基于間接波前整形的近紅外二區(qū)熒光共聚焦成像研究

譚 天，史天悅，吳長(zhǎng)鋒，彭洪尚

（1.中央民族大學(xué) 理學(xué)院 光子系統(tǒng)工程軟件教育部工程研究中心,北京 100081；2.南方科技大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程系,廣東 深圳 518055）

1 引言

高分辨率的光學(xué)成像技術(shù)一直是推動(dòng)生物學(xué)發(fā)展的主要手段，在生物分子解構(gòu)[1]、光遺傳[2]和細(xì)胞形態(tài)學(xué)[3]等方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而，生物組織的折射率分布不均勻，組織的散射會(huì)引起嚴(yán)重的光學(xué)像差，使得照明光無(wú)法高保真度地聚焦，從而限制了組織成像的深度和信噪比。隨著成像深度的增加，生物組織產(chǎn)生的光學(xué)像差階數(shù)也逐漸增加[4]，以至于照明光被多次散射而完全丟失其光場(chǎng)信息。這導(dǎo)致實(shí)現(xiàn)生物組織深處的非侵入性的高分辨顯微成像變得愈發(fā)困難。因此，它也成為光學(xué)研究領(lǐng)域公認(rèn)的難點(diǎn)之一[5]。

生物組織對(duì)光的影響主要表現(xiàn)為散射和吸收，兩者均與光的波長(zhǎng)密切相關(guān)。研究表明在生物組織中存在具有較低散射系數(shù)和吸收系數(shù)的“近紅外窗口”,可以緩解生物組織對(duì)于入射光線的影響[6]。雖然，目前對(duì)于近紅外一區(qū)熒光材料的研究逐漸完善[7]，但仍難以滿足人們對(duì)成像深度的需求。近年來(lái)，由于近紅外二區(qū)熒光成像具有更深的組織穿透率，故其作為一種新興技術(shù)逐漸在成像中得到廣泛應(yīng)用[8]。在近紅外二區(qū)窗口（NIR-II，1 000～1 700 nm），Dai 課題組開發(fā)了小動(dòng)物成像系統(tǒng)[9-10]和光片顯微系統(tǒng)[11]。由于抑制了激發(fā)和發(fā)射光在生物組織中的散射，生成的圖像明顯比傳統(tǒng)可見光和近紅外一區(qū)窗口的圖像更清晰。當(dāng)前，近紅外二區(qū)成像面臨的主要問(wèn)題是性能優(yōu)異、生物相容性好的熒光探針比較匱乏[12-13]。因此，開發(fā)高效的NIR-II 熒光探針是活體熒光成像的熱點(diǎn)之一。

自適應(yīng)光學(xué)（Adaptive Optics，AO）正在被引入至成像系統(tǒng)中，以校正成像過(guò)程中產(chǎn)生的各類光學(xué)像差[14]。AO 方法是一種光電儀器和計(jì)算方法相結(jié)合的方法，由3 個(gè)主要組件組成：測(cè)量像差的傳感器，補(bǔ)償像差的校正器[15-17]以及根據(jù)傳感器測(cè)量值計(jì)算校正器所需信號(hào)的控制器。光學(xué)像差可以使用專用波前傳感器進(jìn)行直接測(cè)量，也可以從圖像中間接確定。人們將這兩種方法分別稱為“直接波前測(cè)量AO”[18-19]和“間接波前測(cè)量AO”[20-21]。在生物成像領(lǐng)域，相比于直接波前測(cè)量AO，間接波前測(cè)量AO 不需要依賴波前傳感器和在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)置“引導(dǎo)星”標(biāo)記，可以顯著降低實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜度和對(duì)于目標(biāo)的侵入性。因?yàn)闆](méi)有專用的波前傳感器，在確定存在的像差大小和所需的校正方面，間接方法明顯慢于基于傳感器的方法。但是，由于顯微鏡和生物組織產(chǎn)生的像差能夠相對(duì)靜態(tài)地持續(xù)數(shù)小時(shí)之久[22]，故間接方法在生物顯微成像領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。與非線性熒光相結(jié)合，Cui 小組[23,24]和Judkewitz 小組[25]分別提出了新的間接波前測(cè)量辦法。IMPAC[23]和F-SHARP[25]，各自實(shí)現(xiàn)了小鼠大腦中達(dá)400 μm深度的雙光子成像。上述工作引發(fā)了廣泛關(guān)注，但這兩個(gè)工作并不能推廣到頭骨比較厚的應(yīng)用場(chǎng)景[26]。如何進(jìn)一步抑制生物組織的散射，提高高分辨率系統(tǒng)在生物組織內(nèi)的成像深度仍有待于人們探索。

