菌，是一種過氧化氫酶陰性、不運動、不產(chǎn)芽孢、專性異型發(fā)酵細菌［15］。研究表明，羅伊氏乳桿菌幾乎在任何脊椎動物和哺乳動物的腸道內(nèi)都能被發(fā)現(xiàn)，其耐酸、耐膽鹽，可通過口服到達小腸內(nèi)并黏附在小腸壁，是具有益生功效的腸道益生菌［16］。羅伊氏乳桿菌能夠轉(zhuǎn)化甘油并產(chǎn)生羅伊氏菌素（Reuterin），大多數(shù)乳酸菌分泌的細菌素或類細菌素，僅對種屬相近的部分細菌起抑制作用，而羅伊氏菌素是一種天然的廣譜抑菌物質(zhì)，由環(huán)狀二聚物、3-羥基丙醛的單體和水合物混合組成，在水溶液中存在動態(tài)平衡［17］。羅伊氏菌素可以有效抑制革蘭陽性菌、陰性菌以及霉菌的生長［18］，能作為細菌抑制劑［19］。用羅伊氏乳桿菌轉(zhuǎn)化無機硒，可在一定程度上保障富集有機硒產(chǎn)品的安全性［20］。

羅伊氏乳桿菌能夠把無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，從而降低硒的毒性，提高硒的利用率；羅伊氏乳桿菌是益生菌，它產(chǎn)生的羅伊氏菌素是天然廣譜抑菌物質(zhì)，能改善消化道的微環(huán)境。本研究以羅伊氏乳桿菌為介質(zhì)，通過篩選其對硒的耐受性和最高轉(zhuǎn)化力，以期為富有機硒飼料添加劑產(chǎn)品的規(guī)?；_發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

羅伊氏乳桿菌，由西藏農(nóng)牧學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料實驗室從藏豬消化道內(nèi)分離并鑒定。

1.2 改良的MRS培養(yǎng)基

組成成分：大豆蛋白胨114.67 g、酵母浸粉38.22 g、麥芽糖5.06 g、磷酸氫二鉀2.0 g、葡萄糖10.13 g、紅糖20.25 g、乙酸鈉7.5 g、蜂蜜5 mL、七水硫酸鎂0.098 g、檸檬酸氫二銨2.0 g、硫酸錳0.03 g、吐溫-80 1 mL、瓊脂粉（用于固體培養(yǎng)）15.0 g、無菌蒸餾水1 000 mL。配置好后，121℃高壓滅菌30 min。

主要的優(yōu)化改良措施：氮源改用大豆蛋白胨，并增加了用量，去除了牛肉粉；碳源增加了麥芽糖、紅糖及蜂蜜，減少了葡萄糖的用量。

1.3 儀器及試劑

UV-5200 型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；SF-CJ 垂直單向流雙人凈化工作臺，鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；TOMY SX-500 自動滅菌鍋，日本Tomy Digital Biology 公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機，艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司。

亞硒酸鈉，乙二胺四乙酸二鈉，3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-DAB），甲苯，甲酸，氫氧化鈉，以上試劑均為分析純。

1.4 試驗方法

1.4.1 羅伊氏乳桿菌富有機硒培養(yǎng)

參照張雪梅［21］、Krzywonos 等［22］及Elsayed 等［23］的方法，對培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨等主要成分進行優(yōu)化，來提高菌體質(zhì)量及有機硒轉(zhuǎn)化率。為提高菌種活力，將置于低溫冰柜的羅伊氏乳桿菌放到40～50℃水浴中解凍，并接種至改良的MRS 液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，連續(xù)活化3代，作為菌種。將亞硒酸鈉分別加入到滅菌過的MRS 培養(yǎng)液中，制成不同質(zhì)量濃度（0、20、40、60、80、100、120 μg/mL）的含硒MRS 培養(yǎng)液。將對數(shù)期的羅伊氏乳桿菌按1%的接種量，接入各個不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉MRS 培養(yǎng)液中，設(shè)置搖床溫度為37℃，培養(yǎng)24 h。5 000 r/min 離心10 min，記錄菌落顏色，將不同濃度的亞硒酸鈉菌液，用漩渦振蕩器混勻后，進行MRS 瓊脂平板涂布，每組3個重復(fù)，最后計算菌落數(shù)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

首先配制6 μg/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 g/100 mL EDTA-2Na 溶液和0.5%3，3’-二氨基聯(lián)苯胺溶液。然后準(zhǔn)確吸取0，1，2，3，4，5 mL分別加到50 mL的容量瓶中，加蒸餾水至10 mL，再加入1 mL 配制好的EDTA-2Na溶液，振蕩搖勻后，滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2～3，再各加4 mL 0.5% DAB 溶液，振蕩搖勻，置于暗處反應(yīng)30～50 min。反應(yīng)時間結(jié)束后，用10%NaOH 調(diào)節(jié)pH值至6～7，再加入6 mL 甲苯充分振蕩，然后靜置，等明顯分層后，吸取甲苯層加到比色皿中，設(shè)置紫外分光光度計的波長為420 nm，測量吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 羅伊氏乳桿菌富有機硒轉(zhuǎn)化效率的測定

