新型鵝細(xì)小病毒徐州分離株NGPV XZ-01的分離和致病性研究

遲蘭，藺輝星

(1. 徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221006；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095)

鴨短喙侏儒綜合征(short beak and dwarfism syndrome，SBDS)是由變異鵝細(xì)小病毒或稱變異小鵝瘟病毒所引起鴨的一種新型疫病。該病最早于1971年在法國半番鴨中發(fā)現(xiàn)[1-2]，2009年研究人員對(duì)其病原進(jìn)行了分離和鑒定，確定為變異鵝細(xì)小病毒或稱變異小鵝瘟病毒[3]。

2014年以前，由于SBDS一直是零星發(fā)病，所以不被養(yǎng)殖戶所重視或被認(rèn)為是營養(yǎng)不良而淘汰，但2015年2月以來，本病在中國的櫻桃谷北京鴨中暴發(fā)，此后該病呈地方性暴發(fā)流行，陸續(xù)在國內(nèi)的騾鴨、麻鴨等品種發(fā)生[4-7]，呈現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)張的趨勢(shì)，養(yǎng)殖場(chǎng)一旦遭到感染，即會(huì)造成非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2019年，SBDS在埃及和波蘭開始流行，主要感染騾鴨和櫻桃谷北京鴨[8-9]。相關(guān)的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病不僅會(huì)危害半番鴨，在各地的櫻桃谷肉鴨也有大范圍流行，其發(fā)病率可達(dá)10%～100%，死亡率為 2%～10%，僵鴨淘汰率或殘鴨率高達(dá)20%～80%，給養(yǎng)鴨業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[10]。自2014年開始，在江蘇省徐州市及周邊養(yǎng)殖的商品半番鴨中開始出現(xiàn)一種以喙短、舌長、易骨折、發(fā)育障礙為主要臨床特點(diǎn)的疾病[11]，后經(jīng)有關(guān)學(xué)者研究確定其病原為變異的小鵝瘟病毒。由于沒有特效的藥物，所以對(duì)SBDS的治療主要為對(duì)癥治療，可選用阿莫西林配合補(bǔ)充電解質(zhì)、維生素、鈣及維生素D等營養(yǎng)物質(zhì)，防止繼發(fā)感染的同時(shí)提高免疫力[12]。

2021年6月，江蘇徐州某商品半番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖肉鴨約6 000只，但飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，該場(chǎng)肉鴨在養(yǎng)殖10多天后出現(xiàn)采食量下降的現(xiàn)象，且死淘率較以往高。飼養(yǎng)20 d部分肉鴨陸續(xù)出現(xiàn)上下喙變短、舌頭稍外露、易骨折、發(fā)育緩慢等癥狀。據(jù)統(tǒng)計(jì)6 000只肉鴨中，前期死亡約150只，出現(xiàn)侏儒體質(zhì)的鴨約有1 500多只，嚴(yán)重影響該批次鴨的上市。臨床表現(xiàn)疑似為SBDS，為確定該場(chǎng)所發(fā)疾病的病原及其致病性，本研究從該養(yǎng)殖場(chǎng)表現(xiàn)為短喙、侏儒的病鴨體內(nèi)采集肝臟、脾臟、小腸等樣品送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析檢測(cè)。經(jīng)PCR檢測(cè)、鴨胚接種、尿囊液傳代、電鏡檢查、胚體病理學(xué)切片、動(dòng)物接種試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，最終診斷該場(chǎng)所發(fā)疾病為SBDS，并在此基礎(chǔ)上，分離到1株新型鵝細(xì)小病毒徐州分離株。

1 材料與方法

1.1 主要材料

發(fā)病鴨場(chǎng)出現(xiàn)侏儒癥狀的病鴨，非免疫種鴨蛋購自于哈爾濱獸醫(yī)研究所；非免疫雛鴨由本實(shí)驗(yàn)室孵化所得。

DNA、RNA提取試劑盒均購自Axygen公司；瓊漿糖Agarose購于Agarose公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PremixTaq、 50×TAE Buffer、DNA Maker、EB 染料等均購自寶生物工程(大連)有限公司；引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。HE染色劑、甲醛、酒精等試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病料采集、處理及病原檢測(cè)

于超凈工作臺(tái)內(nèi)剖檢侏儒鴨，無菌采集病鴨脾臟、肝臟、腎臟以及十二指腸等組織，在滅菌研缽中進(jìn)行剪碎，再加入適量滅菌生理鹽水進(jìn)行充分研磨，勻漿后分裝在1.5 mL的指形管內(nèi)并放置-70 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，于4 ℃ 2 000 r/mim低速離心10 min后吸取上清液至離心管中，4 ℃ 2 000 r/mim離心10 min吸取上清液。將上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾至滅菌離心管中，備用。