本文制備了生物相容性好、熒光亮度高的近紅外二區(qū)熒光探針，在808 nm 激光激發(fā)下，發(fā)射波長(zhǎng)覆蓋990～1 300 nm，可以有效地抑制生物組織的散射對(duì)激發(fā)光和熒光信號(hào)的影響。進(jìn)一步將基于間接波前測(cè)量的自適應(yīng)光學(xué)方法與激光掃描共聚焦系統(tǒng)相融合，以校正生物組織產(chǎn)生的光學(xué)像差，提高穿透組織成像的分辨率和對(duì)比度。比較了兩種常見的用于間接波前測(cè)量的控制算法，“遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）”[27]和“動(dòng)態(tài)自適應(yīng)散射補(bǔ)償全息術(shù)（Dynamic Adaptive Scattering compensation Holography，DASH）”[28]。實(shí)驗(yàn)表明，雖然DASH 算法被用于雙光子成像的像差校正時(shí)，具有比GA 算法更快的收斂速度和更高的信號(hào)提升能力，但在線性熒光成像中GA 算法的校正效果卻優(yōu)于DASH 算法。本文開展了一系列的仿體和活體實(shí)驗(yàn)，使用間接波前測(cè)量校正不同像差后，熒光信號(hào)強(qiáng)度提升為校正前的1.47、1.95 和2.85 倍，提升了系統(tǒng)的分辨率與對(duì)比度。本研究將近紅外二區(qū)熒光探針與自適應(yīng)光學(xué)像差補(bǔ)償技術(shù)相結(jié)合，為深層生物組織內(nèi)高分辨成像提供了新路徑。

2 材料與方法

2.1 近紅外二區(qū)熒光材料

在可見光和傳統(tǒng)的近紅外一區(qū)窗口（700～900 nm），生物組織具有很強(qiáng)的散射，在近紅外二區(qū)窗口（1 000～1 700 nm），光學(xué)散射顯著降低。考慮到半導(dǎo)體聚合物具有良好的生物相容性和較高的量子效率（3%）[29]，本文選擇其作為熒光探針材料，如圖1 所示。熒光探針在700～900 nm 處有很強(qiáng)的吸收，在990 nm 處和1 118 nm 處具有兩個(gè)發(fā)射峰。因此，在808 nm 激光的激發(fā)下，可以實(shí)現(xiàn)近紅外二區(qū)發(fā)射，從而顯著降低生物組織對(duì)于激發(fā)光和熒光信號(hào)的散射。

圖1 半導(dǎo)體聚合物熒光探針的吸收與發(fā)射光譜Fig.1 Absorption and emission spectra of the semiconductor polymer fluorescent probes

2.2 熒光微珠的制備

將直徑為100 nm 的聚苯乙烯（PS）微球稀釋到0.5 wt%的水溶液中，利用超聲儀使其充分分散后用0.22 μm 的濾頭過(guò)濾。調(diào)配水和四氫呋喃（THF）體積比滿足5∶1，向PS 微球中快速注入1 mg/L 的半導(dǎo)體聚合物THF 溶液并渦旋10 s，之后攪拌6 h，以保證熒光探針的裝載。將熒光微珠在15 000 g 下離心30 min 后倒掉上清液并加水超聲，重復(fù)清洗1 次后制得的熒光微珠樣本用于成像實(shí)驗(yàn)。

2.3 電紡絲樣本制備

電紡絲由于具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)以及易于負(fù)載熒光材料的特性，可以模擬生物復(fù)雜的血管組織成像。使用1 mg/L 的半導(dǎo)體聚合物THF 溶液將電紡絲浸透后在黑暗通風(fēng)環(huán)境中晾干，之后用速干膠和玻片進(jìn)行封裝以制得由半導(dǎo)體聚合物標(biāo)記的電紡絲樣本。電紡絲樣本中典型電紡絲的直徑在8 μm 左右。

2.4 散射模型的制備

將0.2 g 的瓊脂糖與1.7 mL 純水混合后在90 °C 下恒溫?cái)嚢?，充分溶解后加?.1 mL 全脂純牛奶并繼續(xù)加熱，待混合均勻后取出靜置凝固以制得具有一定散射系數(shù)的瓊脂散射模型。

