犬靜脈滴注丙氨酰谷氨酰胺注射液的安全性研究

周宇晴，王俊麗，郭凡溪，陳寶昌，武夢(mèng)蓉，馬瑞霞，王夢(mèng)云，趙欣雨，李重陽，張馮奕弛，吾買爾江·牙合甫，余祖功

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

我國寵物行業(yè)處于快速發(fā)展階段，寵物養(yǎng)殖量與日俱增。寵物創(chuàng)傷、外科手術(shù)，尤其是消化道手術(shù)病例繁多，如胃擴(kuò)張、胃扭轉(zhuǎn)、消化道異物、梗阻等不僅損傷胃腸道屏障和功能，還須手術(shù)治療，術(shù)后尤其需要補(bǔ)充腸外營養(yǎng)[1-2]。谷氨酰胺不僅能促進(jìn)胃腸黏膜上皮成分已糖胺及葡萄糖胺的生化合成，有效逆轉(zhuǎn)黏膜萎縮和維持胃腸道屏障功能[3]，還可為手術(shù)、燒傷、危重癥等應(yīng)激狀態(tài)或其他高分解代謝狀態(tài)的患者補(bǔ)充腸外營養(yǎng)[4]；還具有保護(hù)胰腺、肝臟等器官的功能[5]。然而，谷氨酰胺的溶解度和水溶液穩(wěn)定性制約了谷氨酰胺注射給藥的應(yīng)用。為避免上述問題，將谷氨酰胺和丙氨酸偶聯(lián)成丙氨酰谷氨酰胺(alanyl-glutamine，Ala-Gln)二肽，其溶解度能達(dá)到568 g/L，水溶液能耐高溫滅菌，穩(wěn)定性優(yōu)于谷氨酰胺，經(jīng)靜脈輸注后能迅速分解為谷氨酰胺和丙氨酸，半衰期僅2.4～3.8 min[6]。因此Ala-Gln注射液通過腸外補(bǔ)充谷氨酰胺，在寵物臨床市場(chǎng)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

盡管Ala-Gln注射液具有多重藥理作用，醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用廣泛，但在使用過程中發(fā)現(xiàn)有患者出現(xiàn)寒顫、嘔吐、肝損害等不良反應(yīng)。目前，國內(nèi)尚未有針對(duì)Ala-Gln注射液的靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)報(bào)道，本試驗(yàn)參考《寵物用藥物對(duì)靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[7]、《畜禽用藥物靶動(dòng)物安全性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》[8]的要求，考察犬靜脈滴注Ala-Gln注射液的安全性，為Ala-Gln注射液未來應(yīng)用于寵物臨床提供安全性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

Ala-Gln注射液，規(guī)格：10 mL∶2.0 g(批號(hào)：20220201)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)，于河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司中試生產(chǎn)。0.9%氯化鈉注射液(批號(hào)：220711A01，210305A02，221102A01)由黑龍江齊泰動(dòng)物保健品有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

24只健康比格犬(1～2歲)，雌雄各半，體重7～12 kg，其中12只(6只公犬，6只母犬)購自南京柴門生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2021-0008；其余12只(6只公犬，6只母犬)購自江蘇亞東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究院有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0009。犬飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間每天定時(shí)定量飼喂不添加任何藥物的試驗(yàn)犬維持飼料，自由飲水。動(dòng)物房內(nèi)設(shè)空調(diào)，房間溫度保持在25～28 ℃。

1.3 試驗(yàn)分組及處理

根據(jù)Ala-Gln注射液在醫(yī)學(xué)臨床推薦的每日最大給藥劑量(0.4 g/kg)下開展靶動(dòng)物犬的安全性研究。將24只成年健康比格犬隨機(jī)分為4組，每組6只，設(shè)1倍劑量組(0.4 g/kg)、3倍劑量組(1.2 g/kg)、5倍劑量組(2.0 g/kg)及空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉注射液)。Ala-Gln注射液用5倍體積的0.9%氯化鈉注射液稀釋并混勻后使用，空白對(duì)照組給予與5倍劑量組相同體積的0.9%氯化鈉注射液。靜脈滴注給藥，滴注速度為20～30滴/min，每日1次，連用14 d。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 一般臨床觀察

試驗(yàn)期間觀察受試犬的臨床表現(xiàn)，如飲食飲水、體溫、脈搏、呼吸、排尿排糞、精神狀態(tài)等，于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d稱量體重。

1.4.2 血液學(xué)檢查

所有受試犬分別于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d，使用EDTA-K2抗凝的一次性真空采血管采集抗凝血進(jìn)行血液生理指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.3 血液生化檢查

