脂多糖誘導(dǎo)雛雞發(fā)熱及肺炎模型建立

金科旭，馮慧勇，阿力米熱·阿布都外力，海婷玉，束佳敏，王天琪，戴小華

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000)

家禽養(yǎng)殖是新疆地方傳統(tǒng)基礎(chǔ)及特色經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，也是新疆各地區(qū)加快現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)農(nóng)村建設(shè)的重要基石。規(guī)?；B(yǎng)殖中由于通風(fēng)消毒等問題會造成N2O、NH3等有害氣體不能及時(shí)處理，導(dǎo)致家禽呼吸道系統(tǒng)疾病的普遍發(fā)生[1]。發(fā)病時(shí)往往伴隨發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀[2]，嚴(yán)重時(shí)會誘發(fā)呼吸道系統(tǒng)的組織性損傷，繼而影響家禽生產(chǎn)甚至導(dǎo)致家禽死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

實(shí)驗(yàn)動物模型是深入開展動物試驗(yàn)或藥物研究中藥效考察重要的一環(huán)，常見的動物模型建立方式包括物理法(缺血再灌輸)、化學(xué)法(二甲苯)、生物法(細(xì)菌、病毒)等[3-5]。脂多糖(LPS)作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成部分，因誘導(dǎo)的炎癥具有許多傳染性炎癥的特征，所以常被用作抗菌、抗炎藥物研發(fā)中動物模型的制備[6-7]。Zhang等[8]為研究白鵠湯解熱機(jī)制，靜脈注射LPS建立兔發(fā)熱模型；寶冬艷[9]通過腹腔注射LPS建立小鼠發(fā)熱模型；Puig等[10]通過酸化LPS誘導(dǎo)建立小鼠肺炎模型。大量文獻(xiàn)表明，與哺乳動物相比較，雞對于LPS具有一定的耐受性，即相對于哺乳動物的炎癥建模甚至致死濃度可能不會誘導(dǎo)雞的炎癥模型建立，僅僅參考哺乳動物的發(fā)熱及炎癥模型濃度可能無法順利誘導(dǎo)雞產(chǎn)生發(fā)熱或炎癥反應(yīng)[11-12]。因此，本試驗(yàn)以三黃雞為試驗(yàn)動物，通過注射不同劑量LPS，考察LPS誘導(dǎo)雞發(fā)熱及肺損傷模型的最佳劑量，為家禽解熱抗炎藥物的研發(fā)提供建模數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LPS(O55：B5，L2880)購自Sigma公司；TriQuick Reagent總RNA提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司；FastKing RT Kit(With gDNase)、SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMasterMix(Dye)購自江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司。

1.2 主要儀器

實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國ABI公司，型號：ABI 7500 Fast)，化學(xué)法光凝膠成像儀(以色列DNR生物影像系統(tǒng)有限公司，型號：MicroChemi)，多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司，型號：SynergyTMHTX)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYCP-31DN型)，臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司，型號：2-16R型)。

1.3 試驗(yàn)動物及分組

1.3.1 動物

1日齡健康三黃雞共20只，購自新疆天康畜牧有限公司。自由采食飲水，定時(shí)清理雞舍衛(wèi)生并每日消殺，雞舍內(nèi)勤通風(fēng)。按標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)技術(shù)適應(yīng)性飼養(yǎng)21 d。

1.3.2 分組及采樣

20只三黃雞隨機(jī)分為4組：空白對照組和2.5 mg/kg、5.0 mg/kg和10.0 mg/kg LPS劑量組，每組5只?？瞻捉M腹腔注射生理鹽水以作對照，LPS各劑量組以腹腔注射方式建模。給藥后要觀察雛雞臨床表現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)后24 h翅下采血，分離血清4 ℃保存?zhèn)溆茫徊杉闻K用冷生理鹽水沖洗血液并用濾紙吸干水分，右肺用于濕干比測定；部分左肺用中性甲醛固定液固定，用于組織學(xué)觀察；剩余左肺液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 臨床表現(xiàn)及死亡率

實(shí)時(shí)觀察并記錄LPS誘導(dǎo)后飲食、采水、排便、被毛及精神狀態(tài)等情況，同時(shí)記錄雛雞死亡情況，根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 體溫及組織濕干比測定

溫度計(jì)記錄LPS誘導(dǎo)0、1、2、3、4、6、8、12、24 h雛雞直腸溫度的變化，并于24 h處死雛雞，將右肺用生理鹽水沖洗后濾紙吸干水分，肺組織濕重稱重記錄；烘箱60 ℃烘干48 h致重量不再變化，干重稱量記錄。

肺臟濕干比=肺臟濕重/肺臟干重。

1.4.3 雛雞肺組織HE染色

將組織從固定液取出并稍作修整，以75%、85%、95%、100%乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明、浸蠟包埋、修蠟切片、烘干脫蠟、HE染色、脫水透明、樹脂封片方式制作病理切片。