根據(jù)Axygen病毒DNA、RNA提取試劑盒說明書分別提取上述濾液的DNA和RNA，按照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行RNA的反轉(zhuǎn)錄，參照文獻(xiàn)[13-14]，分別用番鴨細(xì)小病毒(MDPV)、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨瘟病毒(DPV)、鴨病毒性肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)與鴨呼腸孤病毒(DRV)特異性引物對(duì)DNA、反轉(zhuǎn)錄DNA樣品進(jìn)行PCR或RT-PCR檢測(cè)，引物信息見表1。

表1 檢測(cè)病毒用相關(guān)引物信息

1.3 病毒分離培養(yǎng)

提前孵化非免疫半番鴨種蛋，待鴨胚孵化至12日齡，取上述1.2中所獲無菌上清濾液按照0.1 mL/胚，經(jīng)尿囊腔接種12日齡非免疫胚10枚，接種后置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，棄去24 h內(nèi)死亡鴨胚，每天上、下午2次照蛋，觀察鴨胚。如有死亡，及時(shí)無菌收獲其尿囊液；如沒有死亡則盲傳6～10代，直至出現(xiàn)胚體特異性死亡，收獲其尿囊液，置-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離培養(yǎng)樣本PCR鑒定

將1.3中出現(xiàn)特異性死亡胚體進(jìn)行GPV病原鑒定[14]，引物見表1中GPV-F、GPV-R對(duì)應(yīng)序列。

PCR反應(yīng)體系為DNA模板(25 ng/μL)6 μL，50×TAE Buffer 1 μL，正反向上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，PremixTaq1 μL，加滅菌ddH2O 至50 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性50 s，62 ℃退火35 s，70 ℃延伸60 s，共30個(gè)循環(huán)，最后70 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并觀察。

1.5 尿囊液電鏡檢查

將1.3中收獲的出現(xiàn)特異性死亡胚體尿囊液混合液20 mL，經(jīng)4 ℃，12 000 r/mim，離心10 min去除雜質(zhì)，吸取上清液至新的離心管再次經(jīng)4 ℃，150 000 r/mim超速離心2 h，棄去上清液，將沉淀重懸后經(jīng)磷鎢酸負(fù)染，在電鏡下觀察病毒粒子。

1.6 病毒滴度測(cè)定

提前孵化非免疫種蛋至第12天，取1.3中收獲的出現(xiàn)特異性死亡胚體的尿囊液1 mL，使用滅菌生理鹽水對(duì)其進(jìn)行倍比稀釋(10-1～10-7)，取每個(gè)稀釋倍數(shù)的病毒液經(jīng)尿囊腔接種非免疫胚(0.1 mL/胚)各10枚，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，接種后每天上、下午各照蛋1次，棄去24 h內(nèi)死亡胚，每天記錄各稀釋度病毒所致鴨胚死亡數(shù)，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的半數(shù)鴨胚致死量(ELD50)。

1.7 鴨胚組織的病理學(xué)檢查

分別采集1.3中孵化過程中出現(xiàn)特異性死亡胚體的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、腦、皮膚等組織，按照病理組織切片的制作方法進(jìn)行依次進(jìn)行固定、沖水、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片和貼片等，完成組織切片的制作。然后進(jìn)行脫蠟，使用HE染色劑進(jìn)行染色，染色完畢進(jìn)行封片，放在37 ℃溫箱中待中性樹膠干后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，記錄病理檢測(cè)結(jié)果。

1.8 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將購入的非免疫鴨種蛋200枚在孵化箱中進(jìn)行孵化，出殼后，移至消毒后的隔離器中飼養(yǎng)。將140羽剛出殼的健康非免疫雛鴨隨機(jī)分為3組，依次命名為健康對(duì)照組(20只)、3日齡攻毒組(60只)和7日齡攻毒組(60只)，分別飼養(yǎng)于不同的隔離器中，由專人負(fù)責(zé)飼養(yǎng)、觀察并記錄體重增長情況和臨床癥狀等。

分別對(duì)3日齡攻毒組、7日齡攻毒組采用皮下注射方式接種病毒0.2 mL，同時(shí)對(duì)健康對(duì)照組皮下注射接種滅菌生理鹽水0.2 mL，攻毒后每天2次觀察試驗(yàn)鴨的精神狀況，及時(shí)記錄臨床癥狀、發(fā)病率和死亡情況。分別于14日齡與28日齡測(cè)定每只試驗(yàn)動(dòng)物的喙長，稱量每只試驗(yàn)動(dòng)物的體重。從14日齡開始，每天分別在3個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)取10只鴨測(cè)量體重變化。飼養(yǎng)至28日齡將所有試驗(yàn)鴨安樂死并進(jìn)行剖檢，分別從各組取1只試驗(yàn)鴨，用于X射線檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)采用 Excel 2013進(jìn)行處理，然后導(dǎo)入SPSS 22版本軟件進(jìn)行方差分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病鴨病原學(xué)檢測(cè)

