紅景天苷對(duì)血管生成及骨血管偶聯(lián)的影響

祁 琳,韓鑫羽,祁 璐,王 越,張 磊

目前,體育運(yùn)動(dòng)成為人們緩解壓力的主要方式,但隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不斷增加,運(yùn)動(dòng)傷的發(fā)生率也有升高趨勢(shì),嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練傷包括器官損傷、骨關(guān)節(jié)損傷、軟組織損傷三種類型,以骨關(guān)節(jié)損傷最為常見(jiàn)[1]。運(yùn)動(dòng)骨關(guān)節(jié)損傷多發(fā)生在膝關(guān)節(jié)、腰部、肩胛部和上肢[2]。骨組織血供豐富,血管生成和骨形成有相互偶聯(lián)作用,在骨形成過(guò)程中,新骨形成需要血管提供養(yǎng)分,舊骨的代謝產(chǎn)物也需要血管輸送至體外,所以骨重建與血管生成密切相關(guān)[3,4],因此關(guān)于骨代謝和骨再生的研究具有重要意義。藏藥紅景天為景天科多年生草本植物,具有滋補(bǔ)強(qiáng)身、理氣養(yǎng)血、補(bǔ)腎、扶正固本等多種功效。紅景天苷為紅景天的關(guān)鍵活性成分,已有研究表明,紅景天苷能促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)促進(jìn)血管生成和骨形成[5,6]。但關(guān)于紅景天苷在骨血管偶聯(lián)中作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究探討紅景天苷在骨血管偶聯(lián)中發(fā)揮的作用,以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 選取純度為99.9%的紅景天苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所);DMEM高糖培養(yǎng)液(美國(guó)GIBCO公司);ECM(美國(guó)Sciencell公司);胎牛血清FBS(蘭州民海生物科技公司);青鏈霉素混合液及胰蛋白酶(北京鼎國(guó)生物科技公司);DMSO(天潤(rùn)善達(dá)生物科技公司);EDTA、von Willebrand factor(vWF)抗體、Ⅰ型膠原酶及HEPES(美國(guó)Sigma公司);PE 標(biāo)記的 VEGFR2 流式抗體及Matrigel膠(美國(guó)BD 公司);MTS 細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(上海貝博生物科技公司);重組人內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 rhVEGF(美國(guó)R&D 公司);貝伐珠單抗注射液Avastin(瑞士Roche 公司);CD31(美國(guó)abcam公司);二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽DAB及SP通用試劑盒(北京中杉金橋生物公司)。主要儀器:酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司);IX71倒置式研究型顯微鏡(OLYMPUS公司);SW-CJ-1F醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰技術(shù)公司);FC 500 MCL/MPL流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼)。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人成骨樣細(xì)胞細(xì)胞系MG-63(美國(guó)ATCC公司產(chǎn)品,購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心);人臍靜脈融合細(xì)胞細(xì)胞系EA.hy926(為美國(guó)ATCC公司產(chǎn)品,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)典型培養(yǎng)物保藏中心);人臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞HUVEC提取自人臍帶。該研究經(jīng)武警特色醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) MG-63及EA.hy926細(xì)胞采用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 HUVEC的分離、培養(yǎng)與鑒定 (1)HUVEC 的分離、培養(yǎng):取出臍帶,PBS漂洗后將其放于平皿內(nèi),選取輸液器管插入臍靜脈后扎緊。將Ⅰ型膠原酶加入臍靜脈后夾緊,按壓臍靜脈使內(nèi)皮細(xì)胞脫落,收集入離心管中。向臍靜脈內(nèi)推注、抽吸PBS,洗脫內(nèi)皮細(xì)胞,轉(zhuǎn)移至上述離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)。(2)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞vWF的表達(dá):將HUVEC接種于24孔板中,用4%多聚甲醛溶液固定,加入0.1% Triton-100作用15 min,用PBS清洗,加入BSA 封閉30 min;加入vWF一抗,37 ℃孵育30 min,室溫孵育1 h,漂洗。加入FITC標(biāo)記的熒光二抗100 μl,室溫避光孵育30 min,清洗。熒光顯微鏡下觀測(cè)并拍照記錄。(3)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞VEGFR2 的表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC,將細(xì)胞懸液加入兩個(gè)無(wú)菌EP管內(nèi),離心棄上清,加入 FACS洗液;一管加入熒光標(biāo)記的抗體,另一管加入FACS 洗液作對(duì)照,避光孵育30 min。用FACS洗液清洗后離心棄上清,加入300 μl 的FACS洗液,用濾膜轉(zhuǎn)至流式管內(nèi),用流式細(xì)胞儀檢測(cè);使用FACS分析儀 Winmdi 程序分析。