所有受試犬分別于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d，使用促凝的一次性真空采血管采血并分離血清，進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.4 尿液檢查

所有受試犬分別于給藥前、給藥7 d和14 d、停藥后6 d，收集中段尿液，進(jìn)行尿常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.5 組織病理學(xué)檢查

于停藥后1 d解剖5倍劑量組和空白對(duì)照組的半數(shù)犬只，停藥后7 d解剖5倍劑量組和空白對(duì)照組的剩余犬，并進(jìn)行系統(tǒng)的剖檢學(xué)檢查，對(duì)心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺等器官稱重，計(jì)算臟器指數(shù)；另取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胰腺、胃、腸等組織，置于10%的福爾馬林溶液固定，制作組織切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用GraphPad軟件進(jìn)行Two-way Anova Tukey分析，數(shù)值用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般臨床表現(xiàn)

試驗(yàn)期間，所有受試犬均無死亡。第1天給藥時(shí)，5倍劑量組中2只犬在輸注30 min內(nèi)出現(xiàn)寒顫，發(fā)現(xiàn)后立即關(guān)停輸液器，約15 min左右恢復(fù)正常；犬休息30 min后，降低滴注速度以15滴/min的滴速繼續(xù)輸注，未再出現(xiàn)該情況。該劑量組其余犬及其他劑量組犬只并未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。試驗(yàn)期間，所有犬精神狀態(tài)良好，攝食、飲水、排尿、排便均正常，被毛光亮，口、眼、鼻、耳均未見異常分泌物，呼吸頻率正常，體溫、脈搏均在正常范圍內(nèi)。各試驗(yàn)組犬的體重變化見表1，結(jié)果顯示，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)比后體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。

表1 安全性試驗(yàn)犬的體重變化 kg

2.2 血液學(xué)檢查

血液生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表2，各項(xiàng)指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)波動(dòng)。為考察波動(dòng)是否與給藥劑量和給藥時(shí)間相關(guān)，對(duì)數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行了顯著性分析。結(jié)果顯示，1倍和5倍劑量組的紅細(xì)胞分布密度標(biāo)準(zhǔn)差均值在給藥前顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，此差異為不同組間的犬在給藥前的個(gè)別指標(biāo)差異，非用藥所致，不具有臨床意義。

表2 靜脈滴注Ala-Gln注射液對(duì)犬血液生理指標(biāo)的影響

2.3 血液生化檢查

血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表3，各項(xiàng)指標(biāo)均在參考范圍內(nèi)波動(dòng)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，停藥6 d時(shí)，3倍和5倍劑量組天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而在輸液期未出現(xiàn)此差異，且指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，說明與用藥無關(guān)。

表3 靜脈滴注Ala-Gln注射液對(duì)犬血液生化指標(biāo)的影響

2.4 尿液檢查

尿常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，受試犬的尿膽原、尿蛋白、酮體、膽紅素、葡萄糖均呈陰性，尿液pH值和尿比重均在正常范圍內(nèi)。在給藥7 d時(shí)，3倍劑量組的pH值與1倍劑量組之間存在顯著差異(P<0.05)，但與空白對(duì)照組相比無明顯差異(P>0.05)，且所有犬pH值均在正常范圍內(nèi)，可見這一明顯變化未達(dá)到病理程度，不具臨床意義。

表4 靜脈滴注Ala-Gln注射液對(duì)犬尿常規(guī)指標(biāo)的影響

2.5 臟器指數(shù)

剖檢后的臟器指數(shù)結(jié)果見表5，5倍劑量組與空白對(duì)照組相比各臟器指數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，說明靶動(dòng)物犬按5倍劑量(2.0 g/kg)輸注Ala-Gln注射液，1次/d，連用14 d對(duì)內(nèi)臟器官無影響。

表5 臟器指數(shù) %

2.6 病理學(xué)變化

解剖空白對(duì)照組和5倍劑量組的犬只時(shí)，均未見明顯的由眼病理變化。心肌、心室內(nèi)膜和瓣膜無異常；肝臟呈暗紅色，質(zhì)地軟脆，表面和切面無出血、充血、淤血；脾臟色澤暗紅，質(zhì)地軟而脆，包膜表面光滑，切開脾臟后無充血、淤血、結(jié)節(jié)或腫物形成；肺表面呈淡粉色，質(zhì)柔軟光滑；雙腎大小正常，剝離包膜后，觀察與腎實(shí)質(zhì)無粘連；胰腺細(xì)、長，色澤淡白，質(zhì)地柔軟；胃黏膜顏色正常，無出血、損傷和潰瘍，胃內(nèi)容物無異常；十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸的腸系膜及其淋巴結(jié)均無異常，腸壁黏膜無脫落、出血。組織病理學(xué)檢查結(jié)果見圖1、圖2。由圖可知，5倍劑量組與空白對(duì)照組的內(nèi)臟器官均未有組織病理學(xué)變化。