1.4.4 ELISA檢測細(xì)胞因子水平

分離血清并將采集的肺組織充分研磨勻漿后，采用ELISA法檢測肺組織中腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量、環(huán)氧合酶-2(COX-2)活性以及血清中細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、COX-2、前列腺素E2(PGE2)、IL-10含量。ELISA試劑盒購自江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.4.5 熒光定量PCR檢測TNF-α mRNA表達(dá)

TriQuick Reagent總RNA提取試劑提取肺組織總RNA，按照試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，得到的cDNA用于熒光定量PCR檢測TNF-α mRNA表達(dá)。引物序列如表1所示。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板2 μL，上下游引物各0.6 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，ROX液0.6 μL，dd H2O 6.4 μL，體系為20 μL。RT-PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。mRNA 的相對轉(zhuǎn)錄量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，以β-actin為內(nèi)參基因。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對均數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA，LSD)，GraphPad軟件繪圖，結(jié)果為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 LPS對雞臨床表現(xiàn)的影響

腹腔注射不同劑量LPS后雛雞的臨床表現(xiàn)和生存曲線見圖1。LPS誘導(dǎo)后，所有LPS劑量組雛雞出現(xiàn)嗜睡、精神沉郁、閉眼扎堆、不愿走動且對外界刺激反應(yīng)遲鈍等臨床癥狀。10.0 mg/kg LPS劑量組誘導(dǎo)的雛雞于2、3、6 h出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，存活曲線見圖1。8 h后所有LPS組未再出現(xiàn)雛雞死亡，臨床癥狀緩解，開始飲水進(jìn)食。由于10.0 mg/kg LPS劑量組雛雞死亡率高于50%，因此后續(xù)試驗(yàn)采用空白組和2.5 mg/kg、5.0 mg/kg LPS劑量組進(jìn)行研究。

圖1 不同濃度LPS對雛雞存活率的影響

2.2 LPS對雞體溫的影響

LPS對雞體溫的影響結(jié)果如圖2所示。與空白組相比，LPS各劑量組均能提高雞的體溫。2.5 mg/kg劑量組體溫于3 h達(dá)到最高(P<0.01)，并持續(xù)至8 h顯著高于空白組(P<0.05)，隨后體溫逐漸恢復(fù)，于24 h恢復(fù)正常；5.0 mg/kg劑量組于6 h達(dá)到最高(P<0.01)，隨后體溫逐漸恢復(fù)，直到24 h體溫仍高于空白組(P<0.05)。

與空白組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.3 LPS對雞肺臟濕干比的影響

LPS對雛雞肺濕干比的影響結(jié)果如圖3所示。LPS各劑量組肺組織濕干比值較空白組極顯著升高(P<0.01)，LPS各劑量組對雛雞肺臟濕干比值的影響呈劑量依賴性，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 不同濃度LPS對雛雞肺臟濕干比的影響

2.4 LPS對雞肺組織結(jié)構(gòu)的影響

LPS對雞肺組織學(xué)變化的影響如圖4所示?？瞻捉M肺毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)完整，肺房中無紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤(圖4A)；2.5 mg/kg LPS劑量組中肺毛細(xì)血管壁增厚并且有紅細(xì)胞浸潤，淋巴組織間隙可見嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(圖4B)；5.0 mg/kg LPS劑量組中可見肺房結(jié)構(gòu)破損嚴(yán)重，平滑肌束增厚，肺毛細(xì)血管及淋巴組織間隙中有大量紅細(xì)胞浸潤，不能觀察到肺小葉之間清晰的界限，大量粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在肺組織中出現(xiàn)(圖4C)。

A.空白組；B. 2.5 mg/kg LPS組；C. 5.0 mg/kg LPS組；紅色箭頭為紅細(xì)胞浸潤，黑色箭頭為炎性細(xì)胞浸潤。

2.5 LPS對細(xì)胞因子含量/活性的影響

LPS對肺組織中炎癥因子含量及活性的影響結(jié)果見表2。與空白組相比，LPS各劑量組肺組織中炎癥因子TNF-α含量及COX-2活性極顯著增加(P<0.01)；隨著LPS濃度的升高，5.0 mg/kg與2.5 mg/kg LPS組相比，TNF-α含量及COX-2活性也極顯著升高(P<0.01)。

表2 雛雞肺臟炎癥因子檢測

LPS對血清中細(xì)胞因子含量的影響結(jié)果如表3。經(jīng)LPS誘導(dǎo)，血清中2.5 mg/kg LPS組炎癥因子TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.05)，IL-1β、COX-2、PGE2含量極顯著升高(P<0.01)。隨著LPS劑量增加，5.0 mg/kg LPS組炎癥因子除IL-10的含量均極顯著升高(P<0.01)，其中IL-1β含量顯著高于2.5 mg/kg LPS組(P<0.05)。LPS誘導(dǎo)后抗炎因子IL-10含量顯著降低(P<0.05)，當(dāng)LPS濃度達(dá)到5.0 mg/kg時(shí)，IL-10含量極顯著降低(P<0.01)，并且較2.5 mg/kg LPS組顯著降低(P<0.05)。

