配體對白蛋白穩(wěn)定性影響的研究進展

楊列清 尹榮超 楊磊 井金榮 房海濤 陳加泉 劉維鑫

（山東泰邦生物制品有限公司, 山東 泰安 271000）

人血白蛋白是血漿中重要的運載蛋白，具有重要的生理功能，它的3 個結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似，每個結(jié)構(gòu)域又分為A和B 兩個亞結(jié)構(gòu)域[1]。白蛋白有許多重要的分子或藥物的結(jié)合位點，包括SudlowⅠ和SudlowⅡ位點、脂肪酸位點（至少7 個，分別為FA1～FA7）、Cys-34 位點、N 端Asp-Ala-His金屬離子位點[2,3]，見圖1。

在白蛋白自身熱穩(wěn)定性方面，它的3 個結(jié)構(gòu)域熱穩(wěn)定性存在差異。根據(jù)Kragh-Hansen 等[4]的研究，結(jié)構(gòu)域Ⅰ是熱穩(wěn)定性最差的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)Watanabe 等[5]的研究，Trp-214是影響結(jié)構(gòu)域Ⅱ熱穩(wěn)定性的重要的殘基，它將白蛋白心形分子的兩半結(jié)合在一起。在白蛋白自身化學(xué)穩(wěn)定性方面，鹽酸胍引起的白蛋白變性最少可分為三步，而弱變性劑尿素使得變性過程的中間體更加多樣[6]。除自身的抗變性能力外，白蛋白自身的化學(xué)穩(wěn)定性還體現(xiàn)在抗氧化性上，在它的585 個氨基酸殘基中，Cys-34 的貢獻最大，其次為Met殘基，Trp、Arg、Tyr等殘基也有助于其自身的抗氧化性[7-8]。

應(yīng)對白蛋白制備與儲存過程中復(fù)雜的溫度、光照等條件，僅靠白蛋白自身分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性還遠遠不夠。要進一步提升白蛋白的穩(wěn)定性，可以在生產(chǎn)過程中對白蛋白多聚體含量進行嚴(yán)格地監(jiān)測[9]，可以通過色譜方法降低多聚體的含量[10]，可以提升白蛋白儲存的條件[11]，也可以選擇能夠提升穩(wěn)定性的配體。辛酸鈉（sodium octanoate,Oct）和N-乙酰色氨酸（N-acetyl-L-tryptophan,N-AcTrp）分別作為脂肪酸類和氨基酸類的配體，從低溫乙醇工藝發(fā)展之初便得到了廣泛應(yīng)用。Cohn 6法采用N-AcTrp，K/N法采用Oct，郝氏法則選擇二者聯(lián)用。目前，國內(nèi)外許多白蛋白商業(yè)制劑仍采用這兩種配體或二者組合來提升白蛋白制備過程中的穩(wěn)定性。本文將從配體結(jié)合角度論述其對白蛋白穩(wěn)定性的影響。

1 配體對白蛋白熱穩(wěn)定性的影響

1.1 脂肪酸類配體對白蛋白熱穩(wěn)定性的影響

目前，脂肪酸類配體是白蛋白熱穩(wěn)定性研究最多的配體。不同脂肪酸的結(jié)合位點和結(jié)合能力也存在差異，如FA4對長鏈脂肪酸（long-chain fatty acid,LCFA）具有高親和力，而FA1對LCFA的親和力較低[12]。以變性溫度Td來衡量白蛋白的熱穩(wěn)定性，在相同的條件下，脫脂的白蛋白Td要低于未脫脂白蛋白的Td。脂肪酸結(jié)合白蛋白后，白蛋白的α結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，如圖2。白蛋白與高親和力的LCFA 結(jié)合，直至所有位點都被飽和，它的熱解折疊是1個雙相過程。第1個過程Td與低飽和度LCFA的白蛋白變性相關(guān)，Td隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而降低，這一點與脫脂白蛋白單體的Td相似；而第2個過程的Td則與飽和LCFA白蛋白的濃度無關(guān)，而隨著脂肪酸飽和程度的增加，白蛋白的聚合程度也會降低[13]。

圖2 人血白蛋白與不飽和脂肪酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)Figure 2 Structure of human serum albumin in complex with unsaturated fatty acids

在應(yīng)用方面，Oct在脂肪酸類配體中的應(yīng)用最廣泛。一方面，鏈長大于7 個碳原子的脂肪酸對白蛋白熱穩(wěn)定性具有明顯的提升效果，所以，Oct的效果優(yōu)于己酸和庚酸，并且Oct 在水中溶解度高[14]。另一方面，Oct 結(jié)合在SudlowⅡ位點，占據(jù)了亞結(jié)構(gòu)域ⅢA中最大的內(nèi)部空腔，可以增強白蛋白構(gòu)象的穩(wěn)定性[14]。而類似結(jié)構(gòu)的正辛基配體，可以偶聯(lián)到瓊脂糖微球骨架上，當(dāng)作色譜純化白蛋白的介質(zhì)[11,15-16]。