圖1 犬心臟、肝臟、脾臟組織學(xué)變化(400×)

圖2 犬肺臟、腎臟、胰腺組織學(xué)變化(400×)

3 討論

寵物術(shù)后第1階段(48 h內(nèi))，液體治療和維護(hù)胃腸道功能非常重要。術(shù)后第2階段(3 d后)病患的代謝速率、氮排泄和氧氣消耗增加。從1階段過渡到2階段時(shí)，需要為動(dòng)物提供足夠的能量。然而，當(dāng)消化道手術(shù)或其他手術(shù)中消化道出血過多、嚴(yán)重便秘、或任何其他胃腸道阻塞、或嘔吐嚴(yán)重時(shí)，靜脈輸注腸外補(bǔ)充營養(yǎng)更為重要[9]。將Ala-Gln注射液引入寵物臨床，對(duì)于加快寵物術(shù)后恢復(fù)，降低死亡率，縮短住院時(shí)間有重要意義[10]。安全是藥物應(yīng)用的前提，因此本試驗(yàn)以犬為靶動(dòng)物，考察了其靜脈滴注Ala-Gln注射液的安全性。

Ala-Gln毒性極低，安全性高。日本研究者發(fā)現(xiàn)，Ala-Gln以2 000 mg/kg體重的劑量灌胃給藥后，對(duì)SD大鼠沒有急性毒性；之后又對(duì)大鼠開展了13周的Ala-Gln亞慢性毒性研究，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，受試組大鼠的血液生理和生化指標(biāo)中AST、TC等顯著升高，但都在正常范圍內(nèi)，這些變化沒有顯示出劑量-反應(yīng)關(guān)系，無毒理學(xué)意義[11]。我國醫(yī)學(xué)臨床上已上市的多個(gè)同類產(chǎn)品說明書中指出：嚴(yán)重肝、腎功能不全者禁用本品，故在試驗(yàn)過程中著重觀察肝、腎功能相關(guān)指標(biāo)。與肝功能有關(guān)的指標(biāo)有：ALBⅡ、ALT、AST和ALP。除AST在停藥6 d時(shí)，3倍劑量組和5倍劑量組顯著低于空白對(duì)照組外，其余指標(biāo)的各劑量組與空白對(duì)照組相比均未發(fā)生顯著變化。而AST在輸液期未出現(xiàn)此差異，且其余指標(biāo)的各劑量組在停藥6 d時(shí)與給藥前相比不存在顯著差異，說明此差異與用藥無關(guān)。與腎有關(guān)的指標(biāo)有：CREA、UREA，結(jié)果顯示各劑量組組內(nèi)和組間對(duì)比，不存在顯著差異。觀察5倍劑量組犬的肝臟、腎臟組織切片也未發(fā)生顯著病理變化，提示Ala-Gln注射液以1倍(0.4 g/kg)至5倍劑量(2.0 g/kg)應(yīng)用于犬可能對(duì)其肝臟、腎臟無顯著影響。

有文獻(xiàn)指出，本品在輸注速度過快時(shí)會(huì)出現(xiàn)寒顫、惡心、嘔吐等不良癥狀[12]。周燕萍等[13]在胃腸道術(shù)后患者的應(yīng)用Ala-Gln期間觀察到，個(gè)別患者過快輸注Ala-Gln時(shí)，出現(xiàn)寒戰(zhàn)、惡心癥狀，減慢輸液速度后癥狀很快消失。本試驗(yàn)2只犬在輸注過程中出現(xiàn)寒顫，短暫休息后降低速度繼續(xù)輸注，犬恢復(fù)正常，并正常完成了14 d的給藥試驗(yàn)。2只犬體型相對(duì)較小(體重分別為6.62 kg和6.76 kg)，試驗(yàn)在冬天開展，推測(cè)寒顫可能與藥液溫度稍涼、輸注速度較快有關(guān)，建議在滴注過程中應(yīng)控制滴注速度并給予動(dòng)物額外的保暖，一旦出現(xiàn)寒顫，應(yīng)立即減慢輸液速度或停止輸液，以確保動(dòng)物輸液過程的安全和舒適度。