1.3.3 收集MG-63條件培養(yǎng)液 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞,接種于6孔板中,24 h后,更換為含1% FBS高糖的DMEM培養(yǎng)液同步化;實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組、10 nmol/L紅景天苷預(yù)處理組、100 nmol/L 紅景天苷預(yù)處理組,每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔,加藥作用48 h后收上清,1500 r/min離心10 min,作為條件培養(yǎng)液備用。

1.3.4 MTS法檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞,接種于96孔板中,24 h后,更換為含1% FBS高糖的DMEM培養(yǎng)液同步化,加入條件培養(yǎng)液作用48 h。實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組、條件培養(yǎng)液對(duì)照組、10 nmol/L 紅景天苷組、100 nmol/L 紅景天苷組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。條件培養(yǎng)液作用結(jié)束前4 h避光加入100 μl的10% MTS,孵育4 h后,記錄酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)在492 nm的OD值。

1.3.5 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞,接種于Transwell小室下室內(nèi),同步化后藥物作用48 h。48 h后每孔保留150 μl上清液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml,以200 μl/室的量接種于Transwell小室上室內(nèi);從Transwell小室側(cè)面往下室內(nèi)加入450 μl含1.3% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液,使FBS濃度至1%,培養(yǎng)8 h;棄去上室殘留培養(yǎng)液,PBS漂洗后將上室置于4%中性甲醛內(nèi)固定15 min,PBS漂洗;伊紅染色3 min,PBS清洗,棉簽拭去上室細(xì)胞;將Transwell小室置于200倍顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù),記錄膜上、下、左、右、中間5個(gè)視野的細(xì)胞,取平均值。

1.3.6 Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的影響 將Matrigel膠加入預(yù)冷的96孔板內(nèi),輕柔晃動(dòng)96孔板,37 ℃孵育1 h;取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞,用無(wú)血清ECM培養(yǎng)液混懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105/ml,100 μl/孔加至鋪好Matrigel膠的96孔板中;對(duì)照組加入33 μl無(wú)血清的ECM培養(yǎng)液,其他組加入33 μl對(duì)應(yīng)條件的培養(yǎng)液,設(shè)2個(gè)復(fù)孔,CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h 后在100倍顯微鏡下拍照,每孔取5個(gè)視野,并記錄管腔長(zhǎng)度。

1.3.7 胎鼠跖骨血管生成試驗(yàn)評(píng)估紅景天苷對(duì)骨血管偶聯(lián)的影響 胎鼠跖骨的提取及培養(yǎng):選取孕期(E17.5d)的小鼠,注射2.5% Avertin(阿弗丁)0.012～0.018 ml/g腹腔內(nèi)注射麻醉,75%乙醇消毒;剖腹取出生前1 d(E17.5 d)的胎鼠,75%乙醇消毒;用顯微外科剪刀及鑷子剪開皮膚并分離四肢的3個(gè)跖骨,用含雙抗的PBS沖洗;用含10% FBS的α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d,用100 nmol/L的紅景天苷或重組的人VEGF(10 ng/ml)作用3 d,培養(yǎng)10 d。胎鼠跖骨的免疫組化染色:將跖骨在甲醛內(nèi)固定20 min,PBS漂洗;3% H2O2處理15 min,PBS漂洗;使用血清封閉液封閉20 min;4 ℃條件下,一抗孵育過(guò)夜,PBS漂洗;二抗孵育20 min,PBS漂洗;辣根酶標(biāo)記的鏈霉親和素過(guò)氧化物酶孵育30 min,PBS漂洗;DAB顯色,鏡下觀察顯色情況,蘇木精復(fù)染15～30 s,流水沖洗。