2.5 活體小鼠樣本制備

對(duì)3 個(gè)月大的C57 小鼠使用異氟烷氣體進(jìn)行麻醉后用電動(dòng)理發(fā)剪和脫毛膏取出頭部的毛發(fā)。通過(guò)尾靜脈注射100 μL、濃度為200 μg/L 的半導(dǎo)體聚合物溶液并通過(guò)腹腔注射10%的水合氯醛溶液以保證長(zhǎng)時(shí)間麻醉。充分麻醉后使用手術(shù)剪剪去頭皮，并用3%的過(guò)氧化氫溶液清理骨外膜防止其對(duì)實(shí)驗(yàn)造成影響，最后使用生理鹽水清洗創(chuàng)口。

2.6 系統(tǒng)光路設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)的共聚焦成像系統(tǒng)如圖2（彩圖見期刊電子版）所示，808 nm 近紅外連續(xù)激光器（DL808-400，CrystaLaser，USA）發(fā)射的波長(zhǎng)為808 nm 的近紅外光作為激發(fā)光。發(fā)出的激光首先經(jīng)過(guò)一個(gè)偏振片和4f 擴(kuò)束系統(tǒng)變?yōu)槠窆馇夜獍甙霃綌U(kuò)大為初始的8.3 倍，以更方便液晶空間光調(diào)制器（Spatial Light Modulator，SLM）對(duì)入射光束進(jìn)行調(diào)制。隨后擴(kuò)束的激光光束經(jīng)過(guò)一反射鏡反射后以特定的角度入射到SLM（PLUTO-2.1-NIR-135，holoeye，Germany）上。入射光經(jīng)過(guò)SLM 調(diào)制后通過(guò)一個(gè)4f 收束系統(tǒng)使得光斑半徑縮為擴(kuò)束后的0.42 倍。之后入射光先后經(jīng)過(guò)二向色鏡（Dichroic mirror，DM）、掃描振鏡（Galvo scanner，GS）（6210 H，Cambridge Technology，USA）、掃描透鏡（Scan lens）（SL50-3P，Thorlab，USA）、管鏡（Tube lens）（TTL200 MP，Thorlab，USA）、反射鏡和顯微物鏡（XLPlan N 25X，Olympus，Japan）聚焦于樣本上。通過(guò)掃描振鏡、掃描透鏡和管鏡組成的中繼光路可以實(shí)現(xiàn)聚焦光斑在樣本平面內(nèi)的掃描，最大掃描視場(chǎng)為1 320 μm×1 320 μm。樣本激發(fā)出的熒光信號(hào)通過(guò)物鏡、反射鏡、管鏡、掃描透鏡、掃描振鏡和二向色鏡后由一焦距為125 mm 的凸透鏡聚焦于光電倍增管（photomultiplier tube，PMT）上，PMT 前放置一直徑為75 μm 的小孔以濾除目標(biāo)激發(fā)區(qū)域以外的雜散光。在光學(xué)上，SLM 與樣本表面的散射介質(zhì)共軛，通過(guò)在SLM上疊加一定的相位全息圖，以對(duì)散射介質(zhì)產(chǎn)生的像差進(jìn)行補(bǔ)償，從而緩解因散射介質(zhì)導(dǎo)致的入射光不聚焦的問(wèn)題。

圖2 基于間接波前測(cè)量的近紅外激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)Fig.2 Near-infrared laser scanning confocal microscope based on indirect wavefront sensing

本文實(shí)驗(yàn)均采用808 nm 連續(xù)激光對(duì)樣本進(jìn)行激發(fā)，使用長(zhǎng)通濾光片和 PMT 收集波長(zhǎng)大于980 nm 的近紅外熒光信號(hào)后重建圖像。

相比于目前常用的雙光子、多光子成像采用的500～700 nm 左右的信號(hào)光，本系統(tǒng)采用近紅外一區(qū)激發(fā)、近紅外二區(qū)發(fā)射的單光子成像方式具有更好的穿透組織的能力，可以有效提升未校正時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度，為波前整形提供良好的前置條件。