采集病鴨脾臟、肝臟、腎臟、十二指腸等樣本經(jīng)處理，PCR、RT-PCR擴(kuò)增及電泳后，僅GPV呈陽性(見圖1)，MDPV、DPV、DHV-Ⅰ、DTMUV與DRV均為陰性。

M. DL1000 DNA Marker；1. MDPV；2. GPV；3. DPV；4. DHV-Ⅰ；5. DTMUV；6. DRV。

2.2 病毒鴨胚接種

病料研磨、凍融、過濾除菌后接種12日齡非免疫鴨胚，盲傳6代，第7代接種96 h后，鴨胚陸續(xù)出現(xiàn)死亡，死亡鴨胚全身廣泛出血、發(fā)育遲緩，體型較正常鴨胚明顯減小，出現(xiàn)侏儒胚(圖2)。繼續(xù)傳至第8代時(shí)，胚體大多數(shù)在接種96～160 h內(nèi)發(fā)生死亡，死亡胚體全身多處有明顯出血，喙變短，體型較對(duì)照組小很多(圖3)。

A.接種96 h后死亡胚；B.同日齡鴨胚對(duì)照。

A.接種96 h后死亡胚；B.同日齡對(duì)照。

2.3 接種鴨胚尿囊液PCR鑒定

將盲傳第7、8代(出現(xiàn)特異性死亡)的胚體尿囊液混合、提取DNA后，使用GPV的引物對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，均為GPV陽性(圖4)。

M. DL1000 DNA Marker；1. 第7代；2. 第8代；3. 陽性對(duì)照；4. 陰性對(duì)照。

2.4 病毒培養(yǎng)液的電鏡檢查

各取第7、8代病毒接種死亡胚的尿囊液10 mL混合，共20 mL，經(jīng)高速離心、重懸及磷鎢酸復(fù)染后，在電鏡下觀察到多個(gè)圓形、無囊膜，直徑為15～30 nm的病毒粒子(圖5)，外觀與典型GPV病毒粒子非常相似。將本試驗(yàn)分離的病毒命名為新型鵝細(xì)小病毒徐州分離株NGPV XZ-01。

圖5 鴨胚尿囊液中的病毒粒子

2.5 分離病毒ELD50的測(cè)定

將第7代病毒培養(yǎng)液(特異性死亡胚的尿囊液)進(jìn)行梯度稀釋并接種非免疫鴨后，按Reed-Muench法計(jì)算病毒的ELD50，第7代次病毒滴度達(dá)5.7 lgELD50/mL。

2.6 死亡胚體的病理學(xué)檢查

采集第7、8代死亡胚體的各內(nèi)臟器官，制作病理切片并觀察，在死亡胚體的肝臟(圖6)、腎臟(圖7)和心臟(圖8)組織中，均可見炎性細(xì)胞浸潤和壞死。

紅色箭頭為肝細(xì)胞，黑色箭頭為肝竇淤血，綠色箭頭為炎細(xì)胞浸潤。

黑色箭頭為腎小球，紅色箭頭為腎小管，綠色箭頭為細(xì)胞變性、壞死和脫落，間質(zhì)出血。

黑色箭頭為心肌纖維排列紊亂，變性、壞死和斷裂，紅色箭頭指示間質(zhì)可見出血。

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

將本試驗(yàn)分離到的NGPV XZ-01株采用皮下注射的方式分別接種3日齡及7日齡的非免疫雛鴨。3日齡攻毒組試驗(yàn)鴨在接種的第3天開始逐漸出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、腹瀉、怕冷扎堆、喜臥、羽毛粗亂及運(yùn)動(dòng)障礙等臨床癥狀，體型明顯偏小，部分病鴨出現(xiàn)癱瘓及死亡。攻毒后的第16天，試驗(yàn)鴨出現(xiàn)舌頭外露的癥狀。剖檢發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)鴨的病理變化多表現(xiàn)在消化道，肉眼觀察病變主要為泄殖腔腫大，腸道漿膜輕微水腫，腸內(nèi)容物稀薄。7日齡攻毒組在接種后第5天出現(xiàn)精神稍差、食欲減退、輕微腹瀉，糞便顏色為灰黃色，部分鴨扎堆喜臥，體型較對(duì)照組偏小，但優(yōu)于3日齡攻毒組。少量鴨出現(xiàn)癱瘓及死亡。動(dòng)物飼養(yǎng)至20日齡后，攻毒組試驗(yàn)鴨陸續(xù)出現(xiàn)上下喙變短、舌頭外露、生長發(fā)育緩慢等癥狀。對(duì)照組無異常。