將培養(yǎng)24 h 后的不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉MRS培養(yǎng)基，5 000 r/min 離心15 min，收集菌體并用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌兩次。采用硝酸-高氯酸混合液濕法消化。在5 mL 的混合液中過夜，然后在80℃的溫度下加熱，直到液體澄清，使各形態(tài)的硒轉(zhuǎn)化為硒單質(zhì)，即可進行硒含量測定。

采用3，3’-二氨基聯(lián)苯胺分光光度法檢測硒含量。首先，硒與3，3’-DAB 在酸性條件下會生成黃色苤硒腦絡(luò)合物；其次，在中性環(huán)境下形成的絡(luò)合物，加入甲苯可以很好地把硒元素萃取出來［24-25］，這時在420 nm 處能測量出較好的吸光度；最后，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可算出硒濃度。

1.4.4 有機硒轉(zhuǎn)化率的計算

有機硒轉(zhuǎn)化率=菌體中有機硒的含量/加入的硒總量。

1.4.5 有機硒轉(zhuǎn)化量的計算

有機硒轉(zhuǎn)化量（μg/g）=菌體內(nèi)有機硒的含量/細菌的干質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 進行數(shù)據(jù)的差異顯著性分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用UV-5200 型紫外分光光度計在420 nm 處測亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以亞硒酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1 所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.053 5X-0.003 8，決定系數(shù)R2=0.998 1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.2 不同硒濃度對羅伊氏乳桿菌的影響

由表1 可知，亞硒酸鈉的質(zhì)量濃度小于60 μg/mL時，菌落數(shù)變化較小，菌體顏色為乳白色，此時無機硒未對羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生毒性作用、菌體正常吸收轉(zhuǎn)化無機硒。當(dāng)亞硒酸鈉的濃度大于80 μg/mL 時，菌落數(shù)明顯減少，菌落顏色開始變?yōu)榧t色。無機硒對羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生毒性作用，抑制了菌體的生長，羅伊氏乳桿菌通過自身的調(diào)節(jié)，把亞硒酸鈉轉(zhuǎn)化為紅色的單質(zhì)硒析出菌體表面，降低毒性作用。當(dāng)亞硒酸鈉的濃度為100 μg/mL 時，與其他各處理組均出現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01），此時亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化量最高。

表1 不同硒濃度對羅伊氏乳桿菌的影響

當(dāng)亞硒酸鈉濃度小于80 μg/mL 時，隨著亞硒酸鈉濃度的升高，每克菌體轉(zhuǎn)化硒的量也逐漸增加；當(dāng)亞硒酸鈉濃度為100 μg/mL 時，硒轉(zhuǎn)化量達到最高，為4.40 mg；當(dāng)亞硒酸鈉濃度在120 μg/mL 時，菌體自身對無機硒的調(diào)節(jié)能力達到上限，無機硒對菌體的毒性作用增強，羅伊氏乳桿菌增殖能力下降，轉(zhuǎn)化硒的能力減弱。

由圖2 可知，當(dāng)亞硒酸鈉濃度小于80 μg/mL 時，每克菌體對亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化效率略有上升趨勢，但無顯著變化，說明羅伊氏菌在此亞硒酸鈉濃度范圍內(nèi)合成的硒蛋白保持穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)亞硒酸鈉濃度達100 μg/mL時，亞硒酸鈉的轉(zhuǎn)化效率最高，達13.3%，說明隨著菌體內(nèi)硒蛋白合成量的增加，促進了羅伊氏乳桿菌的增殖。但在亞硒酸鈉濃度為120 μg/mL 時，亞硒酸鈉對羅伊氏乳桿菌的毒性效果增強，轉(zhuǎn)化效率反而低于濃度為100 μg/mL時。

圖2 不同亞硒酸鈉濃度對菌體轉(zhuǎn)化硒效率的影響

3 討論

本試驗富集有機硒所用的羅伊氏乳桿菌為益生菌，它普遍分布在動物的腸道內(nèi)，并且對腸黏膜有著很強的黏附力，能夠改善腸道菌群分布，抑制有害菌定植，減少微生物從腸腔到腸外組織的轉(zhuǎn)移，加強腸道物理屏障，也可通過產(chǎn)生抗菌分子，抑制病原微生物的定植，還可通過重塑宿主腸道中的微生物群組成減少促炎因子的產(chǎn)生、促進調(diào)節(jié)性T 細胞的發(fā)育，進而保護宿主的腸道免疫系統(tǒng)［26］。Chen 等［27］認為，羅伊氏乳桿菌產(chǎn)生的主要抗菌因子是羅伊氏菌素（Reuterin），其主要是一個由3-羥基丙醛（3-hydroxypropionaldehyde，簡稱3-HPA）的單體、水合物和環(huán)化二聚體組成的混合物，是一種廣譜抗菌的非蛋白質(zhì)類物質(zhì)，能廣泛抑制革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌和病原蟲等的生長。羅伊氏乳桿菌是當(dāng)前微生物中產(chǎn)羅伊氏菌素較強并且耐受力最高的菌種，作為益生菌，它產(chǎn)生的羅伊氏菌素也對機體腸道健康有很大益處。