1.2 氨基酸類配體對白蛋白熱穩(wěn)定性的影響

一般來說，氨基酸類配體對熱穩(wěn)定性的提升效果不如脂肪酸類配體。作為商業(yè)白蛋白制劑巴氏滅活工藝（60℃，10h）使用的配體，Oct和N-AcTrp可競爭性地與SudlowⅡ位點結(jié)合。研究證明Oct+N-AcTrp的對提升白蛋白熱穩(wěn)定性的效果最好，Oct的效果次之，只加N-AcTrp的效果再次之，而L-色氨酸（L-tryptophan,L-Trp）和N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,N-AcCys）對白蛋白熱穩(wěn)定性的基本無提升能力[14]。

1.3 其他配體對白蛋白熱穩(wěn)定性的影響

表1總結(jié)了近些年研究的一些能提升白蛋白熱穩(wěn)定性的其他類配體，其中有些配體是抗淀粉樣纖維化的藥物，如反式白藜蘆醇、牛磺酸、左旋多巴。纖維化的白蛋白受熱更容易發(fā)生聚集，破壞白蛋白的熱穩(wěn)定性，這些藥物（或配體）通過抑制纖維化來提升白蛋白的熱穩(wěn)定性，但是它們在提升熱穩(wěn)定性的領(lǐng)域還未得到廣泛應(yīng)用。

表1 藥物與人血白蛋白作用配位點、作用機制表Table 1 Binding sites and mechanism of drugs on human serum albumin

2 配體對白蛋白化學(xué)穩(wěn)定性的影響

2.1 脂肪酸類配體對白蛋白抗變性能力的影響

與脂肪酸類配體結(jié)合后，白蛋白對鹽酸胍和尿素的抗變性能力均會增強。鹽酸胍和尿素誘導(dǎo)的白蛋白變性存在5 種中間過渡狀態(tài)（圖3），并在過量誘導(dǎo)后，白蛋白達到不可逆的解折疊狀態(tài)[23-25]。對于鹽酸胍和尿素誘導(dǎo)的變性，脫脂白蛋白結(jié)構(gòu)域的展開順序分別為Ⅲ→Ⅱ→Ⅰ和Ⅰ→Ⅱ→Ⅱ。同種脂肪酸結(jié)合白蛋白后，抗鹽酸胍和尿素誘導(dǎo)的變性能力均會增強，尤其對弱變性劑尿素的效果更佳，白蛋白在高濃度尿素水平下仍能保持天然狀態(tài)[23-25]，其抗變性機制見圖3和4。

圖3 鹽酸胍和尿素誘導(dǎo)白蛋白變性時產(chǎn)生的中間狀態(tài)Figure 3 The intermediate produced during the denaturation of albumin induced by guanidine hydrochloride and urea.

圖4 脂肪酸對白蛋白抗變性能力的提升Figure 4 Improvement of anti-denaturation ability of albumin by fatty acids

2.2 其他類配體對白蛋白抗變性能力的影響

氨基酸類配體對白蛋白抗變性能力的研究較少。布洛芬、異丙酚對尿素誘導(dǎo)的變性具有良好的保護效果，二者同時與白蛋白結(jié)合會使結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ更加緊湊，由此產(chǎn)生協(xié)同抗變性效果。此外，酮洛芬[26]、地西泮[26]等藥物對尿素誘導(dǎo)的變性也具有良好的保護效果。有趣的是，低濃度的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate,SDS）對尿素誘導(dǎo)的變性也具有保護效果，但高濃度的SDS 則會使白蛋白變性失活[27]。

2.3 氨基酸類配體對白蛋白抗氧化性的影響

對于提升白蛋白抗氧化性，幾種氨基酸類配體或組合的效果排序如下：Oct + N-AcTrp＞N-AcTrp＞L-Trp＞Oct?？梢钥闯?，Oct 和N-AcTrp 同時存在時白蛋白的抗氧化性最強，但這主要是因為N-AcTrp 提供的抗氧化性。雖然脂肪酸類配體也具有一定的抗氧化效果，但Oct作為飽和脂肪酸鹽，其抗氧化效果更差。而利用色氨酸與白蛋白結(jié)合的特性，與色氨酸結(jié)構(gòu)類似的色胺和N-AcTrp 均可用作色譜純化白蛋白的介質(zhì)[16,28]。