1.3.8 Avastin阻斷實(shí)驗(yàn) 除取紅景天苷作用最明顯的劑量組(100 nmol/L 紅景天苷)加上抗VEGF抗體Avastin和同種型IgG外,其他方法同上。

2 結(jié) 果

2.1 HUVEC細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定 光鏡觀察發(fā)現(xiàn),HUVEC細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),呈梭形鋪路石狀,邊界清晰,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,屬于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)(圖1A)。免疫熒光法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞vWF的表達(dá),基本所有細(xì)胞都表達(dá)vWF(圖1B)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HUVEC細(xì)胞VEGFR2為陽(yáng)性表達(dá)(圖1C),提取的細(xì)胞為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。

圖1 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定A.HUVEC細(xì)胞形態(tài)(×100光鏡觀察); B. 免疫熒光法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞中的vWF; C. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVEC表面VEGFR2 的表達(dá)。

2.2 對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響 由MTS結(jié)果可見(jiàn),與對(duì)照組相比,條件培養(yǎng)液組的HUVEC與EA.hy926細(xì)胞增殖活性顯著提高(P<0.01),與條件培養(yǎng)液組相比,10、100 nmol/L 紅景天苷的條件培養(yǎng)液組內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性顯著升高(P<0.01,表1)。為進(jìn)一步探究紅景天苷是否通過(guò)影響條件培養(yǎng)液中VEGF的表達(dá)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,采用Avastin與同種型IgG進(jìn)行阻斷實(shí)驗(yàn),MTS結(jié)果顯示,100 nmol/L 紅景天苷組條件培養(yǎng)液對(duì)HUVEC與EA.hy926細(xì)胞的促增殖作用能被Avastin部分阻斷(P<0.01,表2),而同種型IgG抗體無(wú)此作用。

表1 紅景天苷條件培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

表2 經(jīng)Avastin阻斷后紅景天苷條件培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 條件培養(yǎng)液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力及管腔形成能力的影響 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)評(píng)估條件培養(yǎng)液對(duì)HUVEC與EA.hy926細(xì)胞遷移能力的影響,Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估條件培養(yǎng)液對(duì)HUVEC細(xì)胞管腔形成能力的影響。結(jié)果可見(jiàn),與正常對(duì)照組相比,條件培養(yǎng)液組血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量及管腔長(zhǎng)度顯著增加(P<0.05),與條件培養(yǎng)液組相比,100 nmol/L 紅景天苷組血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量及管腔長(zhǎng)度顯著提高,經(jīng)Avastin阻斷后, 紅景天苷組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促遷移能力及促管腔形成能力顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表3),而同種型IgG 抗體無(wú)此作用。

表3 紅景天苷對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)量、管腔長(zhǎng)度的影響及經(jīng)Avastin阻斷后的對(duì)比

2.4 紅景天苷對(duì)胎鼠跖骨血管生成能力的影響 為進(jìn)一步研究紅景天苷在骨-血管形成偶聯(lián)中的作用,提取孕鼠的胎鼠跖骨進(jìn)行培養(yǎng),與對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽面積[(0.14±0.02)mm2]相比,紅景天苷組[(0.28±0.01)mm2]和VGEF組[(0.47±0.02)mm2]的出芽面積明顯增大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其中以VGEF組出芽面積最大。但經(jīng)Avastin阻斷后的出芽面積[(0.17±0.02)mm2]顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而同型IgG抗體組[(0.26±0.03)mm2]無(wú)此作用。