2.7 基于間接波前測(cè)量的光學(xué)像差補(bǔ)償方法

在穿透散射介質(zhì)的共聚焦成像中，由于散射介質(zhì)對(duì)于入射光的散射作用，會(huì)使聚焦光斑的質(zhì)量下降，并且隨著深度的增加，這種影響會(huì)愈加顯著，從而降低圖像的對(duì)比度并影響成像的分辨率。對(duì)此，研究人員提出了直接測(cè)量像差波前并在反演后使用SLM 對(duì)其進(jìn)行校正的直接波前傳感的方法[18-19]。但是該方法不僅需要引導(dǎo)星等來(lái)標(biāo)記從所需成像點(diǎn)發(fā)出的光，還會(huì)顯著增加系統(tǒng)復(fù)雜度。

基于間接波前傳感的方法不需要波前傳感器和引導(dǎo)星，其原理如圖3 所示。在經(jīng)過(guò)一輪完整的成像流程后，探測(cè)器將捕獲到的熒光信號(hào)傳遞至計(jì)算機(jī)，經(jīng)過(guò)特定的算法處理后對(duì)SLM 的相位校正作出控制并進(jìn)行第二輪成像，再一次接受從傳感器捕獲的熒光信號(hào)。經(jīng)過(guò)一系列的成像并對(duì)成像效果使用評(píng)價(jià)函數(shù)（Cost Function，CF）進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算機(jī)最終會(huì)找到可靠的校正模式。

圖3 控制SLM 的反饋系統(tǒng)Fig.3 Feedback system for controlling SLM

當(dāng)聚焦光斑質(zhì)量提升時(shí)，成像熒光強(qiáng)度會(huì)顯著提升，同時(shí)因?yàn)楦〉墓獍邥?huì)導(dǎo)致成像的展寬縮減，這會(huì)使得成像的整體銳度提升。所以本文選取了銳度函數(shù)作為對(duì)整體成像質(zhì)量的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，具體如下：

其中：n為成像圖中采樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)，f為由采樣點(diǎn)坐標(biāo)及其熒光強(qiáng)度建立的曲面函數(shù)。

遺傳算法（Genetic Algorithm，GA）是一種用于間接波前測(cè)量的經(jīng)典方法[27]。在迭代過(guò)程中使用評(píng)價(jià)函數(shù)對(duì)不同的相位矩陣調(diào)制下的成像圖進(jìn)行分析，選取評(píng)價(jià)函數(shù)較高的相位矩陣作為親代，對(duì)其加權(quán)平均后生成子代，最終得到可以很好校正像差波前的校正模式。該算法已用于波前整形并可以取得較好的優(yōu)化效果，但是目前還沒(méi)有將其用于近紅外二區(qū)單光子熒光共聚焦顯微鏡中的報(bào)道。

近年來(lái)，另一種高效的間接波前傳感的自適應(yīng)光學(xué)算法被報(bào)道。它在雙光子成像系統(tǒng)中具有極快的收斂速度并且可以實(shí)現(xiàn)較高的信號(hào)增強(qiáng)，被稱為動(dòng)態(tài)自適應(yīng)散射補(bǔ)償全息術(shù)（Dynamic Adaptive Scattering compensation Holography，DASH）。該方法利用SLM 將入射光束分為兩束，一束為調(diào)制波前，一束為參考場(chǎng)。兩束入射光同時(shí)入射進(jìn)行干涉測(cè)量，使得迭代速度顯著增加[28]。本文嘗試將上述兩種波前整形方法應(yīng)用于近紅外二區(qū)單光子熒光共聚焦顯微鏡中，以檢驗(yàn)他們?cè)谠撓到y(tǒng)中對(duì)于像差的校正效果，選取效果更好的方法進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

由于本系統(tǒng)掃描振鏡的掃描頻率對(duì)單次成像有限制，單輪迭代的時(shí)間一般為45～60 s，若需要對(duì)動(dòng)態(tài)散射介質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)償，可使用掃描頻率更快的掃描振鏡，將單輪迭代時(shí)間縮短至5 s 以內(nèi)。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)像差測(cè)試與校正

在系統(tǒng)搭建過(guò)程中由于各光學(xué)元件和參數(shù)的不精確會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)像差，在全視場(chǎng)上成像時(shí)可以使用GA 算法進(jìn)行校正，補(bǔ)償結(jié)果可作為成像系統(tǒng)的系統(tǒng)像差。