為了提高羅伊氏乳桿菌的活菌數(shù)，本試驗借鑒了張雪梅等［21］對羅伊氏乳桿菌優(yōu)化后的營養(yǎng)物質(zhì)成分和培養(yǎng)條件，對MRS 培養(yǎng)基進行了改良，以提高菌體質(zhì)量和單位體積內(nèi)對有機硒的轉(zhuǎn)化量。由本試驗結(jié)果可知，當(dāng)亞硒酸鈉的濃度高于80 μg/mL 時，菌體開始出現(xiàn)紅色，并且亞硒酸鈉的濃度越高，顏色越深。有研究指出，乳酸菌可通過自身調(diào)節(jié)化解硒的毒性，除了將富集的一部分硒轉(zhuǎn)化為各種形態(tài)的有機硒外，還會將另一部分還原成零價態(tài)的單質(zhì)硒，即溶液中的紅色物質(zhì)為單質(zhì)硒［28］。孫會輕等［29］通過對古尼蟲草的富硒研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過程中，硒濃度大于7 μg/mL時，古尼蟲草對硒的富集作用會轉(zhuǎn)為病理性，對生物量和富集硒的轉(zhuǎn)化效率都會極顯著下降。劉韞濤等［30］的試驗證明，真菌在硒濃度高于200 μg/mL 時，自身會產(chǎn)生毒性，影響生長。所以當(dāng)菌體變紅時，說明有單質(zhì)硒轉(zhuǎn)化出來，但同時也會伴隨著有機硒的轉(zhuǎn)化。因此，要在硒添加量和轉(zhuǎn)化量之間找到平衡。本試驗結(jié)果表明，菌株的最適亞硒酸鈉濃度為100 μg/mL，此時羅伊氏乳桿菌轉(zhuǎn)化的有機硒量最高，達4.40 mg/g。

動物體內(nèi)的硒大部分以含硒酶和含硒蛋白兩種形式存在，硒的攝入能顯著上調(diào)細胞中基因SELO、SELP、SELES、SELT、SELW、Gpx2、TrxR1 和Sep15 等多種硒蛋白的表達，從而增強免疫細胞治療的抗腫瘤效果。硒酶中的磷脂氫過氧化物谷胱甘肽過氧化物酶（PHGPx），是機體內(nèi)重要的過氧化物分解酶，屬于膜結(jié)合酶，發(fā)揮作用的方式是抑制膜磷脂的過氧化反應(yīng)。另外，硒蛋白中的硒蛋白I 能夠參與磷脂生物合成，而硒蛋白O 含有基礎(chǔ)序列的線粒體蛋白，是氧化還原功能的基礎(chǔ)模板。目前研究發(fā)現(xiàn)的有機硒，它們均對機體有正向調(diào)節(jié)作用。通過羅伊氏乳桿菌對硒的富集作用，使得硒的攝入變得安全、有效。本試驗后續(xù)還對富集有機硒的羅伊氏乳桿菌進行了安全性驗證，每天給兔子飼喂其最大的硒耐受量，最終確定了此濃度下培養(yǎng)出的富有機硒羅伊氏乳桿菌，不會對兔子的健康產(chǎn)生不良影響。本研究組目前正對牦牛進行安全性試驗，從2023 年8 月至10 月期間，牦牛生長良好，沒有出現(xiàn)消化道疾病等，試驗還在持續(xù)進行中。

本試驗主要是對羅伊氏乳桿菌富集有機硒的能力進行了研究，對于羅伊氏乳桿菌所轉(zhuǎn)化硒蛋白的種類，還有待進一步研究。

4 結(jié)論

通過本次試驗發(fā)現(xiàn)，隨著亞硒酸鈉濃度的提高，羅伊氏乳桿菌的菌落逐漸減少，表明過高的亞硒酸鈉濃度會抑制該菌的生長；當(dāng)亞硒酸鈉濃度大于80 μg/mL時，菌體顏色開始變紅，開始析出單質(zhì)硒，表明羅伊氏乳桿菌的轉(zhuǎn)化能力達到峰值，且對硒有較高的耐受性，當(dāng)亞硒酸鈉培養(yǎng)濃度為100 μg/mL 時，有機硒轉(zhuǎn)化量最大，達4.40 mg/g，轉(zhuǎn)化率最高，為13.3%。