2.3.1 半胱氨酸化人血白蛋白對抗氧化性的影響

半胱酸氨酸化人血白蛋白（Cys-Cys-34-human serum albumin,Cys-Cys-34-HSA）即Cys-34上共價結(jié)合另一分子的半胱氨酸，形成了新的二硫鍵。早期研究證明，保護Cys-34上的自由巰基可以抑制巰基/二硫鍵反應(yīng)，防止白蛋白聚合，提升白蛋白的熱穩(wěn)定性[29]。近些年研究證明，Cys-Cys-34-HSA雖然熱穩(wěn)定性得到了提升，但是抗氧化性卻是降低的。Cys-34的半胱氨酸化能誘導(dǎo)SudlowⅠ和Ⅱ位點的構(gòu)象發(fā)生變化，這種變化可能導(dǎo)致兩個位點的結(jié)合能力下降，甚至有可能影響Oct 和N-AcTrp 與SudlowⅡ位點的結(jié)合[30]。該研究還表明，商業(yè)白蛋白制劑的抗氧化性和配體結(jié)合活性與Cys-Cys-34-HSA比例呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.3.2 N-乙酰-L-甲硫氨酸和N-AcTrp 的抗氧化性與抗光氧化性

在抗氧化性方面，加入N-AcTrp 或N-乙酰-L-甲硫氨酸（N-acetyl-L-methionine, N-AcMet）后，氯胺T 氧化白蛋白的程度均會削弱，且N-AcMet 的抗氧化性效果優(yōu)于NAcTrp[31]。在抗光氧化性方面，以氧化后羰基含量為指標(biāo)，40℃光照4周后，羰基含量從低到高依次為重組人血白蛋白（recombinant human serum albumin,rHSA）+N-AcMet、單獨的rHSA、rHSA+N-AcTrp，這說明N-AcTrp 的加入反而會促進白蛋白的光氧化降解，會顯著降低白蛋白的抗光氧化性[32]。

2.3.3 N-AcTrp和N-AcMet的對比

N-AcTrp對提升白蛋白抗氧化性效果明顯，但是N-Ac-Trp自身也很容易被光照氧化降解，所形成的產(chǎn)物可以氧化白蛋白，且N-AcTrp 的體內(nèi)代謝產(chǎn)物3-羥基犬尿氨酸也具有神經(jīng)毒性。N-AcMet 結(jié)合在Suldow Ⅰ位點的入口處，且結(jié)合能力較弱，這使得N-AcMet的側(cè)鏈暴露在溶劑中，所以N-AcMet 更容易被活性氧（reactive oxygen species, ROS）氧化[33]。并且，相比于N-AcTrp，N-AcMet 能被更多種類的ROS氧化，加之N-AcMet安全無毒，所以N-AcMet提升穩(wěn)定性的效果更佳。

3 結(jié)論

在人血白蛋白制備過程中，選擇合適的配體提高白蛋白的穩(wěn)定性十分必要。常見的脂肪酸類配體Oct 主要用來提升白蛋白的熱穩(wěn)定性，常見的氨基酸類配體N-AcTrp 主要用來提升白蛋白的抗氧化性，二者聯(lián)用會進一步提升白蛋白的熱穩(wěn)定性、抗氧化性和抗變性。而相較于傳統(tǒng)配體N-AcTrp，最新研究的配體N-AcMet 還具有獨特的抗光氧化性。

除了指導(dǎo)商業(yè)白蛋白制劑選擇合適的配體外，配體對白蛋白穩(wěn)定性的研究對含有白蛋白的新型制劑選擇提升穩(wěn)定性的配體也具有重要的參考價值（如rHSA[32,34]、Abraxane[13]、Albiguide[13]）。其次，它也可以作為蛋白淀粉樣纖維化疾病的體外研究模型，對相關(guān)藥物的篩選起到重要作用[18,21-22]。此外，利用配體與白蛋白結(jié)合的穩(wěn)定性，也可以反向應(yīng)用于白蛋白的色譜純化[15-16,28]。

值得注意的是，配體的加入會占據(jù)白蛋白的結(jié)合位點，這可能會影響白蛋白的運載能力，從而影響其藥用效果[17]。對于白蛋白化學(xué)穩(wěn)定性，除了本文提及的抗變性和抗氧化性，還包含抗翻譯后修飾性（抗N端截短、抗C端截短、抗糖化等）[35]，而面對這些翻譯后修飾，還缺乏相關(guān)的配體研究。當(dāng)然，這些問題也可從非配體結(jié)合的化合物的角度去考慮，如添加糖類化合物來提升白蛋白的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性[36]?？傊?，研究配體對白蛋白穩(wěn)定性的影響具有十分重要的意義，相信未來還會發(fā)現(xiàn)其他更重要的潛在價值。