表3 雛雞血清炎癥因子檢測

2.6 LPS對肺組織炎癥因子TNF-α mRNA表達(dá)的影響

LPS對炎癥因子TNF-α mRNA的表達(dá)影響結(jié)果見圖5。相比空白組，LPS各劑量組的TNF-α mRNA表達(dá)水平均極顯著升高(P<0.01)，且表達(dá)水平呈LPS劑量依賴性，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)動物炎癥模型的建立，是更好地研究各類動物疾病發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而研制更多有效防治藥物的基礎(chǔ)。LPS是一種能夠引起機(jī)體組織及免疫細(xì)胞炎癥反應(yīng)的內(nèi)毒素，能夠通過NF-κB、MAPK等多種信號通路，誘導(dǎo)如TNF-α等炎癥因子的表達(dá)和分泌，進(jìn)而引發(fā)機(jī)體炎癥[15]。同時(shí)LPS能夠作為外源性致熱源通過刺激機(jī)體體內(nèi)免疫細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性致熱源(TNF-α、IL-1β)，內(nèi)源性致熱源能夠通過刺激大腦皮層細(xì)胞介質(zhì)或直接參與發(fā)熱中樞介質(zhì)PGE2的合成與釋放，引發(fā)機(jī)體發(fā)熱[16-17]。

袁麗華等[18]為研究清開靈解熱作用，通過腹腔注射LPS成功建立仔豬發(fā)熱模型。Nguyen等[19]通過對小鼠腹腔注射LPS建立小鼠發(fā)熱模型，進(jìn)而研究美洲大蠊及其提取物的解熱抗炎作用。本試驗(yàn)檢測到腹腔注射2.5 mg/kg LPS后雛雞體溫呈現(xiàn)上升趨勢，并于注射后3 h達(dá)到頂峰，隨后逐漸降低，24 h后恢復(fù)正常；當(dāng)LPS劑量為5.0 mg/kg時(shí)，雛雞體溫出現(xiàn)先降低后急速升高現(xiàn)象，3 h后較空白組有著顯著升高，在6 h達(dá)到頂峰，隨后雖有降低趨勢，但24 h后較空白組仍有著顯著升高。李天珍[20]通過不同途徑以血清型O111：B4 LPS建立雛雞不同組織炎癥模型時(shí)，通過頸靜脈注射LPS后出現(xiàn)炎癥臨床癥狀及發(fā)熱現(xiàn)象，與本研究結(jié)果相似?？梢钥闯鲭S著外源性致熱源的濃度升高，發(fā)熱峰值出現(xiàn)延期，發(fā)熱時(shí)間延長，因此后續(xù)對于解熱藥物的研究中，可以考慮發(fā)熱時(shí)間較久的濃度，以此來保證可以檢測到藥物解熱的全過程。

COX-2是一種可誘導(dǎo)酶，國內(nèi)外大量研究表明，COX-2在多種炎性疾病中顯著表達(dá)，且越來越多的研究闡明了COX-2在炎癥過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[21-23]。TNF-α作為炎癥中最先出現(xiàn)的炎癥因子，能夠通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，刺激肺組織釋放IL-1β、IL-6、PGE2等炎癥介質(zhì)，并促使肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞增多，導(dǎo)致肺臟炎癥性損傷[24-25]。因此炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6等是先天性和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵因素，通過控制它們的活性可以啟動作為抵抗病原體或組織損傷的防御機(jī)制的免疫應(yīng)答，在各種病理炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[26]。Baradaran等[27]通過LPS誘導(dǎo)小鼠肺炎模型，小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2等炎癥因子的含量顯著升高。本研究中，經(jīng)不同濃度LPS誘導(dǎo)，各LPS劑量組肺組織及血清中炎癥因子的含量及活性均出現(xiàn)顯著升高，當(dāng)LPS劑量達(dá)到5.0 mg/kg時(shí)，肺組織中TNF-α及COX-2不僅較空白組極顯著升高，且較2.5 mg/kg組也有極顯著升高，血清中IL-1β較2.5 mg/kg組極顯著升高。試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著LPS濃度的增加，可造成雞發(fā)熱及肺炎程度的加深，但若濃度過高，會造成雞死亡率超過50%，因此可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇適宜的濃度建立相應(yīng)模型。

綜上所述，2.5 mg/kg和5.0 mg/kg LPS腹腔注射三黃雞雛雞，均可建立發(fā)熱及肺炎模型，具體應(yīng)用時(shí)可根據(jù)所考察藥物對于解熱抗炎藥效及藥動效果的不同，選擇相應(yīng)的建模方式。