對(duì)熒光微珠樣本直接進(jìn)行掃描共聚焦成像并使用GA 算法進(jìn)行校正，結(jié)果如圖4（彩圖見期刊電子版）所示。

圖4 系統(tǒng)像差的測(cè)試與校正。（a）未進(jìn)行校正時(shí)的樣本成像；（b）經(jīng)過(guò)系統(tǒng)像差校正后的樣本成像圖；（c）評(píng)價(jià)函數(shù)隨迭代輪次的變化曲線；（d）GA 算法計(jì)算得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）全視場(chǎng)圖中比例尺為200 μm，感興趣區(qū)域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.4 Testing and correction of the system aberrations.(a) Imaging of samples without correction;(b) imaging of samples after systematic aberration correction;(c) curve of the evaluation function as a function of iterative order;(d) the corrected phase diagram calculated by GA；scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b)

由圖4 可知，通過(guò)對(duì)系統(tǒng)像差校正前后的成像進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在校正系統(tǒng)像差后，此前未被激發(fā)或信號(hào)強(qiáng)度較低的熒光微珠信號(hào)得到了較大的提升。通過(guò)對(duì)評(píng)價(jià)函數(shù)隨迭代次數(shù)的變化進(jìn)行分析（圖4（c）），GA 算法可以在2-3 代內(nèi)快速收斂至理想值，體現(xiàn)了GA 算法可以快速校正像差的特點(diǎn)。圖4（d）為最終迭代后施加在SLM 上的相位圖，可以認(rèn)為該相位圖能夠?qū)ο到y(tǒng)像差進(jìn)行校正。

3.2 體外電紡絲樣本的像差校正

為了對(duì)比GA 算法和DASH 算法在近紅外二區(qū)熒光共聚焦成像中的像差補(bǔ)償效果，在相同的像差條件下分別使用GA 算法和DASH 算法進(jìn)行相位圖校正。使用近紅外二區(qū)熒光共聚焦系統(tǒng)對(duì)電紡絲樣本進(jìn)行成像，選取成像較為清晰的區(qū)域作為目標(biāo)平面。在對(duì)目標(biāo)平面對(duì)焦之后，將載物臺(tái)向下平移30 μm。通過(guò)這種方式引入了一個(gè)30 μm 的空氣平板，可以在成像光路中引入了一個(gè)固定的像差。通過(guò)對(duì)比GA 算法和DASH算法的校正效果驗(yàn)證這兩種算法在近紅外二區(qū)單光子熒光共聚焦顯微鏡成像中的適用性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5（彩圖見期刊電子版）所示。

圖5 電紡絲像差校正結(jié)果。（a）引入一個(gè)30 μm 的空氣平板并僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的成像圖；（b）在圖（a）成像情況下，使用DASH 算法進(jìn)行像差校正；（c）在圖（a）成像情況下，使用GA 算法進(jìn)行像差校正；（d）為（a）（b）（c）中感興趣區(qū)域的局部放大圖白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布；（e）DASH 算法得到的校正相位圖；（f）GA 算法得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）（c）全視場(chǎng)圖中比例尺為200 μm，感興趣區(qū)域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.5 Aberration correction results of electrospinning.(a) Image with a 30 μm air plate and performing only system aberration correction;(b) in the case of imaging in figure (a),aberration correction caculated by using DASH;(c) in the case of imaging in figure (a),aberration correction caculated by using GA;(d) fluorescence intensity distribution at the white line marker in partial enlarged pictures of the region of interest in figures (a) (b) (c);(e) the corrected phase map calculated by DASH;(f) the corrected phase diagram calculated by GA；Scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b) (c)

在引入一個(gè)固定像差的基礎(chǔ)上，在SLM 上施加圖4（d）所示的相位圖，即只進(jìn)行系統(tǒng)像差的校正，成像結(jié)果如圖5（a）所示?？梢钥闯鲭娂徑z展寬較為嚴(yán)重且熒光強(qiáng)度較低。分別經(jīng)過(guò)DASH算法和GA 算法校正后，圖像的對(duì)比度和熒光強(qiáng)度得以提升，如圖5（b）和5（c）所示。對(duì)紅框中單根電紡絲進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析量化，結(jié)果如圖5（d）所示?？梢钥闯觯捎趦煞N算法校正效果的差異，使得校正后的對(duì)焦平面略有不同。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩算法均可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于外加像差的校正，DASH 算法顯著降低了電紡絲不正常的展寬，將其寬度由23.8 μm 降低至10.5 μm，但是信號(hào)強(qiáng)度卻沒(méi)有明顯提升。這可能與DASH算法得到的相位圖有關(guān)（圖5（e）），相比于GA 算法得到的相位圖（圖5（f）），DASH 算法產(chǎn)生了過(guò)多的雜散相位，導(dǎo)致部分入射光發(fā)散而無(wú)法參與激發(fā)。GA 算法在維持背景信號(hào)幾乎不變的情況下將熒光信號(hào)的峰值強(qiáng)度提升為初始的1.47 倍，并且將電紡絲的寬度由23.8 μm 降低至11.6 μm，顯著提高了熒光信號(hào)的強(qiáng)度和成像對(duì)比度與分辨率。