3 討 論

骨組織內(nèi)豐富的血管能夠?yàn)楣堑陌l(fā)育、修復(fù)及再生提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。有研究發(fā)現(xiàn),H型血管廣泛分布于骨內(nèi)膜和干骺端附近的骨小梁表面,在受傷初期,H型血管集中匯集于受損部位,表明骨形成和血管生成相偶聯(lián)[7,8]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上,以內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC、EA.hy926與人成骨樣細(xì)胞MG-63共同培養(yǎng)為研究模型,探究紅景天苷對(duì)血管生成及骨血管偶聯(lián)的影響。

血管生成是指在原血管的基礎(chǔ)上通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的出芽、增殖與遷移形成新血管的過(guò)程。目前,在細(xì)胞模型上通常通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的增殖、遷移及管腔的形成能力來(lái)評(píng)估藥物的促血管生成能力[9]。本研究分別采用了MTS實(shí)驗(yàn)、Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)及Matrigel管腔形成實(shí)驗(yàn),對(duì)紅景天苷作用后MG-63細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管腔形成能力的影響進(jìn)行評(píng)估。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),條件培養(yǎng)液對(duì)照組可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成,與條件培養(yǎng)液對(duì)照組相比,紅景天苷作用后的MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)液能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管腔形成。本研究通過(guò)胎鼠跖骨血管生成實(shí)驗(yàn)探究紅景天苷對(duì)胎鼠跖骨血管生成能力的影響,結(jié)果顯示,紅景天苷和VGEF能促進(jìn)胎鼠跖骨的血管生成,表明紅景天苷和VGEF具有促骨血管偶聯(lián)能力,這與文獻(xiàn)[10]的研究結(jié)果一致。

VEGF是調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的生長(zhǎng)因子,能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移,在誘導(dǎo)血管生成和側(cè)支血管形成方面發(fā)揮重要作用[11-13]。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),VEGFA能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡及血管生成,抑制VEGFA后能顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖及血管新生[14]。孫春燕等[15]研究表明,芩梔豬膽方通過(guò)上調(diào)大鼠海馬組織中VEGFA、VEGFR2的表達(dá)促進(jìn)血管新生,治療血管性癡呆大鼠模型。另有研究發(fā)現(xiàn),紅景天苷可通過(guò)上調(diào)心肌組織中VEGF等因子的表達(dá)水平,緩解心肌缺血小鼠的心肌重構(gòu)[16]。因此,我們推測(cè)紅景天苷可能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌VEGF間接促進(jìn)血管內(nèi)皮的血管生成。本研究結(jié)果顯示,Avastin阻斷后能顯著減弱100 nmol/L 紅景天苷組條件培養(yǎng)液對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖、促遷移及促管腔形成能力,表明紅景天苷可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌VEGF間接促進(jìn)血管生成。另外,Avastin阻斷后胎鼠跖骨的血管生成能力也顯著下降,證明紅景天苷通過(guò)上調(diào)胎鼠跖骨組織中VEGF的表達(dá),對(duì)促進(jìn)骨血管偶聯(lián)有作用。有研究表明,VEGF的上游調(diào)控基因低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是骨骼修復(fù)過(guò)程中偶聯(lián)成骨和血管生成的一個(gè)關(guān)鍵因子[17], 紅景天苷能夠降低HIF-1α的降解,顯著上調(diào)HIF-1α的蛋白表達(dá)水平[18]。因此,筆者推測(cè)紅景天苷與HIF-1α/VEGF信號(hào)通路促進(jìn)骨血管偶聯(lián)有一定相關(guān)性。

本研究結(jié)果表明,紅景天苷是一個(gè)較好的促血管生成藥物單體,能促進(jìn)骨血管偶聯(lián)。但本研究?jī)H從體外模型對(duì)紅景天苷促血管生成與促骨血管偶聯(lián)能力進(jìn)行驗(yàn)證,下一步將對(duì)紅景天苷的體內(nèi)模型及臨床驗(yàn)證進(jìn)行研究。