根據(jù)臨床觀察統(tǒng)計(jì)，3日齡攻毒組發(fā)病率90%，死亡率11.6%；7日齡攻毒組發(fā)病率76.6%，死亡率6.6%；對(duì)照組無發(fā)病與死亡，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 動(dòng)物回歸試驗(yàn)臨床結(jié)果統(tǒng)計(jì) 只

體重測(cè)量結(jié)果顯示，22日齡時(shí)試驗(yàn)鴨平均體重，3日齡攻毒組較對(duì)照組下降55%左右，7日齡攻毒組較對(duì)照組下降42%左右，差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)鴨體重變化數(shù)據(jù)見表3。

表3 試驗(yàn)鴨體重變化 g

病鴨腸道病理切片顯示，十二指腸腸絨毛頂端上皮細(xì)胞壞死、不同程度脫落，部分腸腺壞死(圖9)。

A.3日齡攻毒組；B.7日齡攻毒組；C.對(duì)照組。

3 討論

1970年左右，SBDS最先在法國西南部的半番鴨中出現(xiàn)[15]。之后，在波蘭等地也出現(xiàn)了類似的病例。國內(nèi)較早的病例則可以追溯到2008年下半年的福建。2008年之后，全國各地的半番鴨養(yǎng)殖中，短喙、長舌的癥狀時(shí)有發(fā)生，但都未引起嚴(yán)重的感染。直至2015年，SBDS在山東、四川、河南等多地暴發(fā)，發(fā)病率達(dá)5%～20%[16]，才引起養(yǎng)殖業(yè)的重視。研究顯示，NGPV與經(jīng)典型GPV之 間擁有特征性的核苷酸和氨基酸差異[17]。直到近幾年才完全獲得感染半番鴨的能力，從而進(jìn)一步導(dǎo)致了SBDS在全國范圍內(nèi)的大暴發(fā)。傳播方式方面，已有研究表明SBDS可以通過直接接觸(同居)和呼吸道(空氣傳播)感染[18]，而空氣傳播能力則較弱，這一研究結(jié)果，使臨床預(yù)防效果得以提高。

相關(guān)研究表明，野毒感染所導(dǎo)致的SBDS發(fā)病率為10%～100%，死亡率2%～10%，僵鴨淘汰或殘鴨率20%～80%[1]，主要導(dǎo)致雛鴨上、下喙變短，舌頭外露、生長不良，易骨折等癥狀[19]。由于本病的病原為一種新型小鵝瘟病毒，患鴨不具備經(jīng)典小鵝瘟病毒所特有的“腸栓塞”病理變化[20]。本試驗(yàn)的臨床及動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的新型鵝細(xì)小病毒徐州分離株(NGPV XZ-01株)在接種非免疫雛鴨后，攻毒試驗(yàn)鴨的發(fā)病率為83.3%，死亡率9.1%，主要癥狀表現(xiàn)為生長發(fā)育明顯受阻、大部分的試驗(yàn)半番鴨成為“僵鴨”，同時(shí)伴有喜臥扎堆、拉稀糞、運(yùn)動(dòng)障礙、癱瘓、易骨折等癥狀。隨著日齡增長，舌頭外露及上下喙變短的癥狀也逐漸表現(xiàn)，平均體重也顯著下降，與上述研究結(jié)果報(bào)道一致。

4 結(jié)論

針對(duì)2021年江蘇徐州某商品半番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)的肉鴨所發(fā)疾病，本研究通過對(duì)病死鴨組織進(jìn)行PCR檢測(cè)，非免疫鴨胚接種、傳代，胚體尿囊液電鏡觀察以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)等臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷，確定導(dǎo)致該場(chǎng)所發(fā)疾病為SBDS。分離到1株本地流行毒株 NGPV XZ-01株，該毒株不僅可以導(dǎo)致非免疫鴨胚胚體出血及死亡，在接種非免疫雛鴨后，也會(huì)導(dǎo)致新生雛鴨出現(xiàn)短喙、侏儒、腹瀉甚至死亡等癥狀，對(duì)1周齡以內(nèi)非免疫雛鴨的致病率達(dá)76%以上，死亡率達(dá)6%以上，影響增重達(dá)40%以上，且感染年齡越小，發(fā)病率、病死率及增重影響越嚴(yán)重。研究表明，本次試驗(yàn)所分離到的NGPV XZ-01株對(duì)半番鴨具有很強(qiáng)的致病性，也為新型小鵝瘟病毒的進(jìn)一步研究提供了理論支持。