DASH 算法相比于GA 算法，對(duì)電紡絲展寬具有更好的校正效果。DASH 算法可以產(chǎn)生點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）更小的聚焦光斑，符合其適用于雙光子成像的特征。但GA 算法對(duì)于入射光全光束的調(diào)制使得其可以更加有效地利用入射光強(qiáng)，顯著提升激發(fā)熒光的信號(hào)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)表明在近紅外二區(qū)單光子共聚焦成像中，GA 算法較DASH算法更適用。因此，本文使用GA 算法結(jié)合近紅外二區(qū)共聚焦系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證其對(duì)于各類散射介質(zhì)產(chǎn)生像差的校正效果。

3.3 仿體實(shí)驗(yàn)的像差校正

為驗(yàn)證GA 算法對(duì)散射介質(zhì)產(chǎn)生像差的校正效果，通過(guò)在電紡絲樣本上添加一定的散射介質(zhì)作為仿體進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本系統(tǒng)對(duì)厚度最大約500 μm 的瓊脂散射模型具有較好的校正效果。在電紡絲樣本與顯微物鏡之間添加厚度為480 μm 的瓊脂散射模型模擬在成像過(guò)程中生物組織對(duì)入射激發(fā)光的散射，先后進(jìn)行添加散射介質(zhì)成像、校正系統(tǒng)像差成像和校正全像差成像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，添加散射介質(zhì)后，由于其對(duì)入射光線的散射，激發(fā)光斑質(zhì)量極差，不止熒光強(qiáng)度大幅度下降，也產(chǎn)生了大量的背景噪聲，嚴(yán)重影響了成像質(zhì)量（圖6（b））。通過(guò)在SLM 上施加圖4（d）所示的相位圖以校正系統(tǒng)像差，成像質(zhì)量有一定的提升，但入射光散射導(dǎo)致的背景噪聲依舊十分嚴(yán)重（圖6（c））。最后使用GA 算法對(duì)整體成像的全像差進(jìn)行校正，結(jié)果如圖6 所示（d），對(duì)比只進(jìn)行系統(tǒng)像差校正下的成像，在提升了整體熒光強(qiáng)度的情況下顯著降低了背景噪聲。對(duì)圖6（a）～6（d）紅框區(qū)域白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析量化，結(jié)果如圖6（e）所示。可以看出，在添加介質(zhì)且未進(jìn)行任何處理時(shí)，電紡絲樣本的成像質(zhì)量極差，熒光信號(hào)被淹沒(méi)在背景噪聲之中。在進(jìn)行系統(tǒng)像差校正后，出現(xiàn)了一些熒光信號(hào)，但大量的背景噪聲導(dǎo)致成像中不能看到明顯的熒光強(qiáng)度峰值，成像的對(duì)比度很低，而在使用GA 算法對(duì)全像差進(jìn)行校正后，出現(xiàn)了明顯的熒光強(qiáng)度峰值且在峰值處的熒光強(qiáng)度提升為僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的1.95 倍，顯著提升了成像對(duì)比度?？梢钥闯鼋?jīng)過(guò)像差校正后的電紡絲成像與初始的參考圖像相比具有近似的半高寬。說(shuō)明本方法有效減少了散射介質(zhì)的影響，由于SLM 對(duì)于入射光的調(diào)制使得入射光角度略微偏移，熒光峰值偏移約2.5 μm，該尺寸相比于全視場(chǎng)而言可以忽略。驗(yàn)證了該算法對(duì)散射介質(zhì)產(chǎn)生的像差具有良好的校正效果。

圖6 散射介質(zhì)像差校正結(jié)果。（a）直接成像圖；（b）添加散射介質(zhì)后的成像圖；（c）添加介質(zhì)后進(jìn)行系統(tǒng)像差校正后的成像圖；（d）添加介質(zhì)后進(jìn)行全像差校正后的成像圖；（e）圖（a）-（d）局部放大圖中白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布；（f）GA 算法計(jì)算得到的校正相位圖；比例尺：（a）（b）（c）（d）全視場(chǎng)圖中比例尺為200 μm，感興趣區(qū)域局部放大圖中比例尺為20 μmFig.6 Aberration correction results of scattering medium.(a) Direct imaging;(b) image after adding scattering medium;(c) image after system aberration correction;(d) image after total aberration correction;(e) distribution of fluorescence intensity at white line markers in partial enlarged pictures of (a)-(d);(f) the corrected phase map calculated by GA;Scale: 200 μm in the full field of view and 20 μm in the local magnification of the region of interest in (a) (b) (c) (d)

3.4 活體小鼠腦部成像實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)本系統(tǒng)在活體成像中對(duì)于生物散射組織的校正效果，對(duì)保留了完整顱骨的小鼠顱內(nèi)血管進(jìn)行成像。在僅校正系統(tǒng)像差和校正全像差兩種情況下對(duì)活體小鼠顱骨以下具有較明顯信號(hào)的血管進(jìn)行成像，經(jīng)過(guò)測(cè)量，該血管位于顱骨以下320 nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7（彩圖見期刊電子版）所示。由于顱骨對(duì)于入射光的散射致使激發(fā)光斑質(zhì)量不佳，整體成像的熒光信號(hào)強(qiáng)度不佳（圖7（a））。使用GA 算法進(jìn)行校正后，被顱骨散射而無(wú)法參與熒光激發(fā)的光線被重新聚焦，使得激發(fā)起的熒光強(qiáng)度大幅度提升（圖7（b）），對(duì)圖7（a）和7（b）白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布進(jìn)行分析，結(jié)果如圖7（c）所示。結(jié)果顯示全像差校正后的熒光強(qiáng)度較只進(jìn)行系統(tǒng)像差校正時(shí)提升了2.85 倍。證明該方法用于活體生物成像時(shí)對(duì)活體組織產(chǎn)生的像差具有校正能力。圖7（d）為評(píng)價(jià)函數(shù)隨迭代輪次的變化曲線。可見，相比于體外成像實(shí)驗(yàn)（圖4（c）），其上升速度較慢，需要約9-10 代才收斂至理想波前。這說(shuō)明該算法對(duì)于復(fù)雜像差的校正需要迭代更多的輪次。

圖7 活體小鼠顱內(nèi)成像。（a）僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的小鼠顱內(nèi)血管成像圖；（b）進(jìn)行全像差校正后的小鼠顱內(nèi)血管成像圖；（c）圖（a）（b）中白線標(biāo)記處的熒光強(qiáng)度分布；（d）評(píng)價(jià)函數(shù)隨迭代倫次的變化曲線；比例尺：（a）（b）中比例尺為200 μmFig.7 Intracranial imaging results of living mice.(a) Image of intracranial blood vessels in mice with only systematic aberration correction;(b) image of intracranial blood vessels in mice with full aberration correction;(c) the fluorescence intensity distribution at the white line markers in (a) and (b);(d)curve of the evaluation function as a function of iterative order;scale: 200 μm in (a)(b)

4 結(jié)論

為了改善成像過(guò)程中由于系統(tǒng)和散射介質(zhì)等產(chǎn)生的光學(xué)像差對(duì)最終成像質(zhì)量的影響，本文介紹了兩種基于間接波前測(cè)量的光學(xué)像差補(bǔ)償方法，并將其與近紅外二區(qū)共聚焦成像系統(tǒng)相結(jié)合，利用液晶SLM 對(duì)入射激發(fā)光波前進(jìn)行整形從而實(shí)現(xiàn)對(duì)于系統(tǒng)、介質(zhì)等產(chǎn)生的光學(xué)像差的補(bǔ)償。該方法可以在數(shù)次迭代內(nèi)顯著提升穿透介質(zhì)后成像的信號(hào)強(qiáng)度及成像對(duì)比度與分辨率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GA 算法相比于DASH 算法在近紅外二區(qū)共聚焦線性熒光成像中具有更好的校正效果，在穿透空氣平板、瓊脂散射介質(zhì)和小鼠顱骨的成像中，信號(hào)強(qiáng)度分別提升為僅進(jìn)行系統(tǒng)像差校正的1.47倍、1.95 倍和2.85 倍。本研究為進(jìn)一步開展活體小鼠顱內(nèi)非侵入式熒光成像提供了有